Chemo-enzymatische Synthese von N- Glykanen für Array-Entwicklung und HIV-Antikörper-Profiling

Das übergeordnete Ziel dieser Methodik besteht darin, einen modularen chemo-enzymatischen Ansatz für die Synthese von N-Glykanen zu entwickeln, indem ein neues Glykan-Mikroarray auf einem mit Aluminiumoxid beschichteten Glasobjektträger erstellt wird, um die Bindung heterogener Glykane an HIV-Antikörper nachzuweisen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen der Glykobiologie zu beantworten, insbesondere bei der Identifizierung von virus- und zellspezifischen Glykanen für die weitere Entwicklung. Der entscheidende Vorteil dieser Methode liegt darin, schwache Bindungen zu detektieren und Gemische von Zuckern zu identifizieren, die an ein Protein binden, beispielsweise an Antikörper von HIV-Patienten.

Die Auswirkungen dieser Technik erstrecken sich auf die Diagnose von Influenza-Infektionen, da Sialinsäure abbauende Enzyme auf menschlichen Atemwegs-Epithelzellen exprimiert werden und Gewebe häufig betroffen sind, während die Symptome bestehen. Daher wird ein Glykoarray ein ideales Werkzeug sein, um die Spezifität wilder Subtypen zu bestimmen. Obwohl diese Methode Einblicke in die Glykan-Spezifitäten von HIV-Antikörpern liefern kann, ist sie auch auf andere Systeme anwendbar, beispielsweise auf die Diagnose verschiedener Krebserkrankungen anhand des Bindungsmusters menschlicher Serumantikörper gegenüber auf der Oberfläche aufgebrachten menschenspezifischen Serumantigenen.

Um dieses Verfahren zu beginnen, geben Sie 2–5 µmol zuvor hergestelltes Glykan in einen 5-milliliter-Rundkolben. Fügen Sie einen magnetischen Rührstab zum Kolben hinzu und verschließen Sie ihn mit einem Gummi-Septum. Geben Sie 400 µL frisch getrocknetes DMF und 10–25 µmol der phosphonischen Säure-Verbindung zum Kolben hinzu.

Anschließend rühren Sie das Reaktionsgemisch fünf Stunden lang mit 800 U/min. Sobald die Reaktion abgeschlossen ist, verdampfen Sie das Lösungsmittel mithilfe eines Rotationsverdampfers bei einem Vakuumdruck von fünf bis 10 Millibar und einer Temperatur von 40 Grad Celsius. Danach lösen Sie das getrocknete Reaktionsgemisch in 0,5 Milliliter Wasser auf und geben es auf ein Polyacrylamidgelbett.

Eluieren Sie die Produkte mit Wasser und sammeln Sie Fraktionen von ein bis zwei Milliliter. Um die gesammelten Fraktionen mittels Dünnschichtchromatographie (TLC) zu überprüfen, geben Sie jede Fraktion auf eine TLC-Platte und tauchen Sie die Platte in 0,25 molares Cerammoniummolybdat. Erhitzen Sie die angefärbte Platte mit einem Heizblock, um das Produkt sichtbar zu machen.

Nach dem Zusammenführen der produktenthaltenden Fraktionen und dem Einfrieren der Lösung wird das Produkt durch Biofolisierung als weißes Pulver erhalten. Danach wird das getrocknete Produkt in zwei Milliliter Wasser gelöst und Palladiumhydroxid zugegeben. Ein mit Wasserstoff gefülltes Ballon wird an den Kolben angebracht, und das Reaktionsgemisch wird 15 Stunden lang unter Wasserstoffatmosphäre bei 800 U/min gerührt.

Nach Abschluss der Reaktion filtrieren Sie das Gemisch durch ein Celite-Bett und waschen es mit zwei Milliliter Methanol und zwei Milliliter destilliertem, deionisiertem Wasser. Anschließend verdampfen Sie das Lösungsmittel mittels eines Rotationsverdampfers bei einem Vakuum von 300 Millibar und einer Temperatur von 40 Grad Celsius. Danach lösen Sie das Rohprodukt in etwa einem Milliliter Wasser auf und geben es auf ein Polyacrylamidgel-Bett.

Eluieren Sie das Produkt mit Wasser und sammeln Sie Fraktionen von ein bis zwei Milliliter. Nach dem Vereinigen der Produkt enthaltenden Fraktionen und dem Einfrieren der Lösung wird durch Gefriertrocknung das gewünschte Produkt als weißes Pulver erhalten. Sobald das Produkt trocken ist, charakterisieren Sie es mittels Enimar und Massenspektroskopie unter Verwendung von Deuteriumoxid als Lösungsmittel.

Stellen Sie für die Oberflächenanodisierung einen temperaturgeregelten Inkubator auf vier Grad Celsius ein. Überführen Sie dann eine zuvor hergestellte wässrige Oxalsäurelösung mit 0,3 mol/L in einen 500-Milliliter-Becher, der einen magnetischen Rührstab enthält. Geben Sie eine 10 Zentimeter lange Platinstange als Kathode in die Lösung.

Rühren Sie die Oxalsäure während des gesamten Anodisierungsprozesses mit 300 U/min weiter. Klicken Sie in der Labortracer-Software auf die Schaltfläche Einrichten und anschließend auf die Funktion Spannungsabfahrt. Stellen Sie die Start- und Stoppspannung auf 25,8 Volt ein.

Stellen Sie die Anzahl der Punkte auf 100, die Compliance auf eins und die Sweep-Verzögerung auf 1200 Millisekunden ein. Klicken Sie dann auf „OK“. Befestigen Sie einen mit Aluminium beschichteten Glasobjektträger mit der dem Kathoden zugewandten Seite.

Klicken Sie auf die Schaltfläche „Test ausführen“ und beobachten Sie die momentane Messung. Nach der Oberflächenanodisierung spülen Sie den Objektträger gründlich mit doppelt destilliertem Wasser ab und trocknen ihn mit Stickstoffgas. Bewahren Sie den Objektträger in einer Kammer mit 30 % relativer Luftfeuchtigkeit auf, bis er weiterverwendet wird.

Stellen Sie zur Herstellung 100-Mikroliter-Lösungen aller monovalenten Glykane in Ethylenglykol mit einer Konzentration von 10 Millimolar her. Verdünnen Sie die Glykanlösungen mit Druckpuffer, um 100-Mikromolar-Lösungen zu erhalten. Für die Heteroligandenstudie geben Sie fünf Mikroliter MAN-5-Glykan zu fünf Mikrolitern jeder Glykanlösung hinzu.

Überführen Sie die hergestellten Glykane in die 384-Well-Mikroplatte für den Mikroarray-Druckschritt. Nachdem eine Mikroplatte in die Druckanlage eingesetzt wurde, drucken Sie die Mikroarrays mittels robotischem Pin, indem Sie 0,6 Nanoliter der Glykanlösungen auf jede aluminiumbeschichtete Glasobjektträger auftragen. Bereiten Sie anschließend 70 Mikroliter Primärantikörper PG-9 und PTSB-Puffer mit 3 % BSA vor.

Dann bereiten Sie 120 Mikroliter sekundären fluoreszierenden Markierungsantikörper (Esel-anti-menschliches Immunglobulin G) in PBST-Puffer mit 3 % BSA im Dunkeln vor. Mischen Sie PG9 und den sekundären fluoreszierenden Markierungsantikörper im Verhältnis 1:1. Inkubieren Sie anschließend die vorgemischten Antikörper 30 Minuten bei vier Grad Celsius.

Nach der Inkubation eine aluminiumbeschichtete Glasplatte in die Objektträger-Inkubationskammer einsetzen, die in 16 Vertiefungen unterteilt ist. 100 Mikroliter der vorgemischten Antikörper auf das Glykan-Array übertragen. Nach einer 16-stündigen Inkubation bei vier Grad Celsius die vorgemischten Antikörper mit einer Pipette vom Glykan-Array entfernen und anschließend die Objektträger-Inkubationskammer abnehmen.

Spülen Sie den Objektträger mit PBST-Puffer und deionisiertem Wasser. Anschließend den Objektträger bei 2000 × g trockenzentrifugieren. Öffnen Sie danach die Software zur Analyse von Microarray-Bildern.

Legen Sie den getrockneten Glasobjektträger mit den angeordneten Strukturen nach unten in den Array-Scanner ein. Klicken Sie auf das Einstellungsmenü. Stellen Sie die Bildauflösung auf fünf Mikrometer pro Pixel ein.

Und stellen Sie die Wellenlänge bei 635 Nanometern mit PMT 450 und der Leistung auf 100 % ein. Klicken Sie auf die Schaltfläche „Scan“, um die Aufnahme der Probe zu starten. Klicken Sie abschließend auf das Dateisymbol, um das Scan-Bild im TIF-Format für die Bildanalyse zu speichern. In dieser Studie wurde eine breite Palette an N-Glykanen unter Verwendung einer modularen chemoenzymatischen Strategie synthetisiert.

Um die Wirksamkeit der Strategie zu demonstrieren, wurde eine biantennäre isometrische Struktur durch chemoenzymatische Methoden synthetisiert. Die enzymatische Galaktosylierung von Disaccharid 1, gefolgt von der Fucosylierung von Trisaccharid 2, ergab das gewünschte Tetrasaccharid 3. Die vollständige Sättigung sowie Modifikationen am reduzierenden Ende der Bausteine zwei und drei führten zu den gewünschten Molekülen vier und fünf.

Die stereoselektive dreifache O-Glykosylierung des vierten Moduls des Trisaccharids sechs ergab das Hexasaccharid sieben. Die Entschützung und nachfolgende Reaktion mit Modul fünf führte zum Dodecasaccharid neun. Die vollständige Entschützung lieferte das Glykan 10, das durch Enimar und Massenspektroskopie charakterisiert wurde.

Glykane mit einem Pentylamin-Schwanz am reduzierenden Ende wurden mit Phosphonsäure-Linkern modifiziert und über Phosphinid-Chemie an der aluminiumbeschichteten Glasoberfläche angebunden. Der breit neutralisierende HIV-1-Antikörper PG9 wurde mittels Homo- und Heteroglykan-Arrays auf seine Glykanspezifität untersucht, um erstmals seine Wechselwirkung mit benachbarten Heteroglykanen in der V1/V2-Schleife des HIV-1-PG120-Oberflächenproteins nachzuweisen. Wenn die Methode einmal beherrscht ist, kann sie in 24 Stunden – von der Glykan-Immobilisierung bis zur β-Analyse – durchgeführt werden, sofern sie korrekt durchgeführt wird.

Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, frisch anodisierte, mit Aluminium beschichtete Objektträger für Glycan 10 zu verwenden. Als Unterlage für dieses Verfahren dienen die Med-Tech-Objektträger. Die Bestimmung der Körperkonstante kann durchgeführt werden, um die Bindungswechselwirkungen zwischen dem gewünschten Kohlenhydrat und Protein zu quantifizieren.

Nach der Entwicklung dieser Technik ebnete sie den Forschern den Weg, die Rolle von Kohlenhydraten bei Infektionskrankheiten in Kenia besser zu verstehen, und trug zur Entwicklung neuer Therapien gegen Krankheiten bei. Vergessen Sie nicht, dass das Arbeiten mit toxischen Substanzen äußerst gefährlich sein kann, und dass stets Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Schutzkleidung, Schutzbrille und Masken getroffen werden sollten, wenn Experimente durchgeführt werden.