Induktion der zellulären Differenzierung und Einzelzell - Bildgebung von Vibrio parahaemolyticus Schwimmer und Swarmer Cells

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, die zelluläre Differenzierung des Bakteriums Vibrio parahaemolyticus und die Bildung einer Population differenzierter Schwarmzellen zu induzieren, die für die Einzelzellanalyse mittels Fluoreszenzmikroskopie leicht zugänglich sind. Diese Methode wird den Wissenschaftlern helfen zu verstehen, wie Bakterien die intrazelluläre Organisation während der zellulären Differenzierung und Morphogenese regulieren. Da die Bildgebung von Zellen innerhalb von Bakteriengemeinschaften eine Herausforderung darstellen kann, besteht der Hauptvorteil dieser Technik darin, dass sie eine Population differenzierter Schwarmzellen erzeugt, die in einer einzigen Zellschicht existieren, die für die Einzelzellmikroskopie leicht zugänglich ist.

Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf ein besseres Verständnis dessen, wie Bakterien Veränderungen im Zellzyklus, in der Zellmorphologie und in der intrazellulären Organisation während der zellulären Differenzierung regulieren. Die Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da eine zuverlässige Induktion der zellulären Differenzierung und die Bildung von Zellen, die für die Einzelzellanalyse zur Verfügung stehen, nur schwer zu erreichen sind. Um die Agarlösung für die Herstellung von Schwarmplatten vorzubereiten, suspendieren Sie vier Gramm Herzinfusion oder H.I.agar-Pulver und 100 Milliliter doppelt destilliertes Wasser.

Kochen Sie die H.I.Agar-Lösung vorsichtig in der Mikrowelle und schütteln Sie die Flasche von Zeit zu Zeit, bis sich das Pulver aufgelöst hat. Die Agarlösung 20 Minuten lang bei 121 Grad Celsius autoklavieren, die Agarlösung unter ständigem Rühren auf 60 t0 65 Grad Celsius abkühlen. Der nächste Schritt ist der Umgang mit 2, 2'Bipyridyl, das hochgiftig ist, so dass Handschuhe und eine Schutzbrille getragen werden müssen.

2,2'Bipyridyl werden bis zu einer Endkonzentration von 50 μmolar zugegeben. Fügen Sie Calciumchlorid bis zu einer Endkonzentration von vier Millamolar hinzu. Eine kleine Menge V.parahaemolyticus-Zellen vom Rand einer einzelnen Kolonie in 5 Milliliter LB-Brühe impfen.

Inkubieren Sie die Kultur bei 37 Grad Celsius in einem Shaker-Inkubator, bis sie eine optische Dichte von 0,8 Nanometern bei 600 Nanometern erreicht. Dies dauert in der Regel etwa zwei bis drei Stunden. Während die Zellkultur wächst, pipettieren Sie 30 bis 35 Milliliter der endgültigen H.I.agar-Lösung in eine runde 150-Millimeter-Petrischale und lassen Sie den Agar erstarren.

Trocknen Sie die Agarplatte unmittelbar vor dem Spotten der Zellkultur aufrecht bei geöffnetem Deckel für mindestens 10 Minuten oder bis alle Flüssigkeitsrückstände verschwunden sind, aber nicht länger. Platzieren Sie einen Mikroliter Zellkultur in der Mitte der H.I.agar-Schwarmplatte und lassen Sie den Fleck trocknen. Verschließen Sie die Platte mit durchsichtigem Plastikband und achten Sie darauf, dass sich keine Luftblasen bilden und Falten am Klebeband entstehen.

Inkubieren Sie die Platte über Nacht bei 24 Grad Celsius. Dies führt zur Bildung einer V.Parahaemolyticus-Schwarmkolonie mit Schwarmfackeln, die sich vom Zentrum der Kolonie aus erstrecken, wie in diesem Zeitraffer-Videoclip zu sehen ist. Der erste Schritt in diesem Verfahren besteht darin, Agarose-Objektträger für die Mikroskopie vorzubereiten.

Fügen Sie ein Gramm Agarose zu 100 Millilitern einer 20%PBS- und einer 10%LB-Bouillonlösung hinzu. Kochen Sie die Lösung vorsichtig in der Mikrowelle, um die Agarose aufzulösen, und lassen Sie sie dann unter Rühren mit einem Magnetrührstab auf 65 bis 70 Grad Celsius abkühlen. Legen Sie einen sauberen Objektträger auf einen perfekt ebenen Bereich einer Arbeitsbank.

Befestigen Sie den Objektträger auf der Bank, indem Sie beide Enden des Objektträgers mit zwei Lagen Allzweck-Laborbeschriftungsband abdecken. Der Abstand zwischen den beiden Klebebandstücken sollte etwa drei Zentimeter betragen. Pipettieren Sie etwa 250 Mikroliter der zuvor vorbereiteten Agaroselösung auf die unbedeckte Glasoberfläche.

Legen Sie einen zweiten Objektträger in der gleichen Ausrichtung wie den unteren Objektträger darauf und drücken Sie ihn leicht nach unten, damit die restliche Agarose zu den Seiten abfließen kann. Lass die Agarose ein bis zwei Minuten fest werden. Schneiden Sie mit einem Skalpell alle Agarosereste ab, die an den Seiten des Objektträgers befestigt sind.

Wenn die Agarose erstarrt ist, ziehen Sie den oberen Glasschieber langsam in einer horizontalen Bewegung vom unteren ab. Entfernen Sie langsam das Klebeband von den Enden des Objektträgers. Der Agarose-Objektträger sollte so schnell wie möglich verwendet werden, da er dann langsam zu trocknen beginnt.

Unmittelbar vor dem Transfer der Schwarmzellen auf den Objektträger schneiden Sie mit einem Skalpell das Plastikband von der zuvor vorbereiteten Schwarmplatte ab. Bei der Exzision des Schwarmagars ist es wichtig, den Schnitt von außen nach innen in die Schwarmkolonie zu richten, um eine Kontamination der Schwarmfackeln mit Zellen zu vermeiden, die aus der Mitte der Kolonie stammen. Schneide mit einem frischen Skalpell ein drei mal 10 Millimeter großes Stück Schwarmagar aus dem äußersten Rand einer Schwarmkolonie heraus und achte darauf, dass die Schnitte von der Außenseite der Schwarmvölkerkante nach innen gerichtet sind.

Übertragen Sie das Stück Schwarmagar mit den Zellen zum Agarose-Pad auf den Agarose-Objektträger, um die Schwarmzellen auf das Agarose-Pad zu prägen. Nachdem Sie etwa 30 Sekunden gewartet haben, nehmen Sie das Agarstück vorsichtig vom Agarose-Pad. Legen Sie ein Deckglas auf das Agarose-Pad, auf dem die Zellen geprägt wurden.

Nun sind die Zellen bereit für die Fluoreszenzmikroskopie. Stereomikroskopische Aufnahmen einer V.parahaemolyticus-Schwarmkolonie in zunehmender Vergrößerung zeigen Schwarmflares, die sich von der Peripherie der Schwarmkolonie aus erstrecken. Die Zellen in den Flares sind nur in Mono- oder Doppelschichten gruppiert, während die Zellen in der Mitte der Schwarmkolonie in mehreren Schichten gestapelt sind.

Die Mikroskopie des DIC zeigte, dass die Flares nur aus einer vollständig differenzierten Population von Schwarmzellen bestehen, während Zellen aus der Mitte der Schwarmkolonie deutlich kürzer sind und wahrscheinlich eine Mischung aus Schwimmer- und Schwarmzellen darstellen. Als Beweis für das Prinzip wurden DIC- und Fluoreszenzmikroskopie-Bildgebung an Wildtyp-Schwimmer- und Schwarmzellen von V. Parahaemolyticus durchgeführt, die ektopisch ein essentielles Chemotaxis-Protein, YFP-CheW, exprimierten. In Schwimmerzellen lokalisiert YFP-CheW unipolar und bipolar, in Schwarmzellen ist YFP-CheW jedoch immer bipolar lokalisiert und bildet auch Cluster, die zufällig entlang der Zelllänge positioniert sind.

Veränderungen im Lokalisationsmuster von YFP-CheW während der Differenzierung von Schwimmer- zu Schwarmzellen wurden auch durch die Darstellung der Foki-Verteilung und die demographische Analyse von Fluoreszenzintensitätsprofilen gezeigt. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der mikrobiellen Zellbiologie, um zu erforschen, wie das Bakterium Vibrio parahaemolyticus seine innere Organisation während seiner unterschiedlichen differenzierten Zustände von Schwimmer- und Schwarmzellen reguliert. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die zelluläre Differenzierung des Bakteriums Vibrio parahaemolyticus induziert und wie man eine Population differenzierter Schwarmzellen für die Einzelzellanalyse durch Fluoreszenzmikroskopie vorbereitet.

Vergessen Sie nicht, dass Vibrio parahaemolyticus ein humanpathogener Erreger ist und dass geeignete Verfahren und Vorschriften für den Umgang mit BSL 2-Erregern in Ihrer Region angewendet werden sollten.