Tuning in der Hippocampal Theta Band In vitro: Methoden für die Aufnahme aus dem isolierten Nagetier Septohippocampal Circuit

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Aufzeichnung von rhythmischen neuronalen Netzwerk-Theta und Gamma-Oszillationen aus einer isolierten ganzen Hippocampus-Präparation. Wir beschreiben die experimentellen Schritte von der Extraktion des Hippocampus bis hin zu Details der Feld-, Einheits- und Ganzzell-Patch-Clamp-Aufnahmen sowie der optogenetischen Stimulation des Theta-Rhythmus.

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, Verfahren zur Extraktion des gesamten Hippocampus-Präparats vorzustellen und die Generierung eines rhythmischen neuronalen Netzwerks unter Verwendung von Feld-, Uni- und Patch-Clamp-Aufzeichnungen sowie optogenetischer Stimulation zu erforschen. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im neurowissenschaftlichen Bereich des Lernens und des Gedächtnisses zu beantworten, indem sie die Untersuchung zellulärer und synaptischer Mechanismen, die den rhythmischen Schwingungen im Hippocampus zugrunde liegen, erheblich erleichtert. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine optimierte Präparation verwendet, um die Schaltkreise in detaillierten Schwingungen zu untersuchen, die eine entscheidende Rolle bei der hippocampusabhängigen Gedächtnisinformation spielen.

Um diesen Vorgang zu beginnen, legen Sie das Gehirn in aufrechter Position auf die Sezierschale, entfernen Sie das Kleinhirn mit einer Rasierklinge, schneiden Sie dann das Gehirn entlang der mittleren Sagittalebene in zwei Hälften und bringen Sie die beiden isolierten Hemisphären wieder in die Haltekammer zurück. Legen Sie als Nächstes das einzelne hemisezierte Gehirn aufrecht auf die Sezierschale. Drehen Sie die Schale, bis die mittleren sagittalen Strukturen dem Experimentator zugewandt sind und der eingebettete Umriss des Septumkomplexes als dünne birnenförmige Schicht aus Gewebeinnerem des Thalamus sichtbar ist.

Führen Sie dann einen beschichteten Spatel unter das Septum ein und bewegen Sie die Spitze nach unten, bis die Sezierschale erreicht ist, durchtrennen Sie die Fasern, die den Septumbereich herzlich verbinden. Wiederholen Sie nun die gleiche Operation entlang des vorderen Randes des Septums und schneiden Sie die Fasern durch, die mit dem vorderen Teil des Gehirns verbunden sind. Während der Spatel den inneren Teil der Hirnrinde leicht über dem Hippocampus in aufrechter Position hält, ziehen Sie mit dem Mikrospatel vorsichtig den Thalamus, den Hypothalamus und die verbleibenden Hirnstammkerne nach unten.

das abgezogene Gewebe mit dem Spatel abschneiden und entfernen. Führen Sie anschließend den beschichteten Spatel in den lateralen Ventrikel unterhalb des rostralen Endes des dorsalen Hippocampus ein. Halten Sie den Spatel waagerecht, ausgerichtet auf die mittlere Sagittalebene des halbierten Gehirns, und schieben Sie ihn durch die glatte Kontur der Ventrikelwände, bis die Spitze herzlich herauskommt.

Halten Sie den Spatel unter den Hippocampus und drücken Sie ihn leicht auf die Verbindungsfasern entlang der inneren Schicht, wo sich der Hippocampus mit dem darüber liegenden Kortex verbindet, dann tragen Sie den Mikrospatel auf die Außenseite dieser Schicht auf und drücken Sie ihn gegen den beschichteten Spatel, um die Verbindungsfasern zu durchschneiden. Um die Extraktion abzuschließen, drehen Sie die Sezierschale und führen Sie den beschichteten Spatel unter den ventralen Hippocampus ein. Halten Sie den Hippocampus mit dem Spatel leicht fest und schneiden Sie die endokrinen Verbindungen mit einer Schnittbewegung gegen den Spatel durch.

Sobald die Isolierung abgeschlossen ist, lassen Sie den Hippocampus auf der Schale ruhen und fügen Sie einen Tropfen eiskalte Saccharoselösung hinzu, um sie kühl zu halten. Schneiden Sie vorsichtig alle verbleibenden Rinde und Fasern ab und trennen Sie den Hippocampus vom Septum, indem Sie vorsichtig eine Rasierklinge auf den Fornix auftragen. Übertragen Sie danach das Präparat in eine Saccharoselösung bei Raumtemperatur und lassen Sie es 15 bis 30 Minuten lang ziehen, bevor Sie es in die Aufnahmekammer überführen.

Richten Sie in diesem Schritt das Schwerkraftperfusionssystem so ein, dass ein kontinuierlicher Fluss von sauerstoffhaltigem ACSF mit hoher Geschwindigkeit möglich ist. Stoppen Sie als Nächstes den ACSF-Fluss und übertragen Sie den Hippocampus mit dem breiten Ende einer Glaspipette in die Aufnahmekammer. Lassen Sie die mit Saccharose gesättigte Zubereitung absinken und setzen Sie sich am Boden ab.

Platzieren Sie das Präparat in der Mitte der Aufnahmekammer, mit der glatten Oberfläche von CA1 und Subiculum darüber. Stabilisieren Sie den Hippocampus mit kleinen Gewichten der septalen und temporalen Extremitäten und starten Sie den ACSF-Fluss neu. Senken Sie bei diesem Verfahren die LFP-Elektrode auf die Oberfläche des Hippocampus ab.

Schieben Sie die LFP-Elektrode durch die Parameterschicht und beobachten Sie die Zunahme der extrazellulären Spike-Aktivität, wenn eine einzelne Entladung von einzelnen Neuronen detektiert wird. Senken Sie die Elektrode weiter ab und beachten Sie, dass die Spitzenbildung wieder zu verblassen beginnt, wenn die Spitze in das Radiatom übergeht. Es ist zu beobachten, dass eine deutlich sichtbare Netzwerkschwingung im Theta-Frequenzbereich sichtbar wird und die maximale Amplitude erreicht, wenn der Aufnahmeort durch das Radiatom abgesenkt wird.

Um die räumlichen Eigenschaften spontaner Theta-Oszillationen in der CA1-Region zu testen, platzieren Sie eine zweite LFP-Elektrode an einer CA1-Stelle und beobachten Sie, wie sich die CA1-Theta-Oszillationen über große Entfernungen synchronisieren. Um die Eigenschaften von Theta-Oszillationen über Hippocampus-Schichten zu testen, belassen Sie eine LFP-Referenzelektrode in einer CA1-Radiatom-Stelle. Beginnend knapp oberhalb des Stratum oriens wird eine zweite Elektrode in die Parameterzellschicht und durch das Radiatom abgesenkt.

Beobachten Sie eine allmähliche Inversion des LFP-Signals über die Parameterebene. Um Gamma-Oszillationen und Theta-Gamma-Kopplung im intakten Hippocampus zu testen, platzieren Sie eine Feldelektrode an der Grenze des CA1-Subiculums und senken Sie sie ab, bis sie an der Grenzfläche zwischen der Parameter- und der Molekülschicht sitzt. Auf diesem Niveau kann ein Feldpotential aufgezeichnet werden, das deutliche Gamma-Oszillationen mit Änderungen der Amplitude zeigt, die an den lokalen Theta-Rhythmus gekoppelt sind.

Passen Sie dann die Skalierung an, um die langsame Zeitskala der Theta-Gamma-Kopplung zu beobachten. Beachten Sie, dass Gamma-Bursts in zwei unterschiedlichen Frequenzbändern auftreten, die während des laufenden LFP-Signals im langsamen und schnellen Gammabereich je nach Band sichtbar sein können. Verwenden Sie für die Aufzeichnung von Ganzzell-Patch-Clamps während in vitro hippokampalen Theta-Oszillationen die Fluoreszenz-Videomikroskopie mit geringer und hoher Vergrößerung, um tdTomato-positive Interneuronen sichtbar zu machen, die sich in der Nähe der Oberfläche eines Hippocampus-Präparats einer PV-Tom-Maus befinden.

Platzieren Sie unter geringer Vergrößerung des Hippocampus eine LFP-Elektrode im CA1-Subiculum, um Theta-Oszillationen zu überwachen, während Sie sich auf Patch-Clamp-Experimente vorbereiten. Wechseln Sie dann zur 40-fachen Vergrößerung und tauchen Sie das Objektiv über den Zielbereich. Senken Sie es ab, bis die oberen Schichten sichtbar werden, wählen Sie unter der Fluoreszenzmikroskopie die fluoreszierende PV-Tom-Zelle aus und nähern Sie sich mit einer Patch-Pipette, die mit interzellulärer Standardlösung gefüllt ist.

Sobald sich die gesamte Zelle in der Konfiguration befindet, untersuchen Sie die physiologischen Eigenschaften der identifizierten PV-Zelle während spontaner Hippocampus-Oszillationen. Beobachten Sie die Aufzeichnung des intezellulären Membranpotentials von PV-Zellen, die sich durch schnelles Spike-Verhalten und Ausbrüche von Aktionspotentialen auszeichnen, die mit dem laufenden CA1-Subiculum-Theta-Rhythmus synchronisiert sind. Bei diesem Verfahren wird eine LFP-Elektrode im Bereich des CA1-Subiculums platziert und eine nahe gelegene Parameterzelle im isolierten Hippocampus einer Maus gepatcht, wodurch das blaulichtempfindliche exzitatorische Opcin CHR2 in PV-Interneuronen exprimiert wird.

Platzieren Sie einen Lichtleiter aus Glasfaser über dem Hippocampuspräparat und zentrieren Sie ihn auf den aufgenommenen Bereich. Verwenden Sie blaues Licht von einer LED-Quelle für die optische genetische Stimulation, die aus Lichtimpulsen von 10 bis 20 Millisekunden oder Sinwellenspannungsbefehlen besteht, die bei Theta-Frequenzen abgegeben werden. In der Stromklemme ist die Aktivität der aufgezeichneten Zelle während spontaner Theta-Oszillationen zu charakterisieren.

Starten Sie dann das Stimulationsprotokoll und zeichnen Sie die Lichtreaktionen auf. Es ist zu beobachten, dass Feldschwingungen und synaptische Aktivität und das aufgezeichnete Neuron während der optogenetischen Stimulation zunehmend synchronisiert werden und dass die rhythmische Stimulation von PV-Zellen zu einer robusten Kontrolle sowohl der Frequenz als auch der Leistung von Theta-Oszillationen führt. Hier ist die elektrophysiologische Aktivität zu sehen, die von einer Parameterzelle während Theta-Oszillationen aufgezeichnet wurde.

Current Clamp Traces zeigt ein spontanes, aber nicht rhythmisches Feuern in Ruhe und inhibitorische postsynaptische Potentiale, die nicht eindeutig mit der langsam entstehenden LFP-Oszillation synchronisiert waren. Aufzeichnungen von Spannungsklemmen zeigen, dass die entsprechenden hemmenden postsynaptischen Ströme das Umkehrpotential bei etwa minus 70 Millivolt haben. Und hier ist die elektrophysiologische Aktivität, die von einem schnell stachelnden fluoreszierenden PV-Interneuron während Theta-Oszillationen aufgezeichnet wurde.

In der Stromklemme feuerte diese Zelle spontan in Ruhe und wurde stark von rhythmischen exzitatorischen postsynaptischen Potentialen angetrieben, die phasenweise mit der stabilen LFP-Oszillation gekoppelt waren. In Spannungsklemmenaufzeichnungen lag das exzitatorische postsynaptische Stromumkehrpotential ungefähr bei null Millivolt. Sobald diese Technik gemeistert ist, kann sie in zwei bis drei Stunden durchgeführt werden, während Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, eine Lösung kräftig mit Sauerstoff zu versorgen und ein Perfusionssystem zu verwenden, das einen schnellen, aber stetigen Fluss von bewaffneten ACSF über das Präparat während der elektrophysiologischen Aufzeichnungen ermöglicht.

Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie die optogenetische Stimulation oder das Silencing bestimmter Zelltyppopulationen verwendet werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B. die Identifizierung der zellulären Subtypen, die Theta-Oszillatoren im Hippocampus bilden. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik Forschern im Bereich der Neurowissenschaften den Weg, die Dynamik von Theta-Oszillationen über die septale Zeitachse des Hippocampus in vitro systematisch zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein ganzes Hippocampus-Präparat extrahiert, um die Funktion rhythmischer neuronaler Netzwerke mithilfe von Feld-, Einheiten- und Patch-Clamp-Aufzeichnungen sowie optogenetischer Stimulation zu erforschen.