Name: Der 4-Gefäß-Stichprobenansatz für integrative Studien der menschlichen Plazenta-Physiologie In vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-02T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 17 s
Description: Erfahren Sie den 4-Gefäß-Stichprobenansatz zur Untersuchung der menschlichen Plazenta-Physiologie in vivo. Diese Methode ermöglicht integrative Studien des mütterlich-fetalen Stoffwechsels und Nährstofftransfers.

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In erster Linie bedanken wir uns herzlich bei den Müttern, die an diesem Projekt teilgenommen haben. Als nächstes erkennen wir alle Mitarbeiter an, die das Probenahmeverfahren, den Anästhesisten, den Krankenschwester Anästhesisten und die chirurgischen Krankenschwestern unterstützt und erleichtert haben. Das Projekt wäre nicht möglich gewesen, ohne von der Südost-Norwegen-Regionalen Gesundheitsbehörde und der norwegischen Beratungsstelle für Frauengesundheit, Oslo-Universität und der lokalen Finanzierung des Universitätsklinikums Oslo zu finanzieren.

Die Studie wurde von den Datenschutzbeauftragten am Universitätsklinikum Oslo und dem Regionalkomitee für Medizinische und Gesundheitsforschung Ethik, Südnorwegen 2419/2011, genehmigt. Alle Teilnehmer unterschrieben eine schriftliche Einverständniserklärung. 1. Vorbereitungen HINWEIS: Eine Zeitleiste für die Prozeduren ist in Abbildung 1 dargestellt . <img alt="Abbildung 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55847/55847fig1.jpg" /> Abbildung 1 : Flussdiagramm Beschreiben des Timings und des Personals, das in der 4-Gefäß-Stichprobenverfahren involviert ist. Eine Farbe repräsentiert eine Person. Detaillierte Beschreibung der Methode ist im Protokoll angegeben. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55847/55847fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <ol><li> Personal <ol><lI&gt; Stellen Sie sicher, dass alle erforderlichen Mitarbeiter zur Verfügung stehen: ein hochqualifizierter Fetalmedizin-Spezialist, der die Ultraschallmessungen durchführt, zwei Geburtshelfer, die die Chirurgie durchführen, einer der Geburtshelfer und zwei Krankenschwestern, die die Proben sammeln, ein Assistent, der die Blutgasanalysen und einen Assistenten verarbeitet Andere Proben nacheinander und unmittelbar nach der Sammlung. ANMERKUNG: Im Falle einer fortgeschritteneren Sammlung von Plazenta-Gewebe ist eine zusätzliche Person erforderlich. </li></ol></li><li> Ausrüstung <ol><li> Vorbereitung der Ausrüstung, 50 ml eiskalte 1 M phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), 25 ml kalte RNA-stabilisierende Lösung und 5 x 0,5 ml der optimalen Schneidtemperatur-Verbindung (OCT). Etikettieren Sie die Vacutainer und Röhren. Siehe vorläufige Liste der Ausrüstung. </li></ol></li></ol> 2. Mütterliche Merkmale <ol><li> Notieren Sie die mütterlichen klinischen und nicht-klinischen Merkmale bei der Aufnahme und wiederholen Sie relevante Fragen und michAsurements, einschließlich Gewicht, zum Zeitpunkt der Lieferung. Notieren Sie die Dauer der Fastenzeit vor dem Kaiserschnitt und alle blutdrucksenkenden Episoden, die während der Operation auftreten. Anmerkung: Fügen Sie den minimalen mütterlichen klinischen Datensatz in einer aktuellen Veröffentlichung von Global Pregnancy CoLaboratory (COLAB) gemeldet. Dieser Artikel enthält auch einige sehr wichtige Aspekte bei der Auswahl der Studienpopulationen und sollte bei der Planung der Studie 18 angesprochen werden. </li><li> Betrachten Sie die Aufzeichnung von väterlichen Merkmalen, einschließlich Ethnizität, Alter und Body Mass Index (BMI). </li></ol> 3. Ultraschall <ol><li> Führen Sie die Doppler-Ultraschalluntersuchung am Tag der Auslieferung durch, mit den Frauen im Fastenzustand. Führen Sie die Untersuchung während einer Periode der fetalen Ruhe, mit der Frau in semi-Rückenlage Position, etwas seitlich gegenüber der Region von Interesse gekippt, um Kompression der Aorta und Hohlvene zu vermeiden. Überwachen Sie den Ausgang inTensität durch die mechanischen und thermischen Indizes auf dem Display. </li><li> Nabelschnur <ol><li> Manifestiere die Nabelvene in einer sagittalen oder schrägen Transektion des fötalen Abdomens. Messen Sie den inneren Gefäßdurchmesser im geraden Teil der intraabdominalen Nabelvene, bevor Sie sichtbare Zweige haben. Verwenden Sie den regulären B-Modus und visualisieren Sie das Gefäß in einem senkrechten Insonationswinkel für Durchmessermessungen und halten Sie mehrere optimale Rahmen für spätere Messungen, um die Wirkung von Änderungen des pulsierenden Durchmessers zu minimieren. <ol><li> Wiederholen Sie die Messungen fünf bis zehn mal 19 . </li></ol></li><li> Am selben Ort verwenden Sie Doppler-Ultraschall und stellen Sie die Sonde so ein, dass sie einen möglichst geringen Insonationswinkel (immer &lt;30 °) erhält, um die zeitlich gemittelte maximale Geschwindigkeit (TAMX) zu messen. Erhalten Sie die Geschwindigkeit über einen Zeitraum von 3 - 5 s (nicht pulsierende Strömung). </li></ol></li><li> Uterine Arterie <ol><li> Doppler benutzenUltraschall, um die Gebärmutterarterie zu visualisieren, während sie die äußere Iliakalarterie kreuzt, unmittelbar nachdem sie von der A. iliaca interna verzweigt. Stellen Sie die Sonde an dieser Stelle ein, um einen niedrigen Isolationswinkel (immer &lt;30 °) zu erhalten und TAMX zu messen. Erhalten Sie die Geschwindigkeit als die mittlere Geschwindigkeit von drei Herzzyklen. </li><li> Da es unwahrscheinlich ist, dass ein senkrechter Winkel an der gleichen Stelle wie TAMX gemessen wird, folgen Sie dem Gefäß distal, um einen korrekten Winkel für Durchmessermessungen zu erhalten, so nah wie möglich an den Stellen der Durchmessermessungen als erreichbar. Die Durchmessermessungen ausschließen, wenn sichtbare Gefäße vor dieser Stelle abzweigen, ausgewertet durch Farb-Doppler-Ultraschall. <ol><li> Verwenden Sie den regulären B-Modus und visualisieren Sie das Gefäß in einem senkrechten Insonationswinkel für Durchmessermessungen und halten Sie mehrere optimale Rahmen für spätere Messungen, um die Wirkung von Änderungen des pulsierenden Durchmessers zu minimieren. </li><li> Wiederholen Sie die Messungen fünf bis zehn mal 19 . </li></ol></<html> Li&gt; </ol></li><li> Beachten Sie die Position der Plazenta. </li></ol> 4. 4-Gefäß Blutentnahme ANMERKUNG: Die Zeitleiste für die Prozeduren ist in Abbildung 1 dargestellt und ein Überblick über die Proben ist in Abbildung 2 dargestellt . <img alt="Figur 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55847/55847fig2.jpg" /> Abbildung 2 : Schematische Darstellung der Placental Vasculature und der Sampling Sites. Bei der 4-Gefäß-Probenahme werden Blutproben aus der Uterusvene, der Radialarterie (als Proxy für die Uterusarterie) und den Nabelarterien und Vene gezogen. Blutfluss in der Uterusarterie und der Nabelvene wird durch Ultraschall gemessen. Gewebeproben aus der Plazenta werden gesammelt. Abbildung: Øystein H. Horgmo, Universität Oslo.5847fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <ol><li> Sicherheitsmassnahmen <ol><li> Geben Sie alle Mitarbeiter im Operationssaal mit Handschuhen, chirurgischen Scrub-Anzügen, Masken und Kopfbedeckungen. </li><li> Stellen Sie den Chirurgen und Forschungspersonal in Kontakt mit dem Operationsfeld mit chirurgischen Scrub-Anzügen, Masken, Kopfbedeckungen, Kleidern und Doppelhandschuhen. Gläser sind optional. </li><li> Stellen Sie das Personal zur Handhabung der Blutproben mit Handschuhen bei. </li><li> Stellen Sie das Personal zur Handhabung der Placenta-Proben mit Handschuhen und chirurgischen Masken zur Verfügung. Die Homogenisierung erfordert die Verwendung von Hauben. </li></ol></li><li> Vorbereitung im Operationssaal <ol><li> Geben Sie ein Briefing und Hand die Ausrüstung für alle Mitarbeiter, die die Probenahme vor Beginn der Operation zu unterstützen. </li><li> Ansprache der Anästhesisten und Anästhesiologie Krankenschwester, die mit dem notwendigen peripheren arteriellen und venösen Zugang zu unterstützen, und sicherzustellen, dassWährend der Probenahme werden keine Flüssigkeiten intravenös verabreicht. </li><li> Geben Sie drei Spritzen (10 ml) ohne Nadeln an die Person, die mit der antecubitalen Aderprobe und zwei Spritzen (eine 20 ml und eine 10 ml) und eine Blutgasspritze (mit Heparin) an die Person unterstützt, die mit der radialen Arterie hilft. </li><li> Bereiten Sie zwei sterile Spritzen (20 ml), fünf sterile Spritzen (10 ml), drei &quot;Schmetterlingsnadeln&quot; und zwei Blutgasspritzen für das Operationsfeld vor. </li></ol></li><li> Zugang zu Blutgefäßen. <ol><li> Befolgen Sie das Standardverfahren vor dem Kaiserschnitt, um den peripheren intravenösen (iv) Zugang zu gewährleisten. HINWEIS: Die antecubitale Vene ist vorzuziehen, weil es einfacher ist, Proben von dieser Seite zu ziehen. </li><li> Lokalisieren Sie die radiale Arterie am Handgelenk durch Ultraschall oder durch Palpation. Nach 0,5 mL subkutaner Lidocain-Analgesie, legen Sie eine arterielle Linie in die radiale Arterie. Verlassen Sie die Probenahme von dieser Seite im Falle von drei fehlgeschlagenen Einfügungen, oderWenn die Frau während der Insertion Schmerzen erlebt. HINWEIS: Führen Sie den chirurgischen Eingriff des Kaiserschnittes nach Standardverfahren durch. Im Folgenden werden nur die für das Stichprobenverfahren erforderlichen Anpassungen unterstrichen. </li></ol></li><li> Mütterliche Blutproben HINWEIS: Erhält alle drei mütterlichen Blutproben (Uterusvene, Radialarterie und Antecubitalvene) gleichzeitig vor dem Uterusschnitt. <ol><li> Für die Uterusvene, nach dem Öffnen der Bauchhöhle, verwenden Sie einen Retraktor, um die Bauchwand zu heben und die Hauptäste der Uterusvenen auf den anterolateralen Seiten des Uterus freizulegen. Erhalten Sie Blut von Uterusvenen Zweige auf der gleichen Seite wie die Plazenta, wann immer möglich oder verwenden Sie die prominentesten Vene Plexus, wenn die Plazenta befindet sich in der uterinen Mittellinie. <ol><li> Legen Sie eine Schmetterlingsnadel auf eine Blutgas-Spritze in der Uterusvene in einem Winkel von etwa 30 Grad und sammeln Sie Blut durch sanfte Aspiration zu vermeidenHämolyse Bei sorgfältiger Sicherung der iv-Position der Schmetterlingsnadel die gefüllte Blutgasspritze durch eine 20 mL und eine 10 mL Spritze nacheinander ersetzen. HINWEIS: Der optimale Zugang ist am besten auf der kontralateralen Seite der gewählten Uterusvene gewährleistet. </li></ol></li><li> Für die radiale Arterie, aspirieren aus der intra-arteriellen Linie. Die ersten 5 ml verwerfen und dann 3 ml in der Heparinspritze für Blutgasanalysen aspirieren, gefolgt von 3 ml in zwei Spritzen (20 + 10 ml). </li><li> Für die antecubitale Vene, saugt sanft aus dem intravenösen Katheter. Die ersten 5 ml verwerfen und dann 30 ml in drei Spritzen (10 ml) absaugen. </li><li> Führen Sie eine endgültige Inspektion der Probenahmestelle auf der Uterusvene durch, bevor Sie beginnen, den Bauch zu schließen. </li></ol></li><li> Fetale Blutproben <ol><li> Wenn das Kind geboren wird, sofort Aspiration von Blut aus der Nabelarterie, ohne die Nabelschnur zu klemmen oder die Plazenta zu liefern. Start WitzH die Spritze für die Blutgasanalyse, und folgen mit drei 10 ml Spritzen, wenn möglich. </li><li> Wenn die Arterienproben gesichert sind, klemmen Sie die Schnur und geben Sie das Kind an die Hebamme vor der Probenahme aus der Nabelvene (Blutgas und 20 + 10 ml Spritzen). HINWEIS: Erhalten Sie alle Nabelproben innerhalb von Sekunden nach Lieferung und mit der Plazenta in situ, es sei denn, es hat sich spontan abgetrennt. </li><li> Befolgen Sie die norwegischen Empfehlungen zum späten Schnurklemmen. Im Falle eines verzweifelten Kindes, klemme und schneide die Schnur sofort und die Hand das Kind an die Hebamme und Neonatologen. </li></ol></li><li> Umgang mit Blutproben <ol><li> Setzen Sie die Blutgasspritzen auf Eis, während Sie den Rest der Blutproben vorbereiten und analysieren sie in einem Blutgasanalysator innerhalb von 5 min. </li><li> Übertragen Sie die Blutproben sofort auf Vacutainer und legen Sie die Plasmaschläuche 1 - 2 min auf eine Wippe, bevor Sie sie auf Eis legen. Lassen Sie die Serumröhrchen auf die ArbeitStuhlbank für 30 Minuten zu begleichen. HINWEIS: Dies ist ein kritischer Schritt in der Prozedur, die zusätzliche Aufmerksamkeit benötigt, da Proben von allen fünf Standorten gleichzeitig vorbereitet werden müssen, um eine gute Qualität zu gewährleisten. </li><li> Die Plasmaproben so schnell wie möglich zentrifugieren und innerhalb von 30 min bei 6 ° C, 2500 xg für 20 min. </li><li> Nach 30 min zentrifugieren die Serumproben bei Raumtemperatur für 10 min bei 2.500 x g. </li><li> Aliquot die Überstände sorgfältig auf 2 ml Kryoröhrchen, wobei 0,5 ml des Überstandes über dem Pellet zurückbleiben, um plättchenfreies Plasma zu gewährleisten. </li><li> Die Proben bei -80 ° C aufbewahren. </li></ol></li></ol> 5. Sammlung von Placental Tissue <ol><li> Legen Sie die Plazenta-Wohnung so schnell wie möglich auf ein Eis gekühltes Sektionsfach, nachdem es geliefert worden ist. Fotografieren und messen den längsten Durchmesser und den Durchmesser bei 90 Grad. </li><li> Wiegen Sie die Plazenta. </li><li> Notieren Sie das Gewicht, die beiden Durchmesser, jeder gRoss Pathologie, Anzahl der Gefäße in der Schnur und das Zeitintervall von der Anlieferung an, wenn die Plazenta auf Eis gelegt wurde. HINWEIS: Sende die Plazenta zur pathologischen Untersuchung, wenn klinisch angegeben. </li><li> Legen Sie die Plazenta mit der mütterlichen Oberfläche nach oben und identifizieren Sie 4 - 5 Probenahmestellen zufällig in jedem Quadranten der Plazenta, Vermeidung von Bereichen der offenen Pathologie. Entfernen Sie die Decidua mit einer Schere, um 3 - 5 mm von der mütterlichen Oberfläche wegzuschneiden. Sammeln Sie ein 1 - 2 cm 3 Stück Zottengewebe von jedem Standort. </li><li> Das gesammelte Gewebe vorsichtig in 50 ml kaltem 1M PBS waschen. Teilen Sie in mehrere Stücke von jeder Probenahmestelle und aliquot. Hinweis: Die Größe der Plazenta-Stücke hängt von den geplanten Analysen ab. </li><li> Fügen Sie Aliquots von 0,1 - 0,5 cm 3 Gewebeproben zu 5 Kryoröhren hinzu und schnappen Sie sich in flüssigem Stickstoff ein. </li><li> Füge kleine Stücke von 0,1 - 0,2 cm 3 zu dem Röhrchen mit 25 ml RNA-Stabilisierungslösung hinzu. Bei 4 lagern6, C für 24 h, verwerfen die RNA-Stabilisierungslösung und ersetzen sie. Einfrieren. </li><li> Füge Stücke von 0,5 cm 3 zu den 5 Kryoröhrchen mit 0,5 mL OCT hinzu, oben mit OCT auffüllen, mischen und einfrieren. </li><li> Die Proben bei -80 ° C bis zur Analyse aufbewahren. HINWEIS: Burton et al. Bietet einen hervorragenden Überblick über die praktischen Aspekte der Plazenta-Probenahme in Abhängigkeit von den geplanten Analysen. 20 Man empfiehlt, das übrige Gewebe zur Isolierung der mikrovillösen und basalen Membranen vorzubereiten und deziduales Gewebe durch Vakuumsaugtechnik zu sammeln. 21 , 22 </li></ol> 6. Neonatale Eigenschaften <ol><li> Notieren Sie die neonatalen Eigenschaften, einschließlich Apgar-Score (1, 5 und 10 min), Geschlecht, Gewicht, Länge, Gestationsalter und Zulassung zur Neugeborenen Intensivstation (Länge und Ergebnis des Aufenthalts). </li><li> Betrachten Sie die Messung der neonatalen Körperzusammensetzung durch anthropometrische Messungen, Luft-VerschiebenPlethysmographen oder Dual-Röntgen-Absorptiometrie. 23 , 24 </li></ol> 7. Berechnungen <ol><li> Nehmen wir eine ähnliche Blutzusammensetzung in der Radial- und Uterusarterie an und berechnen die uteroplazentäre arteriovenöse Konzentrationsdifferenz. Uteroplazentale arteriovenöse Konzentrationsdifferenz = C A - C V Umbilische venöse - arterielle Konzentrationsdifferenz = C v - C a Wo C die Konzentration mit den Indizes ist: A, die radiale Arterie; V, die Uterusvene; V die Nabelvene und a, die Nabelarterie. </li><li> Berechnen Sie den Volumen Blutfluss, mL / min (Q): <img alt="Gleichung 1" src="/files/ftp_upload/55847/55847eq1.jpg" /> Wenn D der Gefäßdurchmesser (cm) ist, ist TAMX die zeitlich gemittelte maximale Geschwindigkeit und h ist der Koeffizient für das räumliche Blutgeschwindigkeitsprofil. Verwenden Sie 0,5 als Koeffizient für die Nabelvene und0,6 für die Uterusarterie 25 , 26 . </li><li> Berechnen Sie die Plazenta-Aufnahme und Freigabe nach Ficks Prinzip: Uteroplazentale Aufnahme = ( C A - C V ) x Qm Fetale Aufnahme = ( C v - C a ) X Q f Subscripts: m, mütterlich und f, fetal. </li></ol>

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<li>Acharya, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+validation+of+uterine+artery+volume+blood+flow+measurement+by+Doppler+ultrasonography+in+pregnant+sheep%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasound+Obstet+Gynecol%22%5BJournal%5D)">Experimental validation of uterine artery volume blood flow measurement by Doppler ultrasonography in pregnant sheep.</a> Ultrasound Obstet Gynecol. 29 (4), 401-406 (2007).</li>
<li>Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate-glutamine+cycle+and+exchange+in+the+placenta-fetus+unit+during+late+pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22Amino+Acids%22%5BJournal%5D)">Glutamate-glutamine cycle and exchange in the placenta-fetus unit during late pregnancy.</a> Amino Acids. 47 (1), 45-53 (2015).</li>
<li>Tuckey, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progesterone+synthesis+by+the+human+placenta%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Progesterone synthesis by the human placenta.</a> Placenta. 26 (4), 273-281 (2005).</li>
<li>Simmons, M. A., Meschia, G., Makowski, E. L., Battaglia, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fetal+metabolic+response+to+maternal+starvation%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Res%22%5BJournal%5D)">Fetal metabolic response to maternal starvation.</a> Pediatr Res. 8 (10), 830-836 (1974).</li>
<li>Simmons, M. A., Jones, M. D., Battaglia, F. C., Meschia, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+effect+on+fetal+glucose+utilization%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Res%22%5BJournal%5D)">Insulin effect on fetal glucose utilization.</a> Pediatr Res. 12 (2), 90-92 (1978).</li>
<li>Bujold, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+supporting+that+the+excess+of+the+sVEGFR-1+concentration+in+maternal+plasma+in+preeclampsia+has+a+uterine+origin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Matern+Fetal+Neonatal+Med%22%5BJournal%5D)">Evidence supporting that the excess of the sVEGFR-1 concentration in maternal plasma in preeclampsia has a uterine origin.</a> J Matern Fetal Neonatal Med. 18 (1), 9-16 (2005).</li>
<li>Jansson, T., Aye, I. L., Goberdhan, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+role+of+mTORC1+signaling+in+placental+nutrient-sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">The emerging role of mTORC1 signaling in placental nutrient-sensing.</a> Placenta. 33, Suppl 2 23-29 (2012).</li>
<li>Cetin, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Placental+transport+of+amino+acids+in+normal+and+growth-restricted+pregnancies%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Obstet+Gynecol+Reprod+Biol%22%5BJournal%5D)">Placental transport of amino acids in normal and growth-restricted pregnancies.</a> Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 110, Suppl 1 50-54 (2003).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

<html> Die Plazenta-4-Gefäß-Probenahme-Methode ist für drei Hauptzwecke relevant. Zuerst kann man daran denken, wie spezifische Substanzen von der Plazenta auf der mütterlichen Seite aufgenommen und möglicherweise auf die Nabelzirkulation und den Fötus übertragen werden, wie unsere Glukose- und Aminosäure-Studien zeigen. Zweitens ist die Methode sehr relevant für die Untersuchung von Stoffen, die von der Plazenta produziert und in die mütterlichen oder fetalen Zirkulationen freigesetzt werden, wie die Progesteron-Ergebni...

Nach den National Institutes of Health, USA, ist die Plazenta das am wenigsten verstandene Organ im menschlichen Körper 1 , 2 , 3 . Es ist schwierig, die menschliche Plazenta in vivo zugänglich zu machen und zu studieren, ohne die fortdauernde Schwangerschaft unethisch zu riskieren. Studien der Plazenta-Funktion im Menschen sind daher weitgehend auf In-vitro- und Ex-vivo- Modellen basiert. Die Mehrheit der bisherigen in vivo Studien des Plazententransports und des Stoffwechsels wurden bei den Tieren 4 , 5 , 6 durchgeführt . Da jedoch die Plazenta-Struktur und die Funktionen zwischen den Arten stark variieren, muss die Extrapolation der Ergebnisse von Tieren auf den Menschen mit Vorsicht erfolgen. Nur wenige kleinere menschliche in vivo Studien haben plazentale und fetale Aufnahme und Transport unter normalen physiologischen untersuchtAl-Bedingungen, und keiner hat die integrierte Übertragung mehrerer Verbindungen 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 untersucht . Diese grundlegenden Studien zeigen, dass in vivo Studien der menschlichen Plazenta machbar sind und dass sie mehrere Zwecke dienen können. Zuerst können aktuelle Konzepte von Plazenta-Funktionen, die hauptsächlich aus in vitro , ex vivo und Tierstudien abgeleitet sind, in einer menschlichen Umgebung getestet werden und so einen neuen und spezifischeren Einblick in die menschliche Plazenta liefern. Zweitens können die Eigenschaften der dysfunktionellen Plazenta, die mit einem abweichenden fetalen Wachstum, Präeklampsie, mütterlichem Diabetes, metabolischem Syndrom und anderen mütterlichen Stoffwechselstörungen assoziiert sind, besser charakterisiert werden. Drittens bieten menschliche In-vivo- Studien die Möglichkeit, Diagnosen zu entwickelnTic und prädiktive Werkzeuge der Plazenta-Funktion. Vor diesem Hintergrund wollten wir eine umfassende Sammlung physiologischer Daten erstellen, um die menschliche Plazenta-Funktion in vivo zu untersuchen . Während eines geplanten Kaiserschnittes nutzen wir den intraabdominellen Zugang zur Uterusvene, um Blutproben aus den ankommenden und ausgehenden Gefäßen auf den mütterlichen und fötalen Seiten der Plazenta (die 4-Gefäß-Probenahme-Methode) zu sammeln. Diese Proben werden verwendet , um die paarige arteriovenöse Konzentrationsunterschiede von Nährstoffen zu berechnen und anderen Substanzen 14. Darüber hinaus messen wir den Volumenblutfluss auf beiden Seiten der Plazenta durch Ultraschall. Folglich kann eine Plazenta- und fetale Aufnahme einer beliebigen Verbindung quantifiziert werden. Ferner ist es möglich, von der Plazenta freigesetzte Stoffe zu den mütterlichen und fetalen Zirkulationen 15 , 16 , 17 zu bestimmen. Beim KombinierenD mit klinischen Parametern von Mutter und Kind und Analysen von Plazenta und anderen relevanten Geweben hat diese Methode das spannende Potenzial, viele Aspekte von Plazenta-Funktionen in vivo in denselben Mutter-Fötus-Paaren zu integrieren.

<table><tbody><tr><td>Mütterliche Körperzusammensetzung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Impedanzskala</td><td>Tanita</td><td></td><td>oder ähnlich</td></tr><tr><td>Ultraschallmessungen&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sequoia 512 Ultraschallgerät</td><td>Acuson</td><td></td><td>ausgestattet mit einem gebogenen Schallkopf mit Farb- und Pulswellendoppler (Frequenzbandbreite 2 - 6 MHz)</td></tr><tr><td>BlutprobenArerialkanüle</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>BD Medical</td><td>682245</td><td>oder ähnlich</td></tr><tr><td>20 cc Exzenter Luerspitze Spritze ohne Nadel</td><td>Termo</td><td>SS-20ES</td><td>oder ähnliches. 3 benötigt.</td></tr><tr><td>10 cc Exzenter-Luer-Spitzenspritze ohne Nadel</td><td>Termo</td><td>SS-10ES</td><td>oder ähnliches. 9 benötigt.</td></tr><tr><td>5 cc 6% Luer Spritze ohne Nadel</td><td>Termo</td><td>SS-05S1</td><td>oder ähnliches. 2 benötigt.</td></tr><tr><td>Arterielle Blutgasspritze&nbsp;</td><td>Radiometer Medical</td><td></td><td>oder ähnliches. 4 benötigt.</td></tr><tr><td>Sterile Flügelnadel, die mit einem flexiblen Schlauch verbunden ist, 21 Gauge</td><td>Greiner Bio-One</td><td>450081</td> <td>(für den einmaligen Gebrauch).3 erforderlich.</td></tr><tr><td>Vacutainer-Röhrchen 6 mL EDTA</td><td>Greiner Bio-One</td><td>456043</td><td>oder ähnliches. Beschriften Sie mit einer Beispielstelle. 10 benötigt.</td></tr><tr><td>Vacutainer-Röhrchen 5 mL LH Lithium-Heparin-Separator</td><td>Greiner Bio-One</td><td>456305</td><td>o.ä. Beschriften Sie mit einer Beispielstelle. 5 benötigt.</td></tr><tr><td>Vacutainer-Röhrchen 6 mL Serum-Gerinnsel-Aktivator</td><td>Greiner Bio-One</td><td>456089</td><td>oder ähnliches. Beschriften Sie mit einer Beispielstelle. 5 benötigt.</td></tr><tr><td>Vacutainer-Röhrchen 3 mL&nbsp; 9NC Gerinnungs-Natriumcitrat 3,2%</td><td>Greiner Bio-One</td><td>454334</td><td>oder ähnliches. Beschriften Sie mit einer Beispielstelle. 5 benötigt.</td></tr><tr><td>Kryo-Fläschchen, 2,0 mL</td><td>Corning</td><td>430488</td><td>oder ähnliches. Etikett mit Probenstelle, Serum/Art des Plasmas und ID. 90 erforderlich.</td></tr><tr><td>Markierte Tabletts für den Transport der Spritzen</td><td></td><td></td><td>für den Transport der Blutproben im Operationssaal</td></tr><tr><td>Wippe</td><td></td><td></td><td>zum schonenden Mischen der Proben</td></tr><tr><td>Eis</td><td></td><td></td><td>in Styroporbox</td></tr><tr><td>Flüssiger Stickstoff</td><td></td><td></td><td>im entsprechenden Behälter</td></tr><tr><td>Plazenta-Proben</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metal Tablett:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eis</td><td></td><td></td><td>in Styropordose</td></tr>, <tr><td>Kalibrierte Skala</td><td></td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>Metalllineal</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 M, Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td>, <td>Sigma</td><td>D1408</td><td>oder ähnliches. Verdünnen Sie 10 M bis&nbsp; 1 M vor Gebrauch</td></tr><tr><td>RNA-Stabilisierungslösung</td><td>Sigma</td><td>R0901-500ML&nbsp;</td><td>oder ähnlich</td></tr><tr><td>Optimum Cutting Temperature (O.C.T.) Compound</td><td>vwr</td><td>361603E</td><td>oder ähnliche</td></tr><tr><td>Kryo-Fläschchen, 2,0 mL</td><td>Corning</td><td>430488</td><td>oder ähnliches. Beschriften Sie mit einer Beispielstelle. Inhalt und ID. 10 erforderlich.</td></tr><tr><td>Zentrifugenröhrchen mit konischem Boden 50 mL</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227,285</td><td>oder ähnlich. Beschriftung mit "RNA later", Probenstelle und ID. 2 erforderlich.</td></tr><tr><td>Flüssiger Stickstoff</td><td></td><td></td><td>in geeignetem Behälter</td></tr><tr><td><stark>Fötale Körperzusammensetzung</stark></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kalibrierte Waage</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Maßband</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

der 4-gefäß-stichprobenansatz für integrative studien der menschlichen plazenta-physiologie<em&gt; in vivo</em

The 4-vessel Sampling Approach to Integrative Studies of Human Placental Physiology In Vivo

Die menschliche Plazenta ist für die Forschung sehr unzugänglich, während sie sich noch in utero befindet . Das gegenwärtige Verständnis der menschlichen Plazenta-Physiologie in vivo beruht daher weitgehend auf Tierversuchen, trotz der hohen Vielfalt der Arten in der Plazenta-Anatomie, der Hämodynamik und der Dauer der Schwangerschaft. Die überwiegende Mehrheit der menschlichen Plazenta-Studien sind Ex-vivo- Perfusions-Studien oder in vitro- Trophoblasten-Studien. Obwohl in vitro Studien und Tiermodelle wesentlich sind, ist die Extrapolation der Ergebnisse aus solchen Studien auf die menschliche Plazenta in vivo ungewiss. Wir zielten darauf ab, die menschliche Plazenta-Physiologie in vivo zu behandeln und ein detailliertes Protokoll der Methode vorzustellen. Durch die Ausnutzung des intraabdominellen Zugangs zur Uterusvene kurz vor dem Uterusschnitt während des geplanten Kaiserschnittes sammeln wir Blutproben aus den ankommenden und ausgehenden Schiffen auf der mütterlichen und fötalen Seite der Plazenta. Bei der Kombination von conKonzentrationsmessungen von Blutproben mit Volumen Blutflussmessungen, sind wir in der Lage, Plazenta und fetale Aufnahme und Freisetzung einer Verbindung zu quantifizieren. Darüber hinaus können Plazenta-Gewebeproben aus denselben Mutter-Fötus-Paaren Messungen der Transporterdichte und -aktivität und anderer Aspekte von Plazenta-Funktionen in vivo liefern. Durch diese integrative Nutzung der 4-Gefäß-Probenahme-Methode sind wir in der Lage, einige der aktuellen Konzepte der Plazenta Nährstofftransfer und Metabolismus in vivo , sowohl in normalen und pathologischen Schwangerschaften zu testen. Darüber hinaus ermöglicht diese Methode die Identifizierung von Substanzen, die von der Plazenta auf die mütterliche Zirkulation abgesondert werden, was ein wichtiger Beitrag zur Suche nach Biomarkern der Plazenta-Dysfunktion sein könnte.

Die 4-Gefäß-Probenahme-Methode ist in der klinischen Praxis anwendbar und wir haben erfolgreich Blutproben von 209 Mutter / Kleinkindern erhalten. In 128 von diesen haben wir auch erreicht, um Volumen Blutfluss zu messen. Komplette 4-Gefäß-Probenahme und gute Qualitäts-Durchflussmessungen von mütterlichen und fetalen Gefäßen wurden in 70 Mutter-Fötus-Paaren ( Abbildung 3 ) erhalten. Darüber hinaus haben wir bisher Blut und Plazenta Proben von 30 preeclamptic...

Wir präsentieren eine detaillierte Methode, um die menschliche Plazenta-Physiologie in vivo zu studieren. Die Methode kombiniert die Blutentnahme von den ankommenden und ausgehenden Gefäßen auf der mütterlichen und fötalen Seite der Plazenta mit Ultraschallmessungen von Volumen Blutfluss und Plazenta Gewebe Probenahme.

Der 4-Gefäß-Stichprobenansatz für integrative Studien der menschlichen Plazenta-Physiologie<em&gt; In vivo</em

The human placenta is highly inaccessible for research while still in utero. The current understanding of human placental physiology in vivo is therefore ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Funktion der menschlichen Plazenta in vivo unter Verwendung mehrerer Methoden zu untersuchen, die gemeinsam die Erfassung umfassender und integrativer Daten zur fetalen Plazentaphysiologie des Menschen sicherstellen. Diese Methode kann dabei helfen, zentrale Fragen zur Physiologie der menschlichen Plazenta zu beantworten, beispielsweise welche Rolle die Plazenta beim Mutter-Kind-Austausch spielt. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass es möglich ist, aktuelle Konzepte zum plazentaren Transport, zur Aufnahme und Sekretion beim Menschen in vivo zu überprüfen.Die Übertragung experimenteller Studien auf den Menschen wird durch die großen Unterschiede zwischen Tieren und Menschen hinsichtlich Plattenanatomie, Dauer der Schwangerschaft und Schwangerschaftskomplikationen erschwert. Obwohl diese Methode Einblicke in den Plazentastoffwechsel und die Nährstoffübertragung ermöglichen kann, lässt sie sich auch zur Untersuchung der Plazenta-Freisetzung von Substanzen sowohl bei gesunden als auch bei komplizierten Schwangerschaften, wie beispielsweise der Präeklampsie, anwenden. Diese Methode erfordert eine hochgradig koordinierte Zusammenarbeit mehrerer medizinischer Fachärzte, Krankenschwestern und Forscher.Der Schlüssel zum Erfolg liegt in einer strikten Planung, wobei stets die Mutter und ihr Baby im Fokus bleiben. Dieses Diagramm veranschaulicht den Zeitplan und das Personal, das zur Gewinnung der Proben erforderlich ist. Jede Person, die bei der Probenentnahme hilft, ist durch eine andere Farbe dargestellt. Dieses Protokoll umfasst die kombinierte Anwendung von drei Methoden zur Untersuchung der Physiologie der menschlichen Plazenta. Zunächst wird der Blutfluss in der Arteria uterina und der Vena umbilicalis mittels Ultraschall bestimmt. Anschließend werden während eines Kaiserschnitts Blutproben aus den ein- und austretenden Gefäßen der maternalen und fetalen Seite der menschlichen Plazenta entnommen.Dritte Plazentagewebeproben werden zur Analyse gesammelt. Zunächst unterstützt man die Frau dabei, eine halb liegende Position einzunehmen, die leicht seitlich entgegengesetzt zur Region von Interesse geneigt ist, um eine Kompression der Aorta und der Vena cava zu vermeiden. Während einer Phase der fetalen Ruhe visualisiert man die Nabelvene in einer sagittalen oder schrägen Querschnittsdarstellung des fetalen Abdomens und misst den inneren Gefäßdurchmesser in einem geraden Abschnitt der intraabdominellen Nabelvene vor sichtbaren Seitenästen.Verwenden Sie den regulären B-Modus und visualisieren Sie das Gefäß in einem senkrechten Einstrahlwinkel für Durchmesser-Messungen. Speichern Sie mehrere optimale Einzelbilder für spätere Auswertungen, um den Einfluss pulsationsbedingter Durchmesseränderungen zu minimieren. Wiederholen Sie die Messungen fünf bis zehn Mal. Passen Sie am selben Messort den Schallkopf an und verwenden Sie die Doppler-Ultraschalluntersuchung, um einen möglichst geringen Einstrahlwinkel zu erreichen, um die zeitlich gemittelte maximale Geschwindigkeit (TAMX) zu messen.Bestimmen Sie die Geschwindigkeit über einen Zeitraum von drei bis fünf Sekunden. Verwenden Sie danach die Doppler-Sonographie, um die Uterusarterie zu visualisieren, während sie die Arteria iliaca externa überquert, unmittelbar nachdem sie sich aus der Arteria iliaca interna abzweigt. Passen Sie den Schallkopf an dieser Stelle so an, dass ein niedriger Insonationswinkel erreicht wird, und messen Sie TAMX.Bestimmen Sie die Geschwindigkeit als mittlere Geschwindigkeit über drei Herzzyklen. Verfolgen Sie das Gefäß distal, um einen korrekten Winkel für Durchmesser-Messungen so nahe wie möglich an den Stellen der TAMX-Messungen zu erhalten. Die Messung des volumetrischen Blutflusses in der Arteria uterina ist schwierig, da es unwahrscheinlich ist, am selben Ort wie die TAMX-Messung einen senkrechten Winkel zu erreichen.Gefäße, die zwischen den beiden Messstellen abzweigen, können dazu führen, dass die Durchmesser-Messungen ausgeschlossen werden. Um vor Beginn der Operation eine Vier-Gefäß-Blutentnahme durchzuführen, bereiten Sie die Lösungen, Röhrchen und Geräte vor. Danach erteilen Sie eine Unterweisung und übergeben das Gerät allen beteiligten Mitarbeitern, die bei der Entnahme helfen werden.Legen Sie eine arterielle Linie in die Arteria radialis zusätzlich zum standardmäßigen peripheren venösen Zugang. Die Vena antecubitalis ist vorzuziehen, da an dieser Stelle das Entnehmen von Proben einfacher ist. Öffnen Sie danach die Bauchhöhle, verwenden Sie einen Retraktor, um die Bauchdecke anzuheben, und legen Sie die Hauptäste der Uterusvenen an den anterolateralen Seiten des Uterus frei.Identifizieren Sie, wenn möglich, einen Uterusvenenast auf derselben Seite wie die Plazenta oder das ausgeprägteste Venenplexus der Plazenta, das sich in der Uterusmittellinie befindet. Sobald eine geeignete Uterusvene identifiziert wurde, weisen Sie das assistierende Personal an, Blutproben aus der Arteria radialis und der Vena mediana cubiti zu entnehmen. Gleichzeitig wird unter einem Winkel von 30 Grad eine Butterfly-Nadel an einer Blutgas-Spritze in die Uterusvene eingeführt und Blut durch sanfte Aspiration gewonnen.Während die IV-Position der Flachnadel sorgfältig fixiert wird, lässt man einen Assistenten die gefüllte Blutgas-Spritze durch eine 20-Milliliter-Spritze ersetzen. Unmittelbar danach folgt eine 10-Milliliter-Spritze. Aus der Arteria radialis, der Vena antecubitalis, verwirft man die ersten fünf Milliliter und aspiriert anschließend drei Milliliter in eine Heparin-Spritze zur Blutgasanalyse.Anschließend 30 Milliliter von jeder Stelle absaugen. Sobald das Kind geboren ist, beginnen Sie mit einer Spritze für die Blutgasanalyse und saugen unverzüglich Blut aus der Nabelschnurarterie ab, ohne die Nabelschnur zu klemmen oder die Plazenta zu entbinden. Danach, falls möglich, drei Spritzen mit je 10 Milliliter folgen lassen.Wenn die arteriellen Proben gesichert sind, abklemmen und die Nabelschnur durchtrennen, bevor aus der Nabelvene entnommen wird, wobei alle Nabelproben bei liegendem Mutterkuchen gewonnen werden. Die Vier-Gefäß-Methode erfordert eine koordinierte Blutentnahme sowie eine schnelle Handhabung der Proben von fünf verschiedenen Stellen gleichzeitig. Achten Sie auf die Nabelarterie, die anfällig für Kontraktion, Hämolyse und Gerinnung ist.Führen Sie eine abschließende Überprüfung der Entnahmestelle an der Uterusvene durch, bevor Sie mit dem Verschluss des Abdomens beginnen. Stellen Sie alle Blutgas-Spritzen auf Eis und analysieren Sie die Proben innerhalb von fünf Minuten mithilfe eines Blutgasanalysegeräts. Übertragen Sie die Blutproben unverzüglich in Vakuumröhrchen und schwenken Sie die Plasma-Röhrchen eine bis zwei Minuten lang, bevor Sie sie auf Eis stellen.Zentrifugieren Sie die Plasma-Proben so schnell wie möglich und innerhalb von 30 Minuten bei 2.500 × g und sechs Grad Celsius für 20 Minuten. Danach pipettieren Sie vorsichtig die Überstände in 2-Milliliter-Kryoröhrchen. Analysieren Sie die Blutproben auf die gewünschten Substanzen und führen Sie die Berechnungen zum Plazentatransfer gemäß dem Textprotokoll durch.Legen Sie die Plazenta so schnell wie möglich nach der Entbindung flach auf ein eisgekühltes Präparationsbrett. Notieren Sie das Gewicht des Gewebes sowie den längsten Durchmesser und den Durchmesser im 90-Grad-Winkel zur ersten Messung. Erfassen Sie anschließend jegliche makroskopische Pathologie und die Anzahl der Gefäße in der Nabelschnur.Platzieren Sie die Plazenta mit der mütterlichen Oberfläche nach oben und identifizieren Sie vier bis fünf zufällig in jedem Quadranten der Plazenta verteilte Probenahmestellen. Entfernen Sie mit einer Schere die Decidua, indem Sie drei bis fünf Millimeter von der mütterlichen Oberfläche abschneiden. Entnehmen Sie anschließend von jeder Stelle ein Stück villöses Gewebe von ein bis zwei Kubikzentimetern.Spülen Sie das gesammelte Gewebe vorsichtig mit 50 Milliliter kaltem, einmolarem PBS. Anschließend teilen Sie das Gewebe in mehrere Stücke von jeder Entnahmestelle und aliquotieren es. Geben Sie Aliquots von 0,1 bis 0,5 Kubikzentimeter Gewebeproben in fünf Kryoröhrchen und schockgefrieren Sie die Proben in flüssigem Stickstoff. Geben Sie kleine Stücke mit einer Größe von 0,1 bis 0,2 Kubikzentimetern in zuvor vorbereitete Röhrchen, die 25 Milliliter RNA-Stabilisierungslösung enthalten. Für histologische Untersuchungen fügen Sie 0,5 Kubikzentimeter große Stücke fünf Kryoröhrchen mit jeweils 0,5 Milliliter OCT hinzu, füllen diese mit OCT auf und mischen anschließend den Inhalt der Röhrchen. Gefrieren Sie die Proben bei minus 80 Grad Celsius, bis sie weiter analysiert werden.Blutproben von 209 Mutter-Kind-Paaren wurden erfolgreich mit der Vier-Gefäß-Stichmethode gewonnen. Bei 128 der Proben wurde der Volumenblutfluss gemessen. Eine vollständige Vier-Gefäß-Entnahme sowie qualitativ hochwertige Durchflussmessungen sowohl der mütterlichen als auch der fetalen Gefäße wurden bei 70 Mutter-Fetus-Paaren erhalten.Die Vier-Gefäß-Methode wurde verwendet, um den plazentaren Transfer am Beispiel von Glukose zu untersuchen, wie hier gezeigt. Signifikante arteriovenöse Glukosedifferenzen wurden auf beiden Seiten der Plazenta gefunden, was einen uteroplazentaren Uptake von 0,29 Millimol pro Liter und einen fetalen Uptake von 0,54 Millimol pro Liter im In-vivo-Modell belegt. Ein medianer Fluss in der Nabelvene von 196,2 Milliliter pro Minute wurde gemessen.Mithilfe des Fick’schen Prinzips wurde eine mittlere fetale Glukoseaufnahme aus dem Nabelschnurkreislauf von 0,10 Millimol pro Minute berechnet. Mit der Vier-Gefäß-Methode wurde die plazentare Aufnahme von Glutaminsäure untersucht, die als Brennstoff in Stoffwechselwegen sowie für die fetoplazentare Interkonversion von Aminosäuren von Bedeutung ist. Es wurde eine plazentare Aufnahme von Glutaminsäure sowohl aus dem Nabelschnur- als auch aus dem mütterlichen Kreislauf beobachtet.Die in vivo Freisetzung von Progesteron durch die Plazenta am Ende der Schwangerschaft wurde ebenfalls gemessen, und es wurde eine signifikante Freisetzung von Progesteron in den mütterlichen Kreislauf festgestellt, was zeigt, wie die viergefässige Probenahmemethode der Plazenta genutzt werden kann, um Substanzen nachzuweisen, die von der Plazenta freigesetzt werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig zu betonen, dass die Messung des Blutflussvolumens von einem auf fetale Medizin spezialisierten Facharzt mit Erfahrung in dieser Art der Sonographie durchgeführt werden sollte, um genaue Messwerte zu erhalten. Im Anschluss an dieses Verfahren können die Blutproben analysiert werden, um den plazentaren Transfer sowie die Aufnahme oder Freisetzung der Substanz von Interesse zu untersuchen, sei es Nährstoffe, Metaboliten, Signalstoffe, Exosomen, Abbauprodukte, Arzneimittel oder Toxine.Außerdem können durch die Analyse von Plazentaproben zusätzliche Fragen zur Regulationsmechanismen des Transports und zum plazentaren Stoffwechsel beantwortet werden. Insgesamt zeigt dieses Protokoll, wie koordinierte Erhebungen von Volumenstrommessungen, Blut- und Gewebeproben durchgeführt werden können, um ein intaktes In-vivo-Modell zur Untersuchung der menschlichen Plazentaphysiologie zu erhalten. Nach Anschauen dieses Videos sollte ein Geburtshelfer ein gutes Verständnis dafür haben, wie arteriovenöse Blutproben sicher von beiden Seiten der menschlichen Plazenta während eines Kaiserschnitts entnommen werden können.

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Research

Forschung

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Medicine

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