Wirbelsäule Neuronen Isolierung und Kultur aus neonatalen Mäusen
11. Juli 2017
Diese Studie stellt eine Technik für die Isolierung von Neuronen aus WT neonatalen Mäusen vor. Es erfordert die sorgfältige Sezierung des Rückenmarks aus der neonatalen Maus, gefolgt von der Trennung von Neuronen aus dem Rückenmarksgewebe durch mechanische und enzymatische Spaltung.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, wiederholt und konsistent Rückenmarksneuronen isolieren zu können, die in einer Vielzahl von Experimenten verwendet werden können. Diese Methode kann es uns ermöglichen, einen besseren Einblick in die Biologie der Neuronen des Rückenmarks zu gewinnen und hoffentlich ihre Reaktion auf eine Vielzahl von Stressoren zu verstehen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Isolierung einer signifikanten Anzahl von Neuronen ermöglicht, so dass diese Neuronen in einer Vielzahl von Experimenten verwendet werden können.
Dievisuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da der Verreibungsschritt, bei dem Neuronen mechanisch vom Gewebe isoliert werden, einige Zeit benötigt, um eine gesunde Isolierung der Neuronen zu gewährleisten, ohne sie zu töten. Um diesen Vorgang zu starten, trenne den Kopf der euthanasierten Mäusebabys mit einer Schere vom Körper. Stabilisieren Sie anschließend den Schwanz und die Arme auf dem Eingriffstisch mit der Rückenseite nach oben.
Schneiden Sie dann die Haut mit der gebogenen Irisschere ab. Schneiden Sie danach das Rückenmark aus der Lendenwirbelsäule knapp über den Hüften ab und schneiden Sie dann beide Seiten des Brustkorbs, um ihn vom Körper zu trennen. Waschen Sie die Proben nacheinander in drei 10 Zentimeter großen Petrischalen mit jeweils fünf Millilitern sterilisiertem PBS für jeweils 10 Sekunden, um überschüssiges Gewebe zu entfernen.
Führen Sieanschließend eine 22-Gauge-Nadel und eine Spritze, die mit fünf Millilitern sterilisiertem PBS gefüllt sind, in das kaudale Ende der Wirbelsäule ein und spülen Sie sie nach vorne, so dass die Nabelschnur in eine vierte Petrischale austreten kann. Übertragen Sie das Rückenmark in einem 15-Milliliter-Schlauch mit fünf Millilitern HABG auf Eis. Vermeiden Sie es, das Rückenmark zu quetschen und wiederholen Sie die Eingriffe für den Rest der Welpen.
Im Idealfall sollte dieser Vorgang für eine Gruppe von Welpen nicht länger als 30 Minuten dauern, um die Isolierung der Neuronen zu gewährleisten. Um den Dichtegradienten vorzubereiten, bereiten Sie jede der vier Schichten in vier 15-Milliliter-Röhrchen vor. Geben Sie dann einen Milliliter jeder Schicht in ein neues 15-Milliliter-Röhrchen.
Beginnen Sie mit der ersten Schicht unten und fügen Sie sie nacheinander hinzu, bis Sie oben die vierte Schicht erreichen. Vermeiden Sie es, die Schichten beim Hinzufügen zu stören und kräftige Bewegungen, die zu einer Vermischung führen können. Geben Sie anschließend das Verdauungsmedium in das gehackte Gewebe
.Legen Sie die Probe in einen Shaker in das Wasserbad bei 30 Grad Celsius. Nehmen Sie anschließend das Gewebe aus dem Wasserbad und lassen Sie es einige Minuten einwirken. Um die Verreibung durchzuführen, aspirieren Sie das überschüssige Aufschlussmedium.
Suspendieren Sie das Gewebe mit einer Schmalpipette in zwei Millilitern HABG, reiben Sie es 10 Mal in 45 Sekunden und vermeiden Sie das Einbringen von Luft, da dies die rentable Ausbeute erheblich verringern würde. Die Verreibung ist einer der kritischsten Schritte des Verfahrens, das Gewebe sollte vorsichtig in die feuerpolierte Pipette gezogen und aus ihr entleert werden, um übermäßige Vitalität zu vermeiden, die zum Absterben der Neuronen führen kann, oder zu schonend, was zu einer geringen Ausbeute führen würde. Danach aspirieren Sie die oberen zwei Milliliter des Überstands und übertragen es in ein neues 15-Milliliter-Röhrchen mit der Bezeichnung Sammlung.
Wiederholen Sie den Entnahmevorgang noch zweimal, um sechs Milliliter Überstand zu erhalten. Übertragen Sie anschließend den Inhalt des Auffangröhrchens langsam in das zuvor vorbereitete Gradientenröhrchen. Vermeiden Sie die Unterbrechung des Gradienten.
Um die Neuronen zu reinigen, zentrifugieren Sie das Gradientenröhrchen 15 Minuten lang bei 800 mal G, bei 22 Grad Celsius. Sammeln Sie die gewünschten Schichten und übertragen Sie sie in eine neue 15-Milliliter-Tube. Für die höchste Reinheit der Neuronenisolierung sammeln Sie Schicht drei.
Für mehr Ausbeute bei geringerer Reinheit sammeln Sie die Schichten zwei bis drei. Als nächstes verdünnen Sie den Dichtegradienten, indem Sie den neu gesammelten Schichten fünf Milliliter HABG hinzufügen. Zentrifugieren Sie es bei 200 mal G für zwei Minuten bei 22 Grad Celsius.
Nach zwei Minuten wird der Überstand verworfen und die Zellen in fünf Millilitern HABG wieder suspendiert, indem man mit dem Gaumen schnippt. Anschließend zentrifugieren Sie die Probe bei 200 mal G für zwei Minuten bei 22 Grad Celsius erneut. Verwerfen Sie dann den Überstand und suspendieren Sie die Zellen in drei Millilitern neurobasalem Medium, indem Sie mit dem Gaumen schnippen.
Danach bestimmen Sie die Zelldichte mit einem Zellzähler und verdünnen die Suspension auf 300.000 Zellen pro Milliliter neurobasalem Medium. Schütteln Sie vorsichtig, um die Zellen und die Lösung zu verteilen, und geben Sie einen Milliliter der Probe in jede Vertiefung in den codierten 24-Well-Platten. Hier ist der Zeitverlauf der Neuronen in Kultur zu sehen, nachdem sie auf die Vertiefungen gepflanzt wurden.
Die Zellen beginnen in der Regel innerhalb der ersten paar Stunden an der Oberfläche zu haften. Axone beginnen innerhalb der ersten 24 bis 48 Stunden zu sprießen, Verbindungen zwischen verschiedenen Neuronen und Kulturen erreichen in der Regel nach sieben Tagen ihre Reife, dann werden typischerweise Experimente an den Neuronen durchgeführt. In dieser Abbildung ist die Kernfärbung in Blau dargestellt, die zytoplasmatische Färbung in Grün, und hier ist das mikrotubuläre assoziierte Protein des Neurons Cyctoskeletal Protein zwei gefärbt, das die Umrisse und axonalen Projektionen der Neuronen nach einer Woche in Kultur zeigt.
Die Merge-Bilder sind kombiniert und zeigen die relative Häufigkeit der Neuronen. Einmal gemeistert, kann diese Technik in drei bis vier Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Nach ihrer Entwicklung ebnet diese Technik den Weg für Forscher, die die Physiologie und Pathologie des Rückenmarks untersuchen, um das Verhalten der Neuronen des Rückenmarks unter normalen Bedingungen und als Reaktion auf pharmakologische Wirkstoffe oder Stressoren wie Sauerstoff- und Glukosemangel zu erforschen, nur um unsere chirurgischen Verfahren nachzuahmen.
Bei diesem Verfahren ist es wichtig, einen der Schritte zur Verhinderung der Isolierung ungesunder Neuronen nicht zu verzögern oder zu verlängern. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man gesunde und lebensfähige Neuronen aus dem Rückenmark von neugeborenen Mäusen isoliert, die in serumfreien Medien kultiviert werden können.
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Übersicht
Diese Studie präsentiert eine Technik zur Isolierung von Neuronen aus dem neonatalen Rückenmark von WT-Mäusen, mit Fokus auf die Dissektion des Rückenmarks und die Trennung der Neuronen durch mechanische und enzymatische Methoden.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Neurobiologische Techniken
Hintergrund
- Die Isolierung von Rückenmark-Neuronen ist entscheidend für verschiedene experimentelle Anwendungen.
- Das Verständnis der Neuronenbiologie kann Einblicke in ihre Reaktionen auf Stressoren liefern.
- Die Beherrschung des Triturationschritts ist wesentlich für eine gesunde Neuronenisolierung.
- Visuelle Demonstrationen verbessern das Erlernen dieser komplexen Technik.
Zweck der Studie
- Eine zuverlässige Methode zur Isolierung von Rückenmark-Neuronen zu entwickeln.
- Experimente zu erleichtern, die die Neuronenbiologie untersuchen.
- Das Verständnis der neuronalen Reaktionen auf verschiedene Stressoren zu verbessern.
Verwendete Methoden
- Dissektion des Rückenmarks von neonatalen Mäusen.
- Mechanische und enzymatische Spaltung zur Trennung der Neuronen.
- Sorgfältiger Umgang zur Sicherstellung der Neuronenlebensfähigkeit.
- Visuelle Hilfsmittel zur Demonstration des Triturationsprozesses.
Hauptergebnisse
- Eine signifikante Anzahl von Neuronen kann mit dieser Technik isoliert werden.
- Die Methode ermöglicht eine konsistente und wiederholbare Isolierung von Neuronen.
- Gesunde Neuronen können für verschiedene experimentelle Zwecke gewonnen werden.
- Visuelle Demonstrationen unterstützen die Beherrschung der Technik.
Schlussfolgerungen
- Die entwickelte Technik ist effektiv zur Isolierung von Rückenmark-Neuronen.
- Sie bietet eine Grundlage für weitere Forschung in der Neuronenbiologie.
- Die Beherrschung der Methode kann zu verbesserten experimentellen Ergebnissen führen.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Reliable isolation and culture of spinal cord neurons from neonatal mice enables high-fidelity in vitro models for early neurobiology discovery and mechanistic de-risking. This capability supports predictive confidence in target validation and functional screening for neurodegenerative and neuroregenerative research portfolios. Consistent neuron yield and viability underpin scalable assay development and translational continuity across preclinical workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of neuronal response to pharmacological agents and stressors in a controlled system.
- Supports mechanistic de-risking by providing primary neuron cultures for pathway analysis.
- Facilitates functional target validation through reproducible neuron isolation and culture.
Screening & Assay Development
- Provides standardized, high-yield neuron preparations for quantitative assay development.
- Ensures reproducibility and scalability for compound screening and phenotypic analysis.
- Delivers validated neuronal systems suitable for downstream high-content or functional assays.
Translational & Preclinical Research
- Enables modeling of disease-relevant neuronal responses to injury or deprivation in vitro.
- Supports alignment of in vitro findings with in vivo preclinical models for translational biomarker exploration.
- Reduces biological risk by providing continuity from discovery through preclinical validation.
Pipeline & Workflow Integration
This neuron isolation protocol integrates at the interface of early discovery and preclinical research, supporting workflows from hypothesis testing to lead identification and mechanistic studies.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis-driven interrogation of neuronal pathways and stress responses.
- Screening: Provides reproducible, quantitative outputs for compound evaluation and assay standardization.
- Analytics: Enables measurement of neuronal viability, maturation, and connectivity for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges in vitro mechanistic insights with in vivo preclinical models when aligned with disease context.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for diverse neurobiology and pharmacology studies across programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neuronal target studies.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable, and reproducible neuron preparations for cross-team use.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by enabling robust early-stage data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of neurobiology assets.
Implementation Considerations
- Requires technical expertise in neonatal dissection and trituration for optimal neuron viability.
- Needs access to sterile instrumentation, density gradient materials, and cell culture infrastructure.
- Demands cross-team standardization of isolation and culture steps for reproducibility.
- Adaptation may be necessary for different mouse strains or developmental stages.
- Yield and purity are sensitive to timing and handling, impacting downstream assay reliability.
