Name: In-Vitro- Assays zur Beurteilung der Blut-Hirn-Schranke Mesh-artigen Gefäßbildung und -störung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: Lernen Sie In-vitro-Assays zur Untersuchung der Blut-Hirn-Schranke mittels Zellkulturtechniken. Diese Methode ermöglicht die Analyse von Barrieredysfunktionen und die Entwicklung therapeutischer Ansätze für neurodegenerative Erkrankungen.

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Leon Tai wird von der University of Illinois Chicago Start-up-Fonds finanziert.

Alle Experimente folgen der University of Illinois, Chicago Institutional Animal Care und Use Committee Protokolle. 1. Allgemeine Vorbereitung HINWEIS: Die mikrovaskuläre Endothelzelllinie des Gehirns (hCMEC / D3) ist eine weitgehend charakterisierte immortalisierte menschliche BEC-Linie 14 , 15 , 16 , 18 , 19 . Kultur die hCMEC / D3-Zellen auf Gewebekulturkolben, die mit Kollagen beschichtet sind Typ I (Kalbshaut, 1:20 Verdünnung von 0,1% iger Lösung in Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS) mit Ca 2+ und Mg 2+ ) im basalen Endothelwachstum Basal Medium (EBM-2), enthaltend 2-5% fötales Rinderserum (FBS), 10% Ascorbinsäure, 10% Gentamicinsulfat, 25% Hydrocortison und 1/4 des Gesamtvolumens der zugeführten Wachstumsfaktorergänzungen pro 500 ml Medium [ Vaskuläres Endothel gr(VFF), epidermaler Wachstumsfaktor (EGF), Insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor 1 (IGF-1) und menschlicher basischer fibroblastischer Wachstumsfaktor (bFGF), siehe Tabelle der Materialien ]. HINWEIS: EBM-2-Medium mit FBS und Wachstumsfaktoren wird als &quot;EBM-2 komplett&quot; bezeichnet. EBM-2 ohne FBS und Ergänzungen wird als &quot;EBM-2 basal&quot; bezeichnet. Bei voller Konfluenz sind die hCMEC / D3-Zellen ~ 1 x 10 5 Zellen / cm 2 . <ol><li> Durchführen der hCMEC / D3-Zellen im Verhältnis 1: 5 durch erstes Inkubieren mit HBSS für 3 min ohne Ca 2+ und Mg 2+, gefolgt von einer Ablösung mit 5 ml Trypsin / EDTA (0,25%) für 5 min. Neutralisieren des Trypsins mit EBM-2 vollständig (1: 1 Neutralisation) und zentrifugieren bei 290 xg für 5 min bei 4 ° C; Den Überstand verwerfen. Halten Sie das Pellet in EBM-2 vollständig und re-Platte im Verhältnis 1: 5. </li><li> Kultur die primären menschlichen Perizyten und Astrozyten nach dem Protokoll des Lieferanten [ Table of Materials ]. KulturE die pericytes in pericyte basal medium mit FBS und pericyte wachstum ergänzung. </li><li> Kultur die menschlichen Astrozyten in Astrozyten Medium mit Astrozyten Wachstumsfaktoren. Kultur sowohl die Perizyten als auch die Astrozyten in Gewebekulturkolben, die mit 3 ml Poly-L-lysin (PLL) für die Zelladhäsion beschichtet sind und die Zellen zwischen den Passagen 2 und 5 verwenden. </li><li> Euthanize 7 Mäuse und entfernen Sie die Hirnstämme und Cerebella mit Pinzette; Lösen Sie die Hirnhaut durch sorgfältiges Rollen der Gehirne auf Gaze. Hacken Sie das verbleibende Hirngewebe in einer Petrischale in Minimal Essential Medium (MEM) mit HEPES (5 ml pro Gehirn) mit einer sterilen Rasierklinge. Isoliere die primären Maus-BECs von 2 Monate alten C57BL / 6J-Mäusen gemäß dem referenzierten Protokoll 20 . </li><li> Übertragen Sie das Hackfleischgewebe auf ein 15 ml konisches Röhrchen. Zentrifugieren bei 290 xg für 5 min bei 4 ° C. Entfernen Sie den Überstand und inkubieren Sie das Gewebe in einem Papain (833,33 μl pro Gehirn) und DNase (41,7 μl pro Gehirn)Lösung, in einem 37 ° C Wasserbad für 1 h, um das Gewebe zu verdauen. </li><li> Triturieren Sie das Homogenat nacheinander durch 19 und 21 Gauge-Nadeln, mischen im Verhältnis 1: 1 mit einer 22% igen Rinderserumalbumin (BSA) -Lösung und zentrifugieren bei 1360 xg für 10 min bei 4 ° C. </li><li> Das erhaltene Pellet in 1 mL EBM-2 vollständig resuspendieren und bei 290 xg für 5 min bei 4 ° C zentrifugieren. Wiederholen Sie erneut in 1 mL EBM-2 vollständig und tafeln Sie die Zellen (1 ml / Vertiefung) auf 6-Well-Platten, die mit Kollagen (~ 1 Gehirn pro Vertiefung) beschichtet sind. </li><li> Ersetzen Sie das Medium 24 h später mit EBM-2 komplett mit 4 μg / ml Puromycin-Hydrochlorid; Ersetzen Sie mit EBM-2 nach 2 Tagen. Die primären BECs werden wie für die hCMEC / D3-Zellen kultiviert und liegen bei 1 x 10 5 Zellen / cm 2 bei voller Konfluenz. </li><li> Vorbereitung eines 100 &amp; mgr; M oAβ, 24 h vor dem Assay. HINWEIS: oAβ gilt als krankheitsrelevante Form von A. Für oAβ verwenden Sie die gut charakterisierten Präparate, die von Dahlgre beschrieben werdenN et al. 21 </li><li> Die Basalmembran-Stammlösung über Nacht bei 4 ° C auftauen und in sterile PCR-Röhrchenstreifen (8 Röhrchen) bei 140 μl Basalmembran pro Röhrchen aliquotieren. Jedes Streifen einfrieren und bei -20 ° C aufbewahren. Tauen Sie einen Streifen pro 96-Well-Platte bei 4 ° C, 24 h vor dem Assay. Vorbereitung der Pipettenspitzen, um Verfestigung zu vermeiden. HINWEIS: Die gesamte Handhabung der Basalmembranmatrix muss auf Eis durchgeführt werden, um eine schnelle Erstarrung zu vermeiden. Da am Tag des Assays 10 &amp; mgr; l pro Vertiefung der Basalmembran verwendet wird, reicht jeder Streifen für eine 96-Well-Platte aus. </li><li> Inkubieren Sie vollständig konfluierende BECs in EBM-2 basal, 24 h vor dem Assay. HINWEIS: Die Begründung lautet: EBM-2 komplett enthält ergänzende Faktoren und FBS mit dem Ziel, ein optimales Zellwachstum zu fördern; Allerdings sind die gleichen molekularen Wege, die das Zellwachstum fördern, auch für die Hirn-Endothelzellen-Abdeckung und -Dynamik wichtig, sowohl in der Gegenwart als auch in der AbseNce eines Stressors. Wir also Serum und Ergänzung verhungern die BECs, um die verstörende Wirkung der Restaktivierung von zellulären Signalwegen zu reduzieren. Bemerkenswert ist, dass die Zellen kurz (5 min) FBS während der Neutralisation von trypsinisierten Zellen vor dem Assay ausgesetzt sind. Im Gegensatz zu den BECs sind die Perizyten und Astrozyten aufgrund des Erfordernisses verschiedener Wachstumsfaktoren und der relativen Instabilität dieser Zelltypen als Reaktion auf Serumverhungern (Tai-Laboratorium, unveröffentlichte Beobachtungen) nicht serumverhungert. ANMERKUNG: EBM-2 basal wird während des Assays für die Einzel- und Triple-Kultur-Meshwork-Bildung und Disruption Assays verwendet. Dies ist entscheidend, um eine verstörende Stress- oder behandlungsabhängige Signalisierung zu verhindern. </li></ol> 2. Meshwork-ähnliche Formations- und Disruptions-Assays <ol><li> Einzelne BEC-Kultur-Assays: ANMERKUNG: Drei verschiedene Paradigmen für die einzelnen Kulturen von BECs sind in Abbildung 1A dargestellt </Stark&gt;. Jedes Paradigma soll die Reaktion von BECs in verschiedenen Modellen der Schiffsdeckung abschätzen. Paradigma 1 ist Meshwork-Bildung. Dieses Paradigma dient der Untersuchung der Auswirkungen von Stressoren und / oder Behandlungen auf die Angiogenese und die Maschenbildung. BECs, oAβ und Behandlungen werden alle der Platte zum 0-h-Zeitpunkt hinzugefügt. Paradigma 2 ist die Vermeidung von Meshwork-Störungen. Die Zellen werden in Gegenwart eines Wachstumsfaktors oder Arzneimittels plattiert und für 4 h inkubiert, um maschenartige Strukturen zu bilden. Ein Stressor, oAβ wird in diesem Fall nach 4 h zugegeben. Dieses Paradigma beurteilt die Fähigkeit einer Behandlung, Stress-induzierte Schäden an vorgeformten meshwork-ähnlichen Strukturen zu verhindern. Paradigma 3 ist gleichzeitige Behandlung von Meshwork-Störungen. Die Zellen sind plattiert und können für 4 h maschenartige Strukturen bilden. Behandlungen und oAβ werden dann gleichzeitig zum 4-stündigen Zeitpunkt zugegeben, wobei die Fähigkeit des vorgeformten Zellnetzes, auf verschiedene Behandlungen zu reagieren, bewertet wird. Alle Paradigmen fürLlow ähnliche gemeinsame Schritte, außer mit Unterschiede in der Zeit der Behandlung zusätzlich. <ol><li> Am Tag des Assays pipettieren Sie die Basalmembranmatrix mit 10 μl / well in den Boden der 96-Well-Platten und lassen Sie sie 1 h bei 37 ° C einstellen. </li><li> Suspendieren Sie den lyophilisierten Grünzell-Tracking-Farbstoff (siehe Tabelle der Materialien ) in 10 &amp; mgr; l DMSO, um eine 10-mM-Stammlösung zu erzeugen, und verdünnen Sie auf 10 &amp; mgr; M (1: 1000) in EBM-2 basal. Entfernen Sie das Medium aus dem vollständig konfluierenden Kolben und ersetzen Sie es mit EBM-2 basal, das den Grünzelle-Tracking-Farbstoff enthält (5 ml für einen 75 cm 2- Kolben). Voreinstellung BECs mit dem grünen Zell-Tracking-Farbstoff, 20 Minuten vor dem Beginn des Assays. </li><li> Inkubieren Sie die Zellen für 20-30 min bei 37 ° C, entfernen Sie das Medium mit Zellverfolgungsfarbstoff und trennen Sie die Zellen wie in Schritt 1.1 beschrieben. Neutralisieren des Mediums mit EBM-2 mit 10% FBS und Zentrifugieren bei 240 xg für 5 min bei 4 ° C. Das Pellet in 1 ml EBM-2 basal resuspendieren. </li><li> Die BECs in der 96-Well-Platte auf 10.000 Zellen / Well in EBM-2 basal (0 h Zeitpunkt in allen Paradigmen) plattieren. HINWEIS: Je nach verwendetem Paradigma werden Behandlungen, Stressoren oder Fahrzeugkontrollen zu den angegebenen Zeitpunkten hinzugefügt. In allen Paradigmen wird das Medium für die anschließende Analyse geerntet ( zB ELISA-Analyse) und die Zellen werden mit frisch hergestelltem 4% Paraformaldehyd in Phosphat-gepufftem Serum (PBS) um 24 h fixiert. Als alternativer Ansatz zur Bestimmung der Termeffekte von oAβ bei der Maschenbildung konnte das Protokoll modifiziert werden, um konfluierende Zellkulturkolben mit oAβ vorinkubieren zu können und dann die Maschenbildungsparadigmen (+/- oAβ) durchzuführen. HINWEIS: Das endgültige Volumen in jeder Vertiefung für alle Paradigmen beträgt 70 μl. Alle Behandlungen (oAβ, EGF, etc. ) werden zu ihren jeweiligen Vertiefungen bei einer 1: 20-Verdünnung, dh 3,5 &amp; mgr; l pro Behandlung, zugegeben. Für das Paradigma 1 werden die Zellen in einer Zellsuspensionslösung mit 63 &amp; mgr; l / w zugegebenEll Unmittelbar oAβ werden gewünschte Behandlungen und Kontrollen bei jeweils 3,5 &amp; mgr; l / Vertiefung zugegeben, was insgesamt 70 &amp; mgr; l ergibt. Für das Paradigma 2 werden 63 μl Zellsuspension und 3,5 μl Behandlung ( zB 100 ng / mL EGF) zum 0 h-Zeitpunkt zugegeben. Nach 4 h Inkubation werden 3,5 &amp; mgr; l eines oA &amp; bgr; -Standes zugegeben ( z. B. für 100 nM endgültige oAβ-Konzentration, 3,5 &amp; mgr; l 2 &amp; mgr; M oAβ-Stamm). Für das Paradigma 3 werden 63 &amp; mgr; l Zellsuspension zum 0 h-Zeitpunkt und bei 4 h zugegeben, wobei oAβ und die gewünschten Behandlungen mit jeweils 3,5 &amp; mgr; l / Vertiefung zugegeben werden, was insgesamt 70 &amp; mgr; l ergibt. Diese Bände können nach Behandlungen angepasst werden. Wenn beispielsweise nur eine Behandlung erforderlich ist, kann das Zellsuspensionsvolumen auf 66,5 &amp; mgr; l eingestellt werden (wobei 10 000 Zellen / Vertiefung aufrechterhalten werden) und das Behandlungsvolumen bei 3,5 &amp; mgr; l bleiben kann. </li></ol></li><li> Triple-Kultur-Assay: HINWEIS: Neben den einzelnen Kulturassays von BECs entwickeln wir uns( 1B ), um die Reaktion von BECs, Perizyten und Astrozyten in vorgeformten Netzwerken auf relevante Stressoren ( zB oAβ) zu bestimmen. BECs werden in Gegenwart von gewünschten Behandlungen bei 0 h plattiert. Nach 4 h werden Perizyten der Platte vorsichtig zugesetzt. Nach 7 h werden Astrozyten der Platte zugesetzt, gefolgt von der Zugabe eines Stressors bei 11 h. Die Zellen werden dann bis zum 24-Stunden-Zeitpunkt inkubiert. ANMERKUNG: Für die Triple-Kultur-Assays ist es wichtig, das Timing zu berücksichtigen, um sicherzustellen, dass alle Zellen gleichzeitig zusammenlaufen. Menschliche Astrozyten und Perizyten sollten 1 Woche vor dem Assay kultiviert werden, während die hCMEC / D3-Zellen 4-5 Tage vor dem Testdatum plattiert oder passagiert werden müssen. Weiterhin ist es wichtig, primäre Zellen mit niedrigem Durchgang (2-5) zu verwenden, um eine phänotypische Drift zu vermeiden. <ol><li> Fügen Sie die grüne Zell-Tracking-Farbstoff-Arbeitslösung zu den hCMEC / D3-Zellen 20 min vor dem Beginn des Assays hinzu. Plate die hCMEC / D3 Zellen bei 10, 000 Zellen / Brunnen in EBM-2 basal (0 h Zeitpunkt). Bei den verwendeten Volumina handelt es sich um 45 μl Zellsuspension und 3,5 μl Behandlung ( dh endgültige EGF-Konzentrationen von 50 ng / mL, 100 ng / mL oder 1000 ng / mL aus 20-mal mehr konzentrierten Beständen). </li><li> Nach der 3,5-stündigen Inkubation bei 37 ° C fügen Sie die blaue Zell-Tracking-Farbstoff-Arbeitslösung (10 μM Zellverfolger blau in EBM-2 basal) zu den primären Perizyten des Patienten hinzu. Beim 4-stündigen Zeitpunkt (~ 30 min Inkubation mit Zellverfolgungsfarbstoff) fügen Sie der Platte, die das hCMEC / D3 enthält, in einem Volumen von 6 μl / Vertiefung vorsichtig 2.000 Pericyt / Well zu. </li><li> Nach einer weiteren 2,5-stündigen Inkubation (insgesamt 6,5 h ab 0 h-Zeitpunkt) fügen Sie die orangene Zellverfolgungs-Farbstoff-Arbeitslösung (10 μM Zell-Tracker-Orange in EBM-2 basal) zu den primären Astrozyten des Menschen hinzu. Bei der 7-stündigen Zeit, fügen Sie vorsichtig 10.000 Astrozyten / Well auf die Platte in 12 μL Volumen. Daher ist das gesamte Zellverhältnis für Endothelzellen: Perizyten: Astrozyten iS 5: 1: 5. Weiterhin beträgt das bis dahin erreichte Volumen 66,5 μl. </li><li> Füge oAβ (3,5 μl 100 μM Lager) 4 h später hinzu (insgesamt 11 h ab 0 h Zeit). </li><li> Fixieren Sie die Zellen 13 h später in frisch hergestelltem 4% Paraformaldehyd in PBS. Achtung: Bei der Handhabung von Paraformaldehyd Schutzkleidung, Handschuhe und Brille tragen. </li></ol></li></ol> 3. Quantifizierung <ol><li> Erfassen Sie Fluoreszenzbilder der Gesamtbrunnen der 96-Well-Platte bei 1,6facher Vergrößerung mit einer 2-s-Belichtungszeit bei 50% maximaler Leistung unter Verwendung eines Sektionsmikroskops. HINWEIS: Äquivalente Mikroskope können genutzt werden; Allerdings ist es entscheidend, den gesamten Brunnen für eine umfassende Analyse zu erfassen. </li><li> Zur quantitativen Analyse verarbeiten die Bilder mit dem Plugin 22 für das PhotoJ-Angiogenese-Analysator 22 , um die Anzahl der Verzweigungen, die Anzahl der Maschen und die Gesamtzelllänge zu quantifizieren (diese Auslesungen werden automatisch von der Softwa tabelliertRe) wie unten beschrieben. Ein detailliertes visuelles Protokoll dieses Schrittes ist in Fig. 2 dargestellt . <ol><li> Öffnen Sie fiji ImageJ, indem Sie auf das Software-Symbol klicken. </li><li> Klicken Sie auf die doppelten roten Vorwärtspfeile, die sich am Ende der Symbolleiste befinden, und klicken Sie dann auf &quot;Angiogenese Analyzer&quot;. </li><li> Wählen Sie den Ordner mit Bilddateien aus, klicken Sie auf &quot;Öffnen&quot;. </li><li> Wenn das Feld &quot;Einstellungen für die Analyse&quot; erscheint, klicken Sie auf &quot;OK&quot;. </li><li> Wenn das Feld &quot;Verarbeitungsbilder&quot; erscheint, das die Anzahl der zu verarbeitenden Bilder angibt, klicken Sie auf &quot;OK&quot;. </li><li> Wenn das Feld &quot;Batch-Fortschrittsfenster&quot; erscheint, das die geschätzte Bearbeitungszeit anzeigt. Während dieser Zeit quantifiziert das Programm die Ausgänge einschließlich der Anzahl der Zweige, der Anzahl der Maschen und der Gesamtzelllänge. HINWEIS: Sobald alle Bilder quantifiziert sind, wird die Ergebnisdatei im Originalbildordner als Tabellenkalkulationsdokument angezeigt. </li><li> WählenDie Tabellenkalkulation enthält Ergebnisse und vergleicht die Anzahl der Zweige, Maschen und die Gesamtzelllänge zwischen den Gruppen. ANMERKUNG: Im Triple-Kultur-Assay wird ImageJ weiter verwendet, um die Pericyt- / Astrozyten-Abdeckung und -zahl zu analysieren. Bilder werden durch einen verblindeten Experimentator und die &quot;analysierte Partikel&quot; -Funktion, die verwendet wird, um Auslesungen zu erzeugen, eingeschränkt. Feste Zellen und röhrenartige Strukturen können auch für Aβ 17 oder andere Marker immunostainiert werden. </li></ol></li></ol>

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<li>Tai, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+APOE+in+cerebrovascular+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">The role of APOE in cerebrovascular dysfunction.</a> Acta Neuropathol. 131 (5), 709-723 (2016).</li>
<li>Ambrose, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroangiogenesis%3A+a+vascular+basis+for+Alzheimer%27s+disease+and+cognitive+decline+during+aging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Alzheimers+Dis%22%5BJournal%5D)">Neuroangiogenesis: a vascular basis for Alzheimer's disease and cognitive decline during aging.</a> J Alzheimers Dis. 32 (3), 773-788 (2012).</li>
<li>Ambrose, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+therapeutic+approach+for+senile+dementias%3A+neuroangiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Alzheimers+Dis%22%5BJournal%5D)">A therapeutic approach for senile dementias: neuroangiogenesis.</a> J Alzheimers Dis. 43 (1), 1-17 (2015).</li>
<li>Ambrose, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Capillaries+in+the+Lesser+Ailments+of+Old+Age+and+in+Alzheimer%27s+Disease+and+Vascular+Dementia%3A+The+Potential+of+Pro-Therapeutic+Angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Alzheimers+Dis%22%5BJournal%5D)">The Role of Capillaries in the Lesser Ailments of Old Age and in Alzheimer's Disease and Vascular Dementia: The Potential of Pro-Therapeutic Angiogenesis.</a> J Alzheimers Dis. 54 (1), 31-43 (2016).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die beschriebenen Methoden können genutzt werden, um mehrere grundlegende biologische Fragen um die zerebrovaskuläre Abdeckung zu adressieren 24 . Insbesondere können sie identifizieren, welche Rezeptoren und Signalwege eine Rolle bei der Angiogenese, der Gefäßabdeckung im Krebsgewebe und den peripheren Endothelzellen spielen, die für das Gehirn relevant sind. Beispiele umfassen angiogene Wachstumsfaktor-Rezeptoren, Stickstoffmonoxid, Mitogen-aktivierte Proteinkinase-Signalisierung und Calcium-Si...

<html> Die Blut-Hirn-Schranke (BBB) ​​von zerebralen Kapillaren ist die grösste Schnittstelle von Blut-zu-Gehirn-Kontakt und spielt eine zentrale Rolle in der Homöostase des Zentralnervensystems (ZNS) 1 , 2 . Die dynamischen Prozesse am BBB verhindern die Aufnahme von unerwünschten Molekülen aus dem Blut, entfernen Abfallprodukte aus dem ZNS, liefern dem NZS wesentliche Nährstoffe und Signalmoleküle und modulieren die Neuroinflammation 1 , 2 , 3 , 4 , 5 . BBB-Schäden sind während des Alterns vorherrschend und einige neurodegenerative Erkrankungen einschließlich Alzheimer-Krankheit (AD), Multiple Sklerose und Schlaganfall 1 , 2 , 3 , 4 , 5 ,Ass = &quot;xref&quot;&gt; 6 Daher kann die BBB-Dysfunktion eine Schlüsselrolle bei neurodegenerativen Erkrankungen spielen, auch als therapeutisches Ziel. Die Erhaltung der Schiffsdeckung ist für die homöostatischen Funktionen der BBB wichtig. In vivo- und in vitro- Daten stehen jedoch Konflikte dar, ob die Prozesse, die bei neurodegenerativen Störungen auftreten, eine höhere oder niedrigere BBB-Abdeckung 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , insbesondere in AD, verursachen. Daher gibt es eine starke Begründung für die Entwicklung von In-vitro- Modellen mit relevanten Zelltypen zu bewerten und umfassender zu verstehen, die Dynamik der BBB-Abdeckung. Zerebrale Kapillaren bestehen aus Astrozyten, Perizyten und Hirn-Endothelzellen (BECs) <sUp class = &quot;xref&quot;&gt; 3. Alle Zelltypen tragen zur Struktur der BBB durch strukturelle Unterstützung und über die Sekretion von Effektormolekülen wie angiogenen Wachstumsfaktoren, Zytokinen und Chemokinen bei, die in parakrin- und autokrineartig wirken. Allerdings sind die großen Effektorzellen der BBB BECs 3 . Im Allgemeinen sind die Zellkulturtechniken zur Beurteilung der BBB-Funktion Permeabilitäts-Assays, die an Zellen durchgeführt werden, die auf Filtereinsätzen gezüchtet werden, oder die Bewertung von Niveaus von Schlüssel-BEC-Proteinen, sowohl nach der Zugabe von Stressoren 14 , 15 , 16 . Obwohl wichtig, diese Assays nicht auf die zerebrovaskuläre Abdeckung konzentrieren. Hier sind unsere bisherigen Methoden 17 detailliert, um die BEC-Berichterstattung und die meshwork-artigen Strukturen unter Verwendung einzelner Kulturen von immortalisierten menschlichen BECs, einzelner Kulturen von primären Maus-BECs und einer humanisierten Tripelkultur zu bestimmenModell (BECs, Astrozyten und Perizyten) der BBB. Ziel war es, die nachteilige Wirkung von oAβ zu demonstrieren, die als wichtiger Beitrag zur AD-Progression auf der BEC-Berichterstattung gilt. Die schützende Wirkung des epidermalen Wachstumsfaktors (EGF) unterstreicht das Potenzial der Technik als therapeutisches Screening-Tool. Die Technik hat mehrere breite Anwendungen für die Grundlagenforschung und die angewandte Forschung, einschließlich: 1) Abgrenzung der Rolle spezifischer Wege auf Angiogenese und Gefäßabdeckung, 2) Bewertung der Auswirkungen von Krankheiten und Alterungsrelevanten Faktoren auf die Angiogenese und die Gefäßabdeckung und 3) die Identifizierung der pharmakologischen Zielen

<table><tbody><tr><td>hCMEC/D3-Zellen</td><td>Milipore</td><td>SCC066</td><td></td></tr><tr><td>EBM-2 Basalmedien</td><td>Lonza</td><td>CC-3156</td><td></td></tr><tr><td>Kollagen Typ 1</td><td>ThermoFisher</td><td>A1064401</td><td></td></tr><tr><td>HBSS, Calcium, Magnesium, kein Phenolrot</td><td>ThermoFisher</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>HBSS, kein Calcium, kein Magnesium, kein Phenolrot</td><td>ThermoFisher</td><td>14175095</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,25%)</td><td>ThermoFisher</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Endkonzentrationen der SingleQuot Wachstumsfaktor-Ergänzungsmittel für EBM2-Medien</td><td>Lonza</td><td>CC-4147</td><td></td></tr><tr><td>5% FBS</td><td></td><td>Lonza CC-4147</td><td></td></tr><tr><td>10% Ascorbinsäure</td><td>Lonza</td><td>CC-4147</td><td></td></tr><tr><td>10% Gentamycinsulfat</td><td>Lonza</td><td>CC-4147</td><td></td></tr><tr><td>25% Hydrocortison</td><td>Lonza</td><td>CC-4147</td><td></td></tr><tr><td>1/4 Volumen der zugeführten Wachstumsfaktoren: Fibroblasten-Wachstumsfaktor, epidermaler Wachstumsfaktor, insulinähnlicher Wachstumsfaktor, vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor</td><td>Lonza</td><td>CC-4147</td><td></td></tr><tr><td>Puromycinhydrochlorid</td><td>VWR</td><td>80503-312</td><td></td></tr><tr><td>MEM-HEPES</td><td>Thermo Scientific</td><td>12360-038</td><td></td></tr><tr><td>Papainzell-Dissoziationssystem (Papain und DNase1)</td><td>Worthington Biochemisches</td><td>LK003150</td><td></td></tr><tr><td>Menschliche Perizyten</td><td>Sciencell</td><td>1200</td><td></td></tr><tr><td>Perizyten Basalmedien</td><td>Sciencell</td><td>1201</td><td></td></tr><tr><td>Perizyten Wachstumsergänzung</td><td>Sciencell</td><td>1252</td><td></td></tr><tr><td>Menschliche Astrozyten</td><td>Sciencell</td><td>1800</td><td></td></tr><tr><td>Astrozyten Medien</td><td>Sciencell</td><td>1801</td><td></td></tr><tr><td>Astrozyten Wachstumsergänzungsmittel</td><td>Sciencell</td><td>1852</td><td></td></tr><tr><td>Basalmembran (Matrigel Wachstumsfaktor reduziert)</td><td>Corning</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>Angiogenesis m-Platten (96-Well)</td><td>ibidi</td><td>89646</td><td></td></tr><tr><td>Human Epidermal Growth Factor</td><td>Shenendoah Biotechnology</td><td>100-26</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker grün</td><td>ThermoFisher</td><td>C7025</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker </td><td>orange ThermoFisher</td><td>C34551</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker blau</td><td>ThermoFisher</td><td>C2110</td><td></td></tr><tr><td>Poly-l-Lysin</td><td>Sciencell</td><td>0403</td><td></td></tr><tr><td>10% neutral gepuffertes Formalin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT5012-60ML</td><td></td></tr><tr><td>C57BL Mäuse</td><td>Jackson Laboratory</td><td>na</td><td></td></tr><tr><td>PCR Röhrchenstreifen</td><td>GeneMate</td><td>T-3014-2</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss stereo discover v.8 Präpariermikroskop</td><td>Zeiss</td><td>na</td><td></td></tr></tbody></table>

in-vitro- assays zur beurteilung der blut-hirn-schranke mesh-artigen gefäßbildung und -störung

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

Blut-Hirn-Schranke (BBB) ​​Abdeckung spielt eine zentrale Rolle in der Homöostase des zentralen Nervensystems (ZNS). Die BBB wird dynamisch durch Astrozyten, Perizyten und Hirn-Endothelzellen (BECs) gehalten. Hier stellen wir Methoden zur Beurteilung der BBB-Berichterstattung über einzelne Kulturen von verewalisierten menschlichen BECs, einzelne Kulturen von primären Maus-BECs und ein humanisiertes Triple-Kulturmodell (BECs, Astrozyten und Perizyten) der BBB vor. Um die Anwendbarkeit der Assays auf Krankheitszustände hervorzuheben, beschreiben wir die Wirkung von oligomeren Amyloid-β (oAβ), was ein wichtiger Faktor für die Alzheimer-Krankheit (AD) -Progression bei der BBB-Abdeckung ist. Weiterhin nutzen wir den epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), um das Arzneimittel-Screening-Potential der Techniken zu beleuchten. Unsere Ergebnisse zeigen, dass einzelne und dreifach kultivierte BECs unter basalen Bedingungen meshwork-ähnliche Strukturen bilden und dass oAβ diese Zell-Mesh-Formation stört und die vorgeformten Mesh-Strukturen degeneriert,Aber EGF blockiert diese Störung. So sind die beschriebenen Techniken für die Sezierung von fundamentalen und krankheitsrelevanten Prozessen wichtig, die die BBB-Abdeckung modulieren.

In einzelnen Kulturen bilden sowohl die hCMEC / D3-Zellen ( Fig. 3A ) als auch die primären Maus-BECs ( Fig. 3B ) in der Wanne Mesh-ähnliche Strukturen. Die Strukturen zeichnen sich durch ein Netz von miteinander verbundenen Knoten aus ( Abbildung 3 ). In allen beschriebenen Paradigmen ( Abbildung 1 ) sind die maschenartigen Strukturen nach 24 h in den Kontrollgruppen ä...

Die Erhaltung der Blut-Hirn-Schranke Abdeckung ist der Schlüssel für die Homöostase des zentralen Nervensystems. Dieses Protokoll beschreibt in vitro- Techniken, um die fundamentalen und pathologischen Prozesse abzugrenzen, die die Blut-Hirn-Schrankenabdeckung modulieren.

In-Vitro- Assays zur Beurteilung der Blut-Hirn-Schranke Mesh-artigen Gefäßbildung und -störung

Blood-brain barrier (BBB) coverage plays a central role in the homeostasis of the central nervous system (CNS). The BBB is dynamically maintained by ...

Die Ziele dieses Assays bestehen darin, die Rolle krankheitsrelevanter Prozesse bei der Störung der Blut-Hirn-Schranke aufzuklären, die zugrundeliegenden Mechanismen zu identifizieren und potenzielle Behandlungen in vitro zu testen. Diese Methode kann wichtige grundlegende und angewandte Forschungsfragen im Bereich der Blut-Hirn-Schranke und der Neurodegeneration beantworten. Beispielsweise, indem untersucht wird, ob krankheitsrelevante Stressfaktoren vorgebildete Netzwerkstrukturen stören und die zugrundeliegenden Signalwege identifiziert werden. Durch weitere Screening-Verfahren können Behandlungen identifiziert werden, die eine stressinduzierte Störung der Blut-Hirn-Schranke verhindern und für zukünftige in-vivo-Tests geeignet sind. Die Implikationen dieser Technik reichen bis hin zu einem mechanistischen Verständnis und der Behandlung der Alzheimer-Krankheit, aufgrund der Bedeutung der homöostatischen Funktionen der Blut-Hirn-Schranke für die kognitive Leistungsfähigkeit. Obwohl diese Methode Einblicke in die Dysfunktion der Blut-Hirn-Schranke bei der Alzheimer-Krankheit ermöglicht, kann sie auch auf andere neurodegenerative Erkrankungen mit Blut-Hirn-Schranken-Störungen, wie b

in-vitro-assays-to-assess-blood-brain-barrier-mesh-like-vessel

Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Dieses Video beschreibt einen Permeabilitätsassay zur Bewertung der Permeabilität der in vitro Blut-Hirn-Schranke mit Natriumfluoresceinmolekülen.

Assay zur Nachahmbarkeit der Blut-Hirn-Schranke: Ein In-vitro-Assay zur Beurteilung der Durchlässigkeit von BHS-Nachahmung gegenüber Tracermolekülen

Dieses Video zeigt eine Methode zur Bestimmung des transendothelialen elektrischen Widerstands (TEER) in mikrovaskulären Endothelzellen des Mausgehirns in vitro. Ein hoher TEER-Wert deutet auf intakte Endothelzellverbindungen hin, während die Zugabe von aktivierten T-Zellen den TEER-Wert senkt, was eine Störung der Verbindungsbarriere widerspiegelt.

Bewertung des transendothelialen elektrischen Widerstands in einem in vitro Blut-Hirn-Schrankenmodell

Das Ziel der vorliegenden Studie war es, die Reproduzierbarkeit der einem in vitro-Modell mit BBB eine Ratte syngenen Co-Kultur von Endothelzellen und Astrozyten zu validieren. Die Endothel-Zellschicht vorgestellt hohen und niedrigen TEER LY Durchlässigkeit. Expression spezifischer TJ Proteinen wurden funktionellen Antworten zu Entzündungen und Funktionalität von Transportern und Rezeptoren untersucht.

Einrichten einer<em&gt; In-vitro-</em&gt; Modell der Ratte Blut-Hirn-Schranke (BBB): Ein Fokus auf BBB-Undurchlässigkeit und Rezeptor-vermittelten Transport

Hier beschreiben wir ein menschliches Blut-Hirn-Schrankenmodell, das es ermöglicht, die Transmigration von Lymphozyten in das zentrale Nervensystem in vitro zu untersuchen.

Analyse von Lymphozyten-Extravasation einer Verwendung<em&gt; In Vitro</em&gt; Modell des Barrier Menschliches Blut-Hirn

Ziel des Protokolls ist eine optimierte Verfahren für die Einrichtung eines in-vitro- Blut - Hirn-Schranke (BBB) Modells basierend auf primäre porcinen Gehirn endothelial Zellen (pBECs) zu präsentieren. Das Modell zeigt hohe Reproduzierbarkeit, hohe Dichtigkeit und eignet sich für Studien der Transport- und intrazellulären Menschenhandel in der Wirkstoffforschung.

Verbesserte Methode für die Einrichtung einer In-vitro- Blut - Hirn-Schranke Modell auf porcinen Endothelzellen Gehirnzellen basiert

Hier präsentieren wir einen Maus Gehirn vaskulären Permeabilität Assay mit intraperitonealer Injektion von Fluoreszenz Tracer gefolgt von Perfusion, die auf Tiermodelle der Blut - Hirn-Schranke Dysfunktion anwendbar ist. Ein Hemi-Gehirn dient zur Durchlässigkeit quantitativ bewerten und die andere für die Tracer Visualisierung/Immunostaining. Der Eingriff dauert ca. 5-6 h für 10 Mäuse.

Eine In Vivo Blut - Hirn-Schranke Permeabilität Assay bei Mäusen mit Gewebekulturen beschriftet Tracer

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine hoch reproduzierbare Technik für in Vivo Beurteilung der Blut - Hirn-Schranke Störung in Ratte-Modelle des ischämischen Schlaganfalls liefern.

Eine In-Vivo -Bewertung der Störung der Blut - Hirn-Schranke in einem Rattenmodell des ischämischen Schlaganfalls

Isolierte Gehirn-Kapillaren aus menschlichen Hirngewebe dient als ein präklinischen Modell Barrierefunktion unter physiologischen und pathophysiologischen Bedingungen zu studieren. Hier präsentieren wir Ihnen ein optimiertes Protokoll zur Gehirn-Kapillaren aus frischem menschlichen Hirngewebe zu isolieren.

Isolierung der zerebralen Kapillaren aus frischem menschlichen Hirngewebe

Drug targeting zu Tumoren des zentralen Nervensystems ist eine große Herausforderung. Hier beschreiben wir ein Protokoll, um eine in-vitro-Mimik der Blut-Hirn-Tumor-Schranke mit murinen und/oder menschlichen Zellen zu produzieren und ihre Relevanz für die Vorhersagbarkeit des zentralen Nervensystems Tumor targeting in vivo zu diskutieren.

Vorhersage In Vivo Nutzlasten Lieferung mit einem Blut-Hirnschranke Tumor in einer Petrischale

Dieses Protokoll veranschaulicht einen In-vitro-Endothelzell-Transzytose-Assay als Modell zur Bewertung der Permeabilität der inneren blutretinalen Barriere durch Messung der Fähigkeit menschlicher retinaler mikrovaskulärer Endothelzellen, Meerrettichperoxidase über Zellen in caveolae-vermittelten transzellulären Transportprozessen zu transportieren.

Endothelzell-Transzytose-Assay als In-vitro-Modell zur Beurteilung der Permeabilität der inneren Blut-Retina-Barriere

Die Blut-Hirn-Schranke (BHS) spielt eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung einer stabilen und gesunden Gehirnumgebung. Die BHS-Dysfunktion ist mit vielen neurologischen Erkrankungen verbunden. Wir haben ein 3D-Stammzellmodell der BHS entwickelt, um die zerebrovaskuläre Pathologie, die Integrität der BHS und die Veränderung der BHS durch Genetik und Krankheit zu untersuchen.

Rekonstruktion der Blut-Hirn-Schranke in vitro zur Modellierung und therapeutischen Behandlung neurologischer Erkrankungen

Lernen Sie In-vitro-Assays zur Untersuchung der Blut-Hirn-Schranke mittels Zellkulturtechniken. Diese Methode ermöglicht die Analyse von Barrieredysfunktionen und die Entwicklung therapeutischer Ansätze für neurodegenerative Erkrankungen.

In-Vitro- Assays zur Beurteilung der Blut-Hirn-Schranke Mesh-artigen Gefäßbildung und -störung

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