Name: Tuning in der Hippocampal Theta Band In vitro: Methoden für die Aufnahme aus dem isolierten Nagetier Septohippocampal Circuit (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: Lernen Sie Methoden zur Aufzeichnung hippocampaler Theta-Oszillationen im isolierten Septohippocampalen Schaltkreis von Nagetieren mittels Patch-Clamp und optogenetischer Stimulation.

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Diese Arbeit wurde von den kanadischen Instituten für Gesundheitsforschung und Naturwissenschaften unterstützt.

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<li>Gu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMDA-dependent+phase+synchronization+between+septal+and+temporal+CA3+hippocampal+networks%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">NMDA-dependent phase synchronization between septal and temporal CA3 hippocampal networks.</a> J Neurosci. 33 (19), 8276-8287 (2013).</li>
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Die Autoren erklären keine konkurrierenden kommerziellen oder finanziellen Interessen.

Während elektrophysiologische Aufnahmen von akuten Hippocampusscheiben eine Standard- In-vitro- Technik darstellen, unterscheiden sich die hier vorgestellten Methoden erheblich vom klassischen Ansatz. Anders als die dünnen Scheibenpräparate, bei denen spezifische Zellschichten an der Oberfläche sichtbar sind und direkt untersucht werden können, sind die intakten Hippocampuspräparate eher in in vivo- Konfigurationen verwandt, bei denen Elektroden in gezielte Hirnregionen abgesenkt werden, währe...

Hippocampale Theta-Oszillationen (4 - 12 Hz) gehören zu den vorherrschenden Formen der rhythmischen Aktivität im Säugetiergehirn und werden geglaubt, um Schlüsselrollen in kognitiven Funktionen wie die Verarbeitung von räumlich-zeitlichen Informationen und die Bildung episodischer Erinnerungen 1 , 2 , 3 zu spielen . Während mehrere In-vivo- Studien, die das Verhältnis von theta-modulierten Ort-Zellen mit räumlichen Navigations- und Läsionsstudien hervorheben, sowie klinische Evidenz unterstützen die Ansicht, dass hippocampale Theta-Oszillationen in die Gedächtnisbildung 4 , 5 , 6 involviert sind, Mit der Erzeugung von hippocampalen Theta-Oszillationen sind noch nicht vollständig verstanden In frühen In-vivo- Untersuchungen wurde vorgeschlagen, dass die Theta-Aktivität hauptsächlich von extrinsischen Oszillatoren, insbesondere rhythmischen Inputs, abhingVon afferenten Hirnstrukturen wie dem Septum und dem entorhinalen Kortex 7 , 8 , 9 , 10 . Eine Rolle für intrinsische Faktoren - interne Konnektivität von hippocampalen neuronalen Netzwerken zusammen mit den Eigenschaften von Hippocampusneuronen - wurde auch auf der Basis von in vitro Beobachtungen 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 postuliert. Abgesehen von einigen Landmarkstudien 19 , 20 , 21 sind jedoch Schwierigkeiten bei der Entwicklung von Ansätzen, die physiologisch realistische Populationsaktivitäten in einer einfachen In-vitro- Schichtvorbereitung replizieren könntenS hat seit langem eine detailliertere experimentelle Untersuchung der intrinsischen Fähigkeiten des Hippocampus und der verwandten Gebiete zur Selbst-Erzeugung von Theta-Schwingungen verzögert. Ein wichtiger Nachteil der Standard- In-vitro- Dünnschicht-Versuchsanpassung ist, dass die 3D-zelluläre und synaptische Organisation von Hirnstrukturen in der Regel kompromittiert wird. Dies bedeutet, dass viele Formen von konzertierten Netzwerkaktivitäten, die auf räumlich verteilten Zellanordnungen basieren, von lokalisierten Gruppen (≤1 mm Radius) bis hin zu Populationen von Neuronen, die sich über ein oder mehrere Gehirnbereiche (&gt; 1 mm) erstrecken, nicht unterstützt werden können. Angesichts dieser Überlegungen war eine andere Art von Ansatz erforderlich, um zu untersuchen, wie Theta-Oszillationen im Hippocampus entstehen und sich auf verwandte kortikale und subkortikale Ausgangsstrukturen ausbreiten. In den letzten Jahren wurde die anfängliche Entwicklung der &quot;kompletten septo-hippocampalen&quot; Präparation zur bidirektionalen Intera untersuchtCtions der beiden Strukturen 22 und die anschließende Evolution der &quot;isolierten Hippocampus&quot; -Präparation haben ergeben, dass intrinsische Theta-Oszillationen spontan im Hippocampus ohne externe rhythmische Input 23 auftreten . Der Wert dieser Ansätze liegt in der ersten Einsicht, dass die gesamte funktionale Struktur dieser Regionen bewahrt werden musste, um als ein Theta-Rhythmus-Generator in vitro zu funktionieren 22 .

<table><tbody><tr><td>Reagenzien</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9625</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4 - Natriumphosphat monobasisch</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S8282</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumsulfat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glukose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchloriddihydrat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C5080</td><td></td></tr><tr><td>Natriumascorbat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7631-25G</td><td></td></tr><tr><td>Name </td><td>Company</td><td>Katalognummer</td><td>Kommentare</td></tr><tr><td>Ausrüstung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Standard Präparierschere</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-951-25</td><td>Hirnextraktion</td></tr><tr><td>Skalpellgriff #4, 14 cm</td><td>WPI</td><td>500237</td><td>Hirnextraktion</td></tr><tr><td>Filter Pinzette, flache Backen, gerade (11 cm)</td><td>WPI</td><td>500456</td><td>Hirnextraktion</td></tr><tr><td>Paragon Edelstahl Skalpellklingen #20</td><td>Ultident</td><td>02-90010-20</td><td>Hirnextraktion</td></tr><tr><td>Fine Point Curved Dissektionschere</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>711999</td><td>Hirnextraktion</td></tr><tr><td>Teflon (PTFE) -beschichteter dünner Spatel</td><td>VWR</td><td>82027-534</td><td>Hippocampus-Präparat</td></tr><tr><td>Hayman Style Mikroskopspatel</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-401-25A</td><td>Hippocampus-Präparat</td></tr><tr><td>Laborlöffel</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-375-20</td><td>Hippocampus-Präparat</td></tr><tr><td>Borosilikatglas Pasteur Pipets</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20A</td><td>Hippocampus-Präparat</td></tr><tr><td>Droper</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>Hippocampus-Präparat</td></tr><tr><td>Rasierklingen Einschneidig</td><td>VWR</td><td>55411-055</td><td>Hippocampus-Vorbereitung</td></tr><tr><td>Linsenpapier (4 x 6")</td><td>VWR</td><td>52846-001</td><td>Hippocampus-Vorbereitung</td></tr><tr><td>Petrischalen aus Glas (100 x 20 mm)</td><td>VWR</td><td>25354-080</td><td>Hippocampus-Vorbereitung</td></tr><tr><td>Kunststoffschale für Eis; Größe 30 x 20 x 5 cm</td> n.a.n.a.Hippocampus-Vorbereitung <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Single Inline Solution Heater</td><td>Warner Instruments</td><td>SH-27B</td><td>Perfusionssystem</td></tr><tr><td>Aquarium Ausströmersteine zum Sprudeln</td> n.a.n.a.Perfusionssystem <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tygon E-3603 Schlauch (ID 1/16 OD 1/8)</td><td>Fisherbrand</td><td>14-171-129</td><td>Perfusionssystem</td></tr><tr><td>Elektrische Pfanne</td><td>Schwarz & Decker</td><td>n.a.Perfusionssystem</td><td></td></tr> <tr><td>95% O2/5% CO2 Gasgemisch (Carbogen)&nbsp;</td><td>Vitalaire</td><td>SG466204A</td><td>Perfusionssystem</td></tr><tr><td>Glasflaschen/-kolben (4 x 1 L)</td>n.a.n.a.Perfusionssystem <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Untergetauchte Aufnahmekammer</td><td>Sonderanfertigung (FM)</td><td>n.a.Kommerzielle</td> <td>Alternative kann verwendet werden</td></tr><tr><td>Glaspipetten (1,5/0,84 OD/ID (mm)) WPI</td><td></td> <td>1B150F-4</td><td>Elektrophysiologie</td></tr><tr><td>Brummwanze 50/60 Hz Lärmbeseitiger</td><td>Quest Scientific</td><td>Q-Humbug</td><td>Elektrophysiologie</td></tr><tr><td>Multiclamp 700B Patch-Clamp Verstärker</td><td>Molekulare Geräte</td><td>MULTICLAMP</td><td>Elektrophysiologie</td></tr><tr><td>Multiclamp 700B Commander Programm Molekulare</td><td>Geräte</td><td>MULTICLAMP</td><td>Elektrophysiologie</td></tr><tr><td>Digital/Analog-Wandler</td><td>Molekulare Geräte</td><td>DDI440</td><td>Elektrophysiologie</td></tr><tr><td>PCLAMP10</td><td>Molekulare Geräte</td><td>PCLAMP10</td><td>Elektrophysiologie</td></tr><tr><td>Schwingungsisolationstabelle&nbsp;</td><td>Newport</td><td>n.a.Elektrophysiologie</td><td></td></tr> <tr><td>Mikromanipulatoren (manuell betätigt)</td><td>Siskiyou&nbsp;</td><td>MX130</td><td>Elektrophysiologie (LFP)</td></tr><tr><td>Mikromanipulatoren (automatisiert)</td><td>Siskiyou&nbsp;</td><td>MC1000e</td><td>Elektrophysiologie (Patch)</td></tr><tr><td>Audiomonitor&nbsp;</td><td>A-M Systems</td> Model <td>3300</td><td>Elektrophysiologie</td></tr><tr><td>Mikropipette/Patch-Pipettenabzieher</td><td>Sutter</td><td>P-97</td><td>Elektrophysiologie</td></tr><tr><td>Speziell angefertigtes aufrechtes Fluoreszenzmikroskop</td><td>Siskiyou</td><td>n.a.Imaging</td><td></td></tr> <tr><td>Analoge Videokamera</td><td>COHU</td><td>4912-2000/0000</td><td>Imaging</td></tr><tr><td>Digitaler Framegrabber mit Imaging-Software</td><td>EPIX, Inc</td><td>PIXCI-SV7</td><td>Bildgebung</td></tr><tr><td>Olympus 2.5X Objektiv</td><td>Olympus</td><td>MPLFLN</td><td>Bildgebung</td></tr><tr><td>Olympus 40X Wasser-Immersionsobjektiv</td><td>Olympus</td><td>UIS2 LUMPLFLN</td><td>Imaging</td></tr><tr><td>Maßgeschneidertes Leuchtdiodensystem (LED)</td><td>kundenspezifische</td><td>n.a.optogenetische</td> <td>Stimulation (Amhilon et al., 2015)</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company<</td><td>strong>Katalognummer</td><td><>Kommentare</td></tr><tr><td>Tiere</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PV::Cre (KI) Mäuse</td><td>Jackson Laboratory</td><td>Lagernummer 008069</td><td>Zulassen&nbsp; Cre-gerichtete Genexpression in PV-Interneuronen</td></tr><tr><td>Konstitutiv-bedingte Ai9-Mäuse (R26-lox-stop-lox-tdTomato (KI))</td><td>Jackson Laboratory</td><td>Aktiennummer 007905</td><td>Exprimieren Sie TdTomato nach Cre-vermittelter Rekombination</td></tr><tr><td>Ai32-Mäuse (R26-lox-stop-lox-ChR2(H134R)-EYFP</td><td>Jackson Laboratory</td><td>stock Anzahl 012569</td><td>Exprimieren Sie das verbesserte Kanalrhodopsin-2/EYFP-Fusionsprotein nach Exposition gegenüber Cre Rekombinase</td></tr><tr><td>PVChY-Mäuse</td><td>Inhouse-Zucht</td><td>n.a.</td> <td>Nachkommen aus der Kreuzung der PV-Cre-Linie mit Ai32-Mäusen (R26-lox-stop-lox-ChR2(H134R)-EYFP</td></tr></tbody></table>

tuning in der hippocampal theta band<em&gt; in vitro</em&gt;: methoden für die aufnahme aus dem isolierten nagetier septohippocampal circuit

Tuning in the Hippocampal Theta Band In Vitro: Methodologies for Recording from the Isolated Rodent Septohippocampal Circuit

Dieses Protokoll beschreibt die Verfahren für die Vorbereitung und Aufzeichnung aus dem isolierten ganzen Hippocampus, von WT und transgenen Mäusen, zusammen mit den jüngsten Verbesserungen in Methoden und Anwendungen für das Studium der Theta-Oszillationen. Es wird eine einfache Charakterisierung des isolierten Hippocampuspräparates vorgestellt, wobei die Beziehung zwischen internen hippocampalen Theta-Oszillatoren zusammen mit der Aktivität von Pyramidenzellen und GABAergischen Interneuronen der Cornu-Ammoni-1 (CA1) und Subiculum (SUB) -Flächen untersucht wird. Insgesamt zeigen wir, dass der isolierte Hippocampus in der Lage ist, intrinsische Theta-Oszillationen in vitro zu erzeugen, und die innerhalb des Hippocampus erzeugte Rhythmizität kann durch optogenetische Stimulation von parvalbumin-positiven (PV) Interneuronen präzise manipuliert werden. Die in vitro isolierte Hippocampuspräparation bietet eine einmalige Gelegenheit, simultane Feld- und intrazelluläre Patch-Clamp-Aufnahmen von visuell identifiziertem neu zu verwendenRons, um die Mechanismen zu verstehen, die der Theta-Rhythmus-Generation zugrunde liegen.

<html> Dieser Abschnitt veranschaulicht Beispiele für Ergebnisse, die durch das Studium der Theta-Oszillationen in der Maus isolierten Hippocampus-Präparation in vitro erhalten werden können . Das Sektionsverfahren zum Extrahieren des isolierten Hippocampus ist in Fig. 1 dargestellt . Mit dieser Vorbereitung können intrinsische Theta-Oszillationen bei der Platzierung von Mehrfachfeld-Elektroden untersucht werden, wobei die Gesamtaktivität und die syn...

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Aufzeichnung von rhythmischen neuronalen Netzwerk-Theta und Gamma-Oszillationen aus einer isolierten ganzen Hippocampus-Präparation. Wir beschreiben die experimentellen Schritte von der Extraktion des Hippocampus bis hin zu Details der Feld-, Einheits- und Ganzzell-Patch-Clamp-Aufnahmen sowie der optogenetischen Stimulation des Theta-Rhythmus.

Tuning in der Hippocampal Theta Band<em&gt; In vitro</em&gt;: Methoden für die Aufnahme aus dem isolierten Nagetier Septohippocampal Circuit

This protocol outlines the procedures for preparing and recording from the isolated whole hippocampus, of WT and transgenic mice, along with recent ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, Verfahren zur Gewinnung der gesamten hippocampalen Aufbereitung vorzustellen und die Erzeugung rhythmischer neuronaler Netzwerke mittels Feld-, Einzelneuron- und Patch-Clamp-Ableitungen sowie optogenetischer Stimulation zu untersuchen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen auf dem neurowissenschaftlichen Gebiet des Lernens und Gedächtnisses zu beantworten, indem sie die Untersuchung zellulärer und synaptischer Mechanismen, die rhythmischen Oszillationen im Hippocampus zugrunde liegen, erheblich erleichtert. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie eine optimierte Aufbereitung nutzt, um die Schaltkreise detailliert zu erforschen, die eine entscheidende Rolle bei der hippocampal-abhängigen Informationsverarbeitung im Gedächtnis spielen.Um dieses Verfahren zu beginnen, stellen Sie das Gehirn in aufrechter Position auf die Präparierschale, entfernen Sie das Kleinhirn mit einem Rasiermesser, schneiden Sie das Gehirn entlang der mittleren sagittalen Ebene in zwei Hälften und geben Sie die beiden isolierten Hemisphären zurück in die Haltekammer. Danach stellen Sie die einzelne halbierte Gehirnhälfte aufrechter auf die Präparierschale. Drehen Sie die Schale, bis die mittelsagittalen Strukturen dem Experimentator zugewandt sind und die eingebettete Kontur des septalen Komplexes als dünne, birnenförmige Gewebeschicht innerhalb des Thalamus sichtbar ist.Danach ein beschichtetes Spatel unter das Septum einführen und die Spitze nach unten bewegen, bis die Präparierschale erreicht ist, und die Fasern durchtrennen, die den septalen Bereich verbinden. Wiederholen Sie nun denselben Vorgang entlang der vorderen Kante des Septums und schneiden Sie die Fasern durch, die mit dem frontalen Teil des Gehirns verbunden sind. Während das Spatel den inneren Teil der Hirnrinde direkt über dem Hippocampus leicht in aufrechter Position hält, verwenden Sie das Mikrospeer, um vorsichtig die thalamischen, hypothalamischen und die verbleibenden Kerne des Hirnstamms nach unten zu ziehen.Anschließend mit dem Spatel das abgezogene Gewebe abschneiden und entfernen. Danach den beschichteten Spatel in das Seitenventrikel unterhalb des rostralen Endes des dorsalen Hippocampus einführen. Den Spatel horizontal halten, ausgerichtet mit der mittleren Sagittalebene des halbierten Gehirns, und entlang des glatten Verlaufs der Ventrikelwände schieben, bis die Spitze freundschaftlich hervortritt.Halten Sie das Spatel unterhalb des Hippocampus und drücken Sie es leicht auf die verbindenden Fasern entlang der inneren Schicht, an der der Hippocampus mit der darüberliegenden Hirnrinde verbunden ist. Anschließend setzen Sie das Mikrospatel auf der äußeren Seite dieser Schicht an und drücken es gegen das beschichtete Spatel, um die verbindenden Fasern durchzuschneiden. Um die Gewinnung abzuschließen, drehen Sie die Schnappschale und schieben das beschichtete Spatel unterhalb des ventralen Hippocampus ein. Halten Sie den Hippocampus vorsichtig mit dem Spatel fest und durchtrennen Sie die endokrinen Verbindungen mit einer Schneidbewegung entlang des Spatels.Nach Abschluss der Isolation das Hippocampus im Schälchen liegen lassen und einen Tropfen eiskalte Saccharoslösung hinzufügen, um es kühl zu halten. Vorsichtig den verbleibenden Kortex und die Fasern abschneiden und den Hippocampus vom Septum trennen, indem man vorsichtig mit einer Rasierklinge am Fornix ansetzt. Danach das Präparat in eine Saccharoslösung bei Raumtemperatur überführen und 15 bis 30 Minuten lang regenerieren lassen, bevor es in die Ableitungskammer übertragen wird.In diesem Schritt richten Sie das gravitationsgesteuerte Perfusionsystem ein, um einen kontinuierlichen, schnellen Zufluss von oxygeniertem ACSF zu ermöglichen. Anschließend stoppen Sie den ACSF-Zufluss und übertragen den Hippocampus mit dem breiten Ende einer Glaspipette in die Ableitkammer. Lassen Sie die mit Saccharose gesättigte Probe absinken und sich am Boden absetzen.Platzieren Sie das Präparat in der Mitte der Ableitungskammer, wobei die glatte Oberfläche von CA1 und Subikulum nach oben zeigt. Stabilisieren Sie den Hippocampus mit kleinen Gewichten an den septalen und temporalen Enden und starten Sie den ACSF-Durchfluss erneut. Senken Sie in diesem Schritt die LFP-Elektrode auf die Oberfläche des Hippocampus ab.Verschieben Sie die LFP-Elektrode durch die Parametrie-Schicht und beobachten Sie den Anstieg der extrazellulären Aktivität in Form von Einzelaktionspotentialen einzelner Neuronen. Senken Sie die Elektrode weiter ab und beachten Sie, dass die Aktivität erneut abnimmt, sobald die Spitze in die Radiatum-Schicht eindringt. Beobachten Sie, dass eine deutlich sichtbare Netzwerk-Oszillation im Theta-Frequenzbereich sichtbar wird und ihre maximale Amplitude erreicht, während die Aufnahmestelle durch das Radiatum abgesenkt wird.Um die räumlichen Eigenschaften spontaner Theta-Oszillationen in der CA1-Region zu untersuchen, platzieren Sie eine zweite LFP-Elektrode an einer CA1-Stelle und beobachten Sie, dass sich die CA1-Theta-Oszillationen über große Distanzen synchronisieren. Um die Eigenschaften der Theta-Oszillationen über die hippocampalen Schichten hinweg zu untersuchen, belassen Sie eine Referenz-LFP-Elektrode in einer CA1-Radiatum-Stelle. Senken Sie ausgehend knapp oberhalb der Stratum oriens eine zweite Elektrode in die pyramidale Zellschicht und durch das Radiatum.Beobachten Sie eine allmähliche Inversion des LFP-Signals über die Plexiformschicht. Um Gammaband-Oszillationen und Theta-Gamma-Kopplung im intakten Hippocampus zu untersuchen, platzieren Sie eine Feldelektrode an der Grenze zwischen CA1 und Subikulum und senken Sie sie ab, bis sie an der Grenzfläche zwischen Plexiform- und Molekularschicht liegt. Auf dieser Ebene kann ein Feldpotential aufgezeichnet werden, das klare Gammaband-Oszillationen zeigt, deren Amplitudenänderungen phasengekoppelt an den lokalen Theta-Rhythmus sind.Danach die Skalierung anpassen, um die langsame Zeitskala der Theta-Gamma-Kopplung zu beobachten. Beachten Sie, dass Gamma-Ausbrüche in zwei unterschiedlichen Frequenzbändern auftreten, die durch Bandfilterung des laufenden LFP-Signals im Bereich des langsamen und schnellen Gamma sichtbar gemacht werden können. Für Ganzzell-Patch-Clamp-Aufnahmen während in-vitro-Hippocampus-Theta-Oszillationen verwenden Sie die Fluoreszenz-Videomikroskopie mit niedriger und hoher Vergrößerung, um tdTomato-positive Interneurone zu visualisieren, die sich nahe der Oberfläche einer Hippocampus-Präparation aus einer PV-tom-Maus befinden.Unter der Ansicht mit niedriger Vergrößerung des Hippocampus platzieren Sie eine LFP-Elektrode im CA1-Subikulum, um Theta-Oszillationen zu überwachen, während Sie sich auf Patch-Clamp-Experimente vorbereiten. Wechseln Sie dann zu einer 40fachen Vergrößerung und tauchen Sie das Objektiv über dem Zielbereich ein. Senken Sie es ab, bis die oberen Schichten sichtbar werden. Wählen Sie unter Fluoreszenzmikroskopie die fluoreszierende PV-tom-Zelle aus und nähern Sie sich dieser mit einer Patch-Pipette, die mit einer Standard-Intrazellulärlösung gefüllt ist.Befinden Sie sich einmal im Ganzzell-Konfigurationsmodus, untersuchen Sie die physiologischen Eigenschaften der identifizierten PV-Zelle während spontaner hippocampaler Oszillationen. Beobachten Sie die intrazelluläre Membranpotenzial-Aufnahme von PV-Zellen, die sich durch schnelles Feuerverhalten und Burst von Aktionspotentialen auszeichnen, die synchron zur laufenden Theta-Rhythmik von CA1-Subikulum sind. Platzieren Sie in diesem Verfahren eine LFP-Elektrode im Bereich CA1-Subikulum und führen Sie eine Anheftung (Patch) an einer benachbarten Parameterzelle im isolierten Hippocampus einer Maus durch, die das blaulichtempfindliche, erregende Opsin CHR2 in PV-Interneuronen exprimiert.Platzieren Sie einen optischen Lichtwellenleiter über der hippocampalen Präparation und zentrieren Sie ihn auf dem aufgezeichneten Bereich. Verwenden Sie blaues Licht einer LED-Quelle für die optogenetische Stimulation, die aus 10 bis 20 Millisekunden langen Lichtimpulsen oder Sinuswellen-Spannungsbefehlen besteht, die mit Theta-Frequenzen appliziert werden. Charakterisieren Sie im Strom-Klemm-Modus die Aktivität der aufgezeichneten Zelle während spontaner Theta-Oszillationen.Dann starten Sie das Stimulationsprotokoll und nehmen Sie die Lichtantworten auf. Beobachten Sie, dass Feldoszillationen und synaptische Aktivität sowie das aufgezeichnete Neuron während der optogenetischen Stimulation zunehmend synchronisiert werden und dass ein rhythmisches Ansteuern der PV-Zellen eine robuste Kontrolle sowohl der Frequenz als auch der Leistung von Theta-Oszillationen bewirkt. Dargestellt ist hier die elektrophysiologische Aktivität, die von einer Parameterzelle während Theta-Oszillationen aufgezeichnet wurde.Die Spikes in der Stromklemme zeigen spontane, aber nicht rhythmische Feueraktivität im Ruhezustand sowie inhibitorische postsynaptische Potentiale, die nicht eindeutig mit der langsam entstehenden LFP-Oszillation synchronisiert waren. Spannungsklemmaufnahmen zeigen, dass die entsprechenden inhibitorischen postsynaptischen Ströme ein Umkehrpotential bei etwa minus 70 Millivolt aufweisen. Und hier ist die elektrophysiologische Aktivität, die von einem fluoreszierenden schnellschaltenden PV-Interneuron während Theta-Oszillationen aufgezeichnet wurde.Im Stromklemmbetrieb feuerte diese Zelle spontan im Ruhezustand und wurde stark durch rhythmische exzitatorische postsynaptische Potentiale getrieben, die phasenverschoben mit der stabilen LFP-Oszillation gekoppelt waren. Bei Spannungsklemmaufnahmen betrug das Umkehrpotential des exzitatorischen postsynaptischen Stroms etwa null Millivolt. Sobald die Technik beherrscht ist, kann sie innerhalb von zwei bis drei Stunden durchgeführt werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die Lösung kräftig zu oxygenieren und ein Perfusionsystem zu verwenden, das einen schnellen, aber stabilen Fluss von angereichertem ACSF über das Präparat während der elektrophysiologischen Ableitungen ermöglicht.Nach Durchführung dieses Verfahrens können andere Methoden wie die optogenetische Stimulation oder Hemmung spezifischer Zelltyp-Populationen angewendet werden, um weitere Fragen zu beantworten, beispielsweise die Identifizierung der zellulären Subtypen, die Theta-Oszillatoren im Hippocampus bilden. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Forschern auf dem Gebiet der Neurowissenschaften den Weg, um systematisch die Dynamik der Theta-Oszillationen entlang der septotemporalen Achse des Hippocampus in vitro zu untersuchen. Nach dem Ansehen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine vollständige Hippocampus-Präparation gewinnt, um die Funktion rhythmischer neuronaler Netzwerke mittels Feld-, Einzelzell- und Patch-Clamp-Ableitungen sowie optogenetischer Stimulation zu untersuchen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Dieses Video demonstriert ein Protokoll zur Modulation von Theta-Oszillationen in einem gentechnisch veränderten Mausmodell mit lichtempfindlichen Ionenkanälen in seinen GABAergen medialen Septumneuronen. Durch die Abgabe von Lichtimpulsen an den Hippocampus zielt das Protokoll darauf ab, die neuronale Aktivität zu synchronisieren und Theta-Oszillationen zu erzeugen, die als lokale Feldpotentiale aufgezeichnet werden.

Selektive Manipulation von Theta-Oszillationen in einem Mausmodell

Dieses Video zeigt eine Methode zur Aufzeichnung von CA3-CA1 synaptischen Reaktionen in einem Hippocampus-Schnitt der Ratte. Es beschreibt die Schritte, die zum Platzieren der Stimulations- und Aufzeichnungselektroden auf dem Hippocampus-Schnitt und zur Messung des exzitatorischen postsynaptischen Feldpotentials (fEPSP) erforderlich sind, um die Stärke der synaptischen Reaktion zu beurteilen.

Aufzeichnung synaptischer Reaktionen von CA3-CA1 in einem Hippocampus-Schnitt der Ratte

Dieses Video zeigt die stereotaktische Implantation eines Drahtelektrodenarrays und einer optischen Faser in den Hippocampus eines Mausmodells.

Implantation eines Elektrodenarrays und einer optischen Faser in den Hippocampus der Maus

Dieses Video zeigt die Aufzeichnung von rhythmischen neuronalen Netzwerkaktivitäten, auch bekannt als Theta-Oszillationen, in einem isolierten Hippocampus. Elektroden werden in verschiedene Schichten und räumliche Positionen eingeführt, um Theta-Oszillationen zu erkennen und zu analysieren. Dies zeigt die einzigartige neuronale Zusammensetzung und die Konnektivität des neuronalen Netzwerks über verschiedene Schichten des Hippocampus hinweg.

In vitro Aufzeichnung von Theta-Oszillationen im Hippocampus der Maus

Dieses Video demonstriert die Methode, die Optogenetik zu nutzen, um die Netzwerkdynamik des Hippocampus zu modulieren, indem genetisch veränderte lichtempfindliche Interneuronen in einem Maushirnschnitt aktiviert werden, die Synchronisation der Theta-Oszillation verbessert und das Verhalten neuronaler Schaltkreise untersucht wird.

Optogenetische Kontrolle der Netzwerkdynamik im Hippocampus

Theta-Aktivität im Hippocampus hängt mit spezifischen kognitiven und Verhaltensstadien zusammen. In dieser Arbeit beschreiben wir eine analytische Methode zur Detektion hochorganisierter Theta-Oszillationen innerhalb des Hippocampus unter Verwendung eines Zeit-Frequenz-basierten Ansatzes (d.h. Wavelet-Analyse).

Automatische Erkennung von hochorganisierten Theta Oszillationen im Murine EEG

Wir beschreiben die Verwendung der optogenetik und elektrophysiologische Aufnahmen für gezielte Manipulationen der hippocampal Theta Schwingungen (5 bis 10 Hz) im Verhalten Mäuse. Die Wirksamkeit von Rhythmus mitreißen wird mit lokalen Feldes Potenzial überwacht. Eine Kombination von Opto und pharmakogenetischen Hemmung befasst sich mit das ableitenden Auslesen der hippocampalen Synchronisation.

Optogenetische Mitnahme von Hippocampal Theta Schwingungen im Verhalten der Mäuse

Wir veranschaulichen, Aufzeichnungs- und elektrische Modulation von 4-Aminopyridine-induzierte epileptiformen Aktivität in Nagetier Gehirnscheiben mit Mikroelektrode Arrays durchzuführen. Eine benutzerdefinierte Aufnahme Kammer unterhält Gewebe Lebensfähigkeit während längerer experimentelle Sessions. Elektrode Zuordnung zu leben und Auswahl an anregenden Paare von eine benutzerdefinierte Benutzeroberfläche durchgeführt werden.

Aufnahme und Modulation der Epileptiformen Aktivität in Nagetier Gehirnscheiben gekoppelt mit Mikroelektrode Arrays

Dieses Protokoll beschreibt die Aufzeichnung des lokalen Feldes Potentiale mit Multi-Schaft, die lineare Silicon-Sonden. Umwandlung der Signale mit Hilfe der aktuellen Quelle dichteanalyse ermöglicht die Rekonstruktion der lokalen elektrischen Aktivität im Hippocampus Maus. Mit dieser Technik können räumlich begrenzten Gehirn Schwingungen frei beweglichen Mäusen untersucht werden.

Aufzeichnung von räumlich eingeschränkt Schwingungen im Hippocampus Verhalten der Mäuse

Wir verwendeten Aufnahme- und Stimulationselektroden in Längs-Hippocampus-Gehirnscheiben und längs positionierten Aufnahme- und Stimulationselektroden im dorsalen Hippocampus in vivo, um extrazelluläre postsynaptische Potenziale zu evozieren und langfristige synaptische Plastizität entlang des Längsinterlamellars CA1.

Untersuchung der langfristigen synaptischen Plastizität im Interlamellar Hippocampus CA1 durch elektrophysiologische Feldaufzeichnung

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung eines speziell entwickelten Aufzeichnungsgeräts und von Elektroden zur Aufzeichnung lokaler Feldpotentiale und zur Untersuchung des Informationsflusses im Hippocampus der Maus und im präfrontalen Kortex.

Duale extrazelluläre Aufzeichnungen im Hippocampus der Maus und im präfrontalen Kortex

Lernen Sie Methoden zur Aufzeichnung hippocampaler Theta-Oszillationen im isolierten Septohippocampalen Schaltkreis von Nagetieren mittels Patch-Clamp und optogenetischer Stimulation.

Tuning in der Hippocampal Theta Band

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