Chemo-enzymatische Synthese von N- Glykanen für Array-Entwicklung und HIV-Antikörper-Profiling
5. Februar 2018
Ein modularer Ansatz für die Synthese von N- Glykanen zur Befestigung an einer Aluminiumoxid-beschichtete Glas schieben (ACG Folie) wie ein Glycan Microarray entwickelt wurde und seine Verwendung für die Profilerstellung für eine HIV weitgehend neutralisierende Antikörper nachgewiesen.
Das übergeordnete Ziel dieser Methodik ist es, einen modularen chemo-enzymatischen Ansatz für die Synthese von N-Glykanen zu entwickeln, indem ein neuer Glykan-Microarray auf einem Aluminiumoxid-beschichteten Glasobjektträger zum Nachweis der Heteroglykanbindung von HIV-Antikörpern konstruiert wird. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen in der Glykobiologie zur Identifizierung von zellvirusspezifischen Glykanen für viele Entwicklungen zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Methode besteht darin, eine schwache Bindung zu erkennen und eine Mischung von Zuckern zu identifizieren, die an ein Protein binden, wie z. B. Antikörper von HIV-Patienten.
Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Diagnose von Influenza-Infektionen, da Sialic Catabolist auf menschlichen Atemwegen, Epithelzellen exprimieren und Probleme häufig sind, während die Symptome. Daher ist das Glykoarray ein ideales Werkzeug, um die Spezifität von wilden Subtypen zu bestimmen. Obwohl diese Methode Einblicke in die Glykanspezifitäten von HIV-Antikörpern geben kann, kann sie auch auf andere Systeme angewendet werden, wie z. B. die Diagnose verschiedener Krebsarten basierend auf dem Bindungsmuster von humanen Serumantikörpern an humanspezifische Serumantigene, die auf der Oberfläche aufgedruckt sind.
Um dieses Verfahren zu beginnen, fügen Sie 2-5 Mikromol zuvor zubereitetes Glykan und einen Fünf-Milliliter-Rundkolben hinzu. Geben Sie einen magnetischen Rührstab in den Kolben und verschließen Sie ihn mit einem Gummiseptum. 400 Mikroliter frisch getrocknetes DMF und 10-25 Mikromol des Phosphonsäure-Linkers werden in den Kolben gegeben.
Rühren Sie dann das Reaktionsgemisch fünf Stunden lang bei 800 U/min. Sobald die Reaktion abgeschlossen ist, verdampfen Sie das Lösungsmittel mit einem Rotationsverdampfer bei fünf bis 10 Millibar Vakuumdruck und 40 Grad Celsius. Anschließend das getrocknete Reaktionsgemisch und 0,5 Milliliter Wasser auflösen und auf das Polyacrylamid-Gelbett auffüllen.
Eluieren Sie die Produkte mit Wasser und sammeln Sie ein bis zwei Milliliterfraktionen. Um die gesammelten Fraktionen durch DC zu überprüfen, platzieren Sie jede Fraktion auf einer DC-Platte und tauchen Sie die Platte in 0,25 molare Cer-Ammonium-Molybdat. Erhitzen Sie die befleckte Platte mit einer Heizplatte, um das Produkt sichtbar zu machen.
Nach dem Mischen des fraktionshaltigen Produkts und dem Einfrieren der Lösung biofolisieren, um das gewünschte Produkt als weißes Pulver zu erhalten. Als nächstes lösen Sie das getrocknete Produkt in zwei Millilitern Wasser auf und fügen Sie Palladiumhydroxid hinzu. Einen wasserstoffhaltigen Ballon wird an den Kolben angebaut und das Reaktionsgemisch 15 Stunden lang bei 800 U/min unter Wasserstoffatmosphäre gerührt.
Sobald die Reaktion abgeschlossen ist, filtrieren Sie das Gemisch durch ein Celite-Bett und waschen Sie es mit zwei Millilitern Methanol und zwei Millilitern destilliertem Wasser. Verdampfen Sie dann das Lösungsmittel mit einem Rotationsverdampfer bei 300 Millibar Vakuumdruck und 40 Grad Celsius. Anschließend lösen Sie das Rohmaterialgemisch in etwa einem Milliliter Wasser auf und laden es auf ein Polyacrylamid-Gelbett.
Eluieren Sie das Produkt mit Wasser und sammeln Sie ein bis zwei Milliliterfraktionen. Nach dem Mischen des fraktionshaltigen Produkts und dem Einfrieren der Lösung biofolisieren, um das gewünschte Produkt als weißes Pulver zu erhalten. Sobald das Produkt trocken ist, charakterisieren Sie es durch Enimar und Massenspektroskopie mit Deuteriumoxid als Lösungsmittel.
Stellen Sie für die Oberflächeneloxierung einen temperaturgesteuerten Inkubator auf vier Grad Celsius ein. Dann wird eine zuvor hergestellte wässrige 0,3-Mol-Oxalsäurelösung in ein 500-Milliliter-Becherglas gegeben, das einen magnetischen Rührstab enthält. Legen Sie einen 10 Zentimeter langen Platinstab als Kathode in die Lösung.
Rühren Sie die Oxalsäure während des gesamten Eloxalisierungsprozesses bei 300 U/min weiter. Klicken Sie in der Labor-Tracer-Software auf die Setup-Schaltfläche und dann auf die Funktionsauswahl Sweep Voltage. Stellen Sie die Start- und Stoppspannung auf 25,8 Volt ein.
Die Anzahl der Punkte auf 100, die Konformität auf eins und die Sweep-Verzögerung auf 1200 Millisekunden. Klicken Sie dann auf OK. Klemmen Sie einen aluminiumbeschichteten Glasschieber in Richtung Kathode.
Klicken Sie auf die Schaltfläche Test ausführen und beobachten Sie die aktuelle Messung. Waschen Sie den Objektträger nach der Oberflächeneloxierung gründlich mit doppelt destilliertem Wasser und spülen Sie ihn mit Stickstoffgas trocken. Bewahren Sie den Objektträger bis zur weiteren Verwendung in einer Kammer mit 30 % relativer Luftfeuchtigkeit auf.
Bereiten Sie für die Herstellung 100 Mikroliter Lösungen aller monovalenten Glykane in Ethanolglykol in einer Konzentration von 10 Millimolar vor. Verdünnen Sie die Glykanlösungen mit Druckpuffer, um 100 mikromolare Lösungen herzustellen. Für die Heteroliganden-Studie fügen Sie fünf Mikroliter MAN-5-Glykan zu fünf Mikrolitern jeder Glykanlösung hinzu.
Übertragen Sie die vorbereiteten Glykane in die 384-Well-Mikroplatte für den Microarray-Druckschritt. Nachdem Sie eine Mikroplatte auf dem Drucker-Array-Technologie eingesetzt haben, drucken Sie Microarrays mit einem Roboterstift, indem Sie 0,6 Nanoliter der Glykanlösungen auf jeden aluminiumbeschichteten Glasobjektträger aufbringen. Bereiten Sie als Nächstes 70 Mikroliter des primären Antikörpers PG-9 und des PTSB-Puffers mit 3 % BSA vor.
Bereiten Sie dann im Dunkeln 120 Mikroliter sekundären fluoreszierenden Tag-Antikörper, Esel und Anti-Human-Immunglobulin G und PBST-Puffer mit 3 % BSA vor. Mischen Sie PG9 und den sekundären fluoreszierenden Tag-Antikörper im Verhältnis 1:1. Anschließend inkubieren Sie die vorgemischten Antikörper 30 Minuten lang bei vier Grad Celsius.
Nach der Inkubation wird ein aluminiumbeschichteter Objektträger in die Objektträger-Inkubationskammer geladen, die in 16 Vertiefungen unterteilt ist. Übertragen Sie 100 Mikroliter der vorgemischten Antikörper auf das Glykan-Array. Nach einer 16-stündigen Inkubation bei vier Grad Celsius entfernen Sie die vorgemischten Antikörper mit einer Pipette aus dem Glykan-Array und entfernen dann die Objektträger-Inkubationskammer.
Waschen Sie den Objektträger in PBST-Puffer und entionisiertem Wasser. Schleudern Sie dann den Objektträger bei der 2000-fachen Schwerkraft. Öffnen Sie als Nächstes die Microarray-Bildanalysesoftware.
Setzen Sie den getrockneten Objektträger mit den angeordneten Merkmalen nach unten in den Array-Scanner ein. Klicken Sie auf das Einstellungsmenü. Stellen Sie die Bildauflösung auf fünf Mikrometer pro Pixel ein.
Und stellen Sie die Wellenlänge mit dem PMT 450 auf 635 Nanometer und die Leistung auf 100% einKlicken Sie auf die Scan-Schaltfläche, um die Abbildung des Objektträgers zu starten. Klicken Sie abschließend auf das Dateisymbol, um das Scanbild im TIF-Format für die Bildanalyse zu speichern. In dieser Studie wurde eine breite Palette von N-Glykanen unter Verwendung einer modularen chemoenzymatischen Strategie synthetisiert.
Um die Wirksamkeit der Strategie zu demonstrieren, wurde eine biAntennen-isometrische Struktur mit chemoenzymatischen Methoden synthetisiert. Die enzymatische Galaktosylierung für Disaccharid 1, gefolgt von der Fukosylierung von Trisaccharid 2, lieferte das gewünschte Tetrasaccharid 3. Pro Satylierung und Reduktion der Endmodifikationen der Bausteine zwei und drei ermöglichte sich das Wunschmolekül vier und fünf.
Stereoselektive drei O-Glykosalyierung von Modul vier von Trisaccharid sechs lieferte Hexasaccharid sieben. Die Entschützung und Reaktion vor Modul fünf ergab Dedekasaccharid neun. Der globale Nachweis ermöglichte das Glykan-10, das durch Enimar und Massenspektroskopie charakterisiert wurde.
Glykane, die am reduzierenden Ende einen Pentylaminschwanz enthielten, wurden mit Phosphonsäure-Linkern modifiziert und durch Phospinidchemie an die mit Aluminiumglas beschichtete Oberfläche gebunden. Der HIV-1-neutralisierende Antikörper PG9 wurde auf seine Glykanspezifität untersucht, indem Homo- und Heteroglykan-Arrays verwendet wurden, um zum ersten Mal seine Interaktivität mit benachbarten Heteroglykanen in der V1/V2-Schleife der HIV1-PG120-Oberfläche zu demonstrieren. Einmal gemeistert, kann diese Technik innerhalb von 24 Stunden von der Glykanimmobilisierung bis zur Beta-Analyse durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wurde.
Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, frisch eloxierte, aluminiumbeschichtete Glasobjektträger für Glycan 10 zu verwenden. Für die Verlegung dieses Verfahrens eignen sich die Medtechs Slides. Die Bestimmung der Körperkonstante kann durchgeführt werden, um die Bindungswechselwirkungen zwischen Kohlenhydraten und Proteinen von Interesse zu quantifizieren.
Nach der Entwicklung dieser Technik ebnete sie den Weg für Forscher, die Rolle von Kohlenhydraten bei Infektionskrankheiten in Kenia besser zu verstehen und neue Therapien gegen Krankheiten zu entwickeln. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit giftigen Stoffen äußerst gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung von Experimenten immer Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Kleidung, Brille und Masken getroffen werden sollten.
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Überblick
Diese Studie präsentiert einen modularen chemisch-enzymatischen Ansatz zur Synthese von N-Glykanen auf aluminiumoxidbeschichteten Glasscheiben, der Glykan-Mikroarray-Anwendungen ermöglicht. Die Methodik wird durch die Charakterisierung eines HIV-breit neutralisierenden Antikörpers demonstriert und zeigt deren Potenzial in der Glykobiologie.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Glykobiologie
- Immunologie
- Mikroarray-Technologie
Hintergrund
- N-Glykane spielen eine entscheidende Rolle bei Zell-Virus-Interaktionen.
- Das Verständnis von Glykan-Bindungsmustern kann bei der Diagnose viraler Infektionen helfen.
- Aktuelle Methoden können schwache Bindungsinteraktionen möglicherweise nicht effektiv nachweisen.
- Glykan-Mikroarrays können Einblicke in die Antikörperspezifität geben.
Zweck der Studie
- Eine neue Methode zur Synthese von N-Glykanen zu entwickeln.
- Ein Glykan-Mikroarray zur Erkennung von HIV-Antikörperinteraktionen zu erstellen.
- Die Auswirkungen auf die Diagnose anderer viraler Infektionen und Krebserkrankungen zu untersuchen.
Verwendete Methoden
- Chemisch-enzymatische Synthese von N-Glykanen.
- Konstruktion von Glykan-Mikroarrays auf ACG-Scheiben.
- Charakterisierung von HIV-breit neutralisierenden Antikörpern.
- Analyse von Glykan-Bindungsmustern.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Synthese von N-Glykanen für Mikroarray-Anwendungen.
- Nachweis schwacher Bindungsinteraktionen demonstriert.
- Spezifische Glykan-Muster identifiziert, die mit HIV-Antikörpern assoziiert sind.
- Potenzielle Anwendungen zur Diagnose von Influenza und Krebs.
Schlussfolgerungen
- Der modulare Ansatz verbessert die Synthese von N-Glykanen.
- Diese Technik kann das Verständnis der Glykan-Spezifität verbessern.
- Sie verspricht breitere Anwendungen in der Diagnostik.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
This chemo-enzymatic N-glycan synthesis method enables rapid generation of diverse glycan libraries for microarray-based antibody profiling, addressing a critical gap in detecting weak and heterogeneous glycan-protein interactions relevant to HIV vaccine design. By facilitating the analysis of hetero-ligand binding behaviors of broadly neutralizing antibodies like PG9, the approach supports mechanistic de-risking in early immunogen discovery and improves predictive confidence in antigen selection. The modular strategy provides a scalable, reusable platform for epitope mapping and target validation across infectious disease and oncology pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by mapping glycan-specific antibody interactions that inform target relevance and mechanism of action.
- Operational Value: Supports biological de-risking through systematic profiling of hetero-ligand binding patterns on defined glycan arrays.
- Predictive Value: Enhances portfolio triage by identifying glycan motifs associated with potent neutralizing activity, guiding immunogen design decisions.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces covalently attached, structurally diverse N-glycans on aluminum oxide-coated glass slides, creating standardized microarrays for reliable compound and antibody screening.
- Quantitative Output: Enables detection of weak binding interactions through fluorescent readouts, providing measurable affinity and specificity data for hit validation.
- Platform Reuse: The modular synthesis strategy allows rapid regeneration of glycan libraries, supporting iterative screening campaigns and cross-project standardization.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Directly supports translational biomarker discovery by linking specific glycan structures (e.g., Man5GlcNAc2 and di-sialylated bi-antennary N-glycans) to HIV antibody binding phenotypes.
- Preclinical Continuity: Bridges discovery and preclinical validation by providing a defined glycan system to assess antibody efficacy and specificity prior to in vivo testing.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by revealing off-target or weak-binding glycan interactions that may indicate reduced therapeutic potential or safety concerns.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery workflow from early target validation through lead identification, enabling glycan-dependent antibody characterization that informs downstream preclinical development.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by defining glycan epitopes recognized by HIV broadly neutralizing antibodies, reducing mechanistic ambiguity in target validation.
- Screening: Delivers assay-ready glycan microarrays with high reproducibility and quantitative readouts, enabling reliable evaluation of antibody-glycan interactions across large libraries.
- Analytics: Generates binding signal data (e.g., fluorescence intensity) that allows comparative analysis of homo- and hetero-glycan binding, facilitating structure-activity relationship mapping.
- Translational Research: Connects to preclinical work by identifying glycan-specific antibody profiles that can be correlated with functional neutralization and used to guide immunogen optimization.
- Enterprise Reuse: The chemo-enzymatic modular approach is adaptable across targets, allowing reuse of the synthesis and array fabrication workflow for multiple antibody discovery campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in glycan-dependent antibody recognition.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility through covalent glycan attachment and controlled array fabrication on ACG slides.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling rapid glycan library generation and reducing reliance on external synthesis or fragmented screening efforts.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by identifying glycan-binding phenotypes linked to potent neutralization, informing advancement decisions in vaccine and therapeutic pipelines.
Implementation Considerations
- Requires expertise in carbohydrate chemistry, enzymatic synthesis, and microarray handling to ensure proper glycan modification and array quality.
- Depends on instrumentation for rotary evaporation, polyacrylamide gel electrophoresis, and array scanning with specific wavelength and PMT settings.
- Necessitates cross-team standardization of glycan solution preparation, printing concentrations, and antibody incubation protocols to maintain inter-assay consistency.
- Involves adaptation considerations when applying the method to different glycan targets or antibody classes, particularly in linker chemistry and surface immobilization efficiency.
- Includes practical limitations such as the need for freshly anodized slides and careful handling of toxic reagents during phosphonate linker coupling and hydrogenation steps.
