Name: Rettung und Charakterisierung des rekombinanten Virus aus einer neuen Welt Zika Virus Infectious Clone (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Erfahren Sie die Rettung infektiösen Zika-Virus aus einem zweiteiligen cDNA-Klon für Flavivirus-Forschung. Diese Methode ermöglicht Impfstoffstudien und kann auf andere instabile virale Systeme übertragen werden.

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Die Autoren danken Kristen Bullard-Feibelman, Milena Veselinovic und Claudia Rückert für ihre Unterstützung bei der Charakterisierung des vom Klon abgeleiteten Virus. Diese Arbeit wurde teilweise durch Zuschüsse des Nationalen Instituts für Allergie und Infektionskrankheiten, NIH unter den Stipendien AI114675 (BJG) und AI067380 (GDE) unterstützt.

1. Transformation und Wiederherstellung von infektiösen Klonplasmiden <ol><li> Transformieren Sie beide Plasmide (getrennt) unter Verwendung eines kommerziellen Transformationsprotokolls ( z. B. NEB 5 Minute Transformation Protocol) mit einigen Modifikationen. Beide Plasmide enthalten ein für die Ampicillinresistenz kodierendes Gen, daher verwenden sie Ampicillin oder Carbenicillin zur Selektion. Carbenicillin wird bevorzugt, da es stabiler ist. <ol><li> Entfernen Sie die Zellen (siehe Materialtabelle) von -80 ° C Gefrierschrank und tauen Sie auf Eis für 5-10 min. Prewarm Lysogeny Brühe (LB) (mit 10 g / l NaCl und 25 μg / ml Carbenicillin, genannt LB-Carb) Platten und die Brühe mit Catabolit Repression (SOC (ohne Antibiotika) - kommen mit den Zellen) bei 37 ° C. </li><li> Füge zwischen 100 pg-10 ng in 1 μl Plasmid-DNA zu einem Röhrchen hinzu, das 50 μl kompetente Zellen enthält; Mischen Sie vorsichtig, indem Sie die Tube schlagen. </li><li> Röhrchen auf Eis für 5 min inkubieren. </li><li> Hitzeschockrohre bei 42 ° C für 30 sIn einem wasserbad Rückkehr zum Eis für 2 min unmittelbar nach Hitzeschock. </li><li> 950 μl Raumtemperatur SOC in jedes Röhrchen pipettieren und durch Pipettieren mischen. 100 μl des Bakteriengemisches auf eine LB-Carb-Platte auftragen und über Nacht bei 37 ° C inkubieren (ca. 12-14 h). </li></ol></li><li> Entfernen von Platten aus 37 ° C Inkubator nach 12-14 h Inkubation. Legen Sie die Platten in eine dunkle Schublade bei Raumtemperatur, damit Kolonien weiter wachsen (ca. 8-9 h). </li><li> Unter Verwendung von 5 ml Terrific Brühe (TB, enthaltend 25 &amp; mgr; g / ml Carbenicillin, genannt TB-Carb), wachsen 5-10 kleine Kolonien für jedes Plasmid über Nacht bei 30 ° C in einem Bakterienschüttler (etwa 14-16 h). HINWEIS: Kleine Kolonien sind ein Indikator dafür, dass das Plasmid intakt ist; Kolonien mit Plasmiden, die Deletionen, Umlagerungen oder Mutationen enthalten (hierin Instabilitätsereignisse genannt), werden schneller wachsen und sind daher größer. Deshalb sollte man versuchen, die kleinsten Kolonien auf dem Teller zu holen, namentlichT Auswahl der größten Kolonien vorhanden. Einige mittelgroße Kolonien können auch für Vollständigkeit ausgewählt werden. Die niedrigere Temperatur reduziert die Wahrscheinlichkeit, dass die Zellen überwachsen (OD 600 von größer als 0,6-0,8). Da die meisten Forscher über Nacht Wachstum durchführen, ermöglicht es mehr Kontrolle und reduzierte Chance der Überwucherung. </li><li> Prüfen Sie flüssige Kulturen auf Trübungen (ca. OD 600 von 0,6-0,8). Legen Sie alle trüben Rohre auf 4 ° C und lassen Sie andere Röhrchen trüben, indem Sie länger wachsen. HINWEIS: Bakterien nicht auf OD 600- Werte wachsen, die größer als empfohlen sind, da Plasmid-Instabilitätsereignisse auftreten können. </li><li> Extrahieren Sie Plasmid-DNA aus Bakterien mit einem handelsüblichen Plasmid-Miniprep-Kit (siehe Materialtabelle). Eluieren in 15 &amp; mgr; l vorgewärmtem (bis 70 ° C in einem Heizblock) Elutionspuffer. Lassen Sie den Elutionspuffer 5 Minuten lang vor der Zentrifugation auf die Säule inkubieren. HINWEIS: Bewahren Sie mindestens 1 ml dieser Starterkultur bei 4 ° C fürWeiter im nächsten Schritt. </li><li> Digg 10 &amp; mgr; l der gewonnenen Plasmide, um zu beurteilen, ob Plasmid-Instabilitätsereignisse während der Kultur auftraten. HINWEIS: Digit p1 mit SalI / NheI und p2 mit BamHI / HindIII bei 37 ° C für 1 h. Bestätigen Sie die Anwesenheit der korrekten Banden nach der Verdauung (Abbildung 2a ) durch Gelelektrophorese und fahren Sie mit Schritt 2 fort. Wenn Sie Plasmid-DNA durch Walzkreisverstärkung (RCA) vorbereiten, reservieren Sie ein Teil des Miniprep-Eluats, um als Vorlage zu dienen. </li></ol> 2. Herstellung von ausreichend Plasmid-DNA zur Ligation HINWEIS: Die Ligation und die anschließende Elektroporation erfordert eine ausreichende Menge an Plasmid-DNA, die entweder über Maxiprep oder RCA erzeugt werden muss. Während maxiprep der traditionell verwendete Ansatz ist, bietet RCA den Vorteil, dass keine Bakterien erforderlich sind, wodurch das Potential für die Plasmid-induzierte Toxizität in Bakterien, die zu Instabilitätsereignissen führen können, entfernt wird. <ol><li><stRong&gt; Führen Sie das folgende maxiprep-Verfahren durch. <ol><li> Für jedes Plasmid, das im vorigen Abschnitt das korrekte Restriktionsenzym-Verdauungsmuster nachgewiesen hat, fügen Sie 500 &amp; mgr; l Starterkultur zu 1 l TB-Carb (25 &amp; mgr; g / ml Carbenicillin) -brühe hinzu und schütteln über Nacht bei 30 ° C (ungefähr 14-16 h , Etwa OD 600 von 0,6-0,8). HINWEIS: Lassen Sie die Kultur nicht über diesen OD 600- Wert wachsen. Dies führt möglicherweise zu Instabilitätsereignissen innerhalb der Plasmide. </li><li> Ernten Sie die Bakterien und führen Sie maxipreps pro Hersteller-Protokoll (siehe Material-Tabelle). </li></ol></li><li> Verwenden Sie die gespeicherten Miniprep ab Schritt 1.6, führen Sie die folgenden für die RCA-Prozedur durch. <ol><li> Übertragen Sie 1 &amp; mgr; l Plasmid-DNA in ein Röhrchen, das 50 &amp; mgr; l Probenpuffer enthält. </li><li> Die Probe bei 95 ° C für 3 min erhitzen und dann bei 4 ° C inkubieren, bis sie gebrauchsfertig sind. </li><li> Bereitet die kommerzielle Verstärkung vorVormischung (siehe Werkstofftabelle ). Kombinieren Sie 50 μl Reaktionspuffer mit 2 μl Enzymmischung in einem auf Eis eingesetzten Röhrchen. HINWEIS: Die Amplifikationsvormischung sollte bis zum Gebrauch auf Eis gehalten werden. Es ist zweckmäßig, eine Mastermischung durch Kombination von ausreichenden Reagenzien für die erforderliche Anzahl von Amplifikationsreaktionen herzustellen. Eine nicht genutzte Vormischung muss verworfen werden. </li><li> Übertragen Sie 50 &amp; mgr; l der vorbereiteten Amplifikationsvormischung auf die denaturierte Probe. </li><li> Inkubieren Sie die Reaktionsröhrchen bei 30 ° C für 18 h. </li><li> Inkubieren Sie die Röhrchen bei 65 ° C für 10 min, um die ø29-DNA-Polymerase zu inaktivieren. </li><li> Die Reaktionsrohre bei 4 ° C oder -20 ° C bis zum Gebrauch aufbewahren. HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt sollte die Plasmid-DNA, die über beide Methoden hergestellt wurde, quantifiziert werden (unter Verwendung von Absorption bei 260 nm), und das ZIKV-Genom sollte Sanger sequenziert werden, um zu bestätigen, dass keine Instabilitätsereignisse (Deletionen und Umlagerungen) während der Präparation auftraten. </li></ol></li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Primer Name </td><td> Sequenz (5 &#39;- 3&#39;) </td></tr><tr><td> ZIKV PRVABC59 1Für. </td><td> AGTTGTTGATCTGTGTGAATCAGAC </td></tr><tr><td> ZIKV konserviert 632Für. </td><td> GCCCTATGCTGGATGAGG </td></tr><tr><td> ZIKV konserviert 692Rev. </td><td> GGTTCCGTACACAACCCAAGTTG </td></tr><tr><td> ZIKV konserviert 1313Rev. </td><td> CTCCCTTTGCCAAAAAGTCCACA </td></tr><tr><td> ZIKV konserviert 1201Für. </td><td> CCAACACAAGGTGAAGCCTAC </td></tr><tr><td> ZIKV konserviert 1663Für. </td><td> GCAGACACCGGAACTCCACACT </td></tr><tr><td> ZIKV konserviert 2008Für. </td><td> CAGATGGCGGTGGACATGC </td></tr><tr><td> ZIKV konserviert 2350Rev. </td><td> GTGAGAACCAGGACATTCCTCC </td></tr><tr><td> ZIKV konserviert 2605Für. </td><td> TACAAGTACCATCCTGACTCCC </td></tr><tr><td> ZIKV konserviert 3499Rev. </td><td>GCCTTATCTCCATTCCATACCA </td></tr><tr><td> ZIKV Konserviert 3961Rev. </td><td> TTGCCAACCAGGCCAAAG </td></tr><tr><td> ZIKV konserviert 4132Für. </td><td> CATTTGTCATGGCCCTGG </td></tr><tr><td> ZIKV konserviert 4561Rev. </td><td> CTATTGGGTTCATGCCACAGAT </td></tr><tr><td> ZIKV konserviert 4665Für. </td><td> GACCACAGATGGAGTGTACAGAGT </td></tr><tr><td> ZIKV konserviert 5189Rev. </td><td> AAGACAGTTAGCTGCTTCTTCTTCAG </td></tr><tr><td> ZIKV konserviert 5219Für. </td><td> GAGAGTTCTTCCTGAAATAGTCCGTGA </td></tr><tr><td> ZIKV konserviert 6086Rev. </td><td> CTTGCTTCAAGCCAGTGTGC </td></tr><tr><td> ZIKV konserviert 6119Für. </td><td> GCCTCATAGCCTCGCTCTATCG </td></tr><tr><td> ZIKV konserviert 6721Rev. </td><td> CCATTCCAAAGCCCATCTTCCC </td></tr><tr><td> ZIKV konserviert 6769Für. </td><td> CCAGCCAGAATTGCATGTGTCC </td></tr><tr><td> ZIKV Konserviert 7209Rev. </td><td> ATCATTAGCAGCGGGACTCCAA </td></tr><tr><td> ZIKV Konserviert 7343Für. </td><td> GTTGTGGATGGAATAGTGGT </td></tr><tr><td> ZIKV Konserviert 8243Für. </td><td> TGCCCATACACCAGCACTATGA </td></tr><tr><td> ZIKV PRVABC59 8893Rev. </td><td> TGCATTGCTACGAACCTTGTTG </td></tr><tr><td> ZIKV konserviert 9133Für. </td><td> AGCCCTTGGATTCTTGAACGAGGA </td></tr><tr><td> ZIKV PRVABC59 9673Rev. </td><td> AACGCAATCATCTCCACTGACT </td></tr><tr><td> ZIKV konserviert 9686Für. </td><td> GATGATAGGTTTGCACATGCC </td></tr><tr><td> ZIKV Konserviert 10321Rev. </td><td> GTCCATGTACTTTTCTTCATCACCTAT </td></tr><tr><td> ZIKV konserviert 10455Für. </td><td> CAGGAGAAGCTGGGAAACC </td></tr><tr><td> ZIKV konserviert 10621Rev. </td><td> CAGATTGAAGGGTGGGGAAGGTC </td></tr></tbody></table> Tabelle 1: Primer zur Sequenzierung von cDNA-Klonen. Plasmide können vollständig mit den aufgeführten Primern sequenziert werden. Primer markiert als &quot;konserviert&quot; indiDass sie wahrscheinlich alle Genotypen von ZIKV sequenzieren / verstärken können. Primer, die als &quot;PRVABC59&quot; markiert sind, sind spezifisch für diesen Stamm, können aber auch für andere asiatische Genotypstämme und möglicherweise auch andere Genotypen funktionieren. 3. Herstellung von in vitro transkribierter RNA <ol><li> Richten Sie die Verdauungsreaktion von entweder maxiprep oder RCA vorbereitete DNA ein. <ol><li> Zur p1-Verdauung werden 10 μl 10x Reaktionspuffer, 3 μl ApaLI, 3 μl BamHI-HF, 3 μl rSAP oder CIP und 3,3 μg p1 DNA vermischt. Füge ddH 2 O zu 100 μl hinzu. </li><li> Zur p2-Verdauung 10 μl 10x Reaktionspuffer, 3 μl ApaLI, 3 μl EcoRI-HF und 13,3 μg p2 DNA mischen. Füge ddH 2 O zu 100 μl hinzu. </li><li> Inkubieren bei 37 ° C für 1-2 h. </li><li> Reinigen Sie mit einem handelsüblichen Gel- und PCR-Clean-up-Kit (siehe Materialtabelle). Eluieren in 30 &amp; mgr; l Elutionspuffer, der auf 70 ° C in einem Heizblock vorgeheizt ist (inkubieren derSpalte für 5 min vor dem Spinnen). HINWEIS: Halten Sie 1 μL auf einem Gel später. </li></ol></li><li> Ligationsreaktion vorbereiten. <ol><li> Kombinieren Sie 10 μl 10x T4-DNA-Ligationsreaktionspuffer, 3 μl T4-DNA-Ligase (400 U / μL), 29 μl gereinigtes p1 und 29 μl gereinigtes p2. Füge ddH 2 O zu 100 μl hinzu. </li><li> Inkubieren bei Raumtemperatur für 2 h oder 16 ° C über Nacht. </li><li> Reinigen Sie mit einem handelsüblichen Gel- und PCR-Clean-up-Kit (siehe Materialtabelle). Eluieren in 10 &amp; mgr; l Elutionspuffer, der auf 70 ° C in einem Heizblock vorgeheizt wurde (5 Minuten vor dem Spinnen inkubieren). HINWEIS: Halten Sie 1 μL auf einem Gel später. </li></ol></li><li> Führen Sie unverdaute Plasmide, verdaute Plasmide und Ligation auf einem Agarosegel. Das Ligationsprodukt sollte eine höhere Molekulargewichtsbande (etwa 11 kb) als nur verdautes Plasmid allein aufweisen, was anzeigt, dass die Ligation erfolgreich war ( 2b ).</li><li> Richten Sie T7 in vitro Transkriptionsreaktion ein. <ol><li> Kombinieren Sie 10 &amp; mgr; l 2 × ARCA / NTP-Mischung, 2 &amp; mgr; l T7-RNA-Polymerase-Mischung und 8 &amp; mgr; l gereinigte Ligationsreaktion für ein Endvolumen von 20 &amp; mgr; l. HINWEIS: Die im Mix enthaltene ARCA ist ein Cap-Analog, das exklusiv in die richtige Orientierung integriert ist. Standard-Cap-Analoga können nur ~ 50% der Transkripte mit einer Kappe in der richtigen Orientierung führen. </li><li> 5 h bei 37 ° C inkubieren. </li><li> Messung der RNA-Konzentration über ein UV-Spektrophotometer. Gegebenenfalls ein denaturierendes Agarosegel ausführen, um die Länge des RNA-Transkripts zu bestätigen. </li></ol></li></ol> 4. Rettung des Infektionsvirus durch Elektroporation <ol><li> Tage vor der Elektroporation, 1 T182-Kolben von Vero-Zellen herstellen (zwischen T150 und T182 ist akzeptabel, in DMEM + 10% fötalem Rinderserum (FBS) gezüchtet) pro zu ersetzendes Konstrukt. Füge 1 T182 als Mock-Transfektionskontrolle ein. CeSollte bei 70-80% Konfluenz verwendet werden. </li><li> Wenn die Zellen fertig sind, legen Sie 12 ml / Reaktion von DMEM + 15% FBS + 10 mM HEPES in ein auf 37 ° C erwärmtes Wasserbad. </li><li> Lösen Sie Zellen durch Trypsinisierung mit einem Standardprotokoll und gewinnen Sie Zellen in Medien mit 10% FBS, um Trypsin zu inaktivieren; Zentrifugen von Zellen bei 150 xg für 5 min bei 4 ° C. </li><li> Waschen von Zellen in 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), Pelletieren von Zellen bei 150 xg für 5 min bei 4 ° C. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal für insgesamt drei Wäschen. </li><li> Resuspendieren von Zellen in 200 &amp; mgr; l RPMI 1640 + 10 mM HEPES (steril) pro Anzahl der Proben. 200 μl Zellsuspension in ein steriles Röhrchen überführen. Zellen sollten ~ 0,5 x 10 7 Zellen / ml sein. </li><li> Füge 20 μl Wasser (Mock Neg. Kontrolle) oder 20 μl RNA (vorzugsweise 5-10 μg) in Schritt 3.4 zu jedem Satz von Zellen zu. Mischen Sie vorsichtig, indem Sie das Röhrchen schlagen und den Inhalt des Röhrchens in eine 2 mm Spalt-Elektroporationsküvette übertragen. </li><li> Elektrisch einstellenOporator auf 170 V LV, Omega (Widerstand) bei 0 und 950 μF (ca. 625 V / cm und 20 ms Zeitkonstante für andere Maschinen). Stellen Sie den Widerstand auf die niedrigste verfügbare Einstellung ein, entweder 0 oder ∞ falls vorhanden. </li><li> Pulse einmal und fügt sofort 600 μl DMEM +15% FBS +10 mM HEPES hinzu, das in Schritt 4.2 erwärmt wurde. Innerhalb der Küvette gründlich ausspülen, um alle Zellen zu entfernen. Füge Zellen zu einem T75-Gewebekulturkolben hinzu, der 10 ml vorgewärmtes Medium enthält. Entfernen Sie zusätzliche Medien aus der Küvette, indem Sie die mit der Küvette enthaltene Tropfmaschine verwenden. Sei vorsichtig, um die Sterilität aufrechtzuerhalten. </li><li> Wirbelkolben zum Mischen von Medien und Zellen und Platzieren in 37 ° C Inkubator. </li><li> Überprüfen Sie den nächsten Tag auf die Lebensfähigkeit der Zellen und tun Sie es jeden Tag bis 50-75% Zelltod beobachtet wird. Der Zelltod wird durch Vergleich mit der mockelektroporierten Kontrolle beobachtet. HINWEIS: Der ZIKV-Zytopathie-Effekt (CPE) ist in Vero-Zellen sehr ausgeprägt, was zu aufgerundeten Zellen führt, die sich im Kulturmedium ablösen und schwimmen. Wir habenBeobachtete eine Reichweite von 8-10 Tagen als ideal für die Ernte. </li><li> Ernteüberstand in einem konischen Rohr und zentrifugieren, um Zellschutt bei&gt; 3.000 xg für 10 min bei 4 ° C zu entfernen. </li><li> Den geklärten Überstand auf ein neues Röhrchen auftragen und mit einer Endkonzentration von 20% FBS (ab 100% Lager) ergänzen. Zusätzlich fügen Sie sterile HEPES in einer Endkonzentration von 10 mM als Puffermittel hinzu, um die Virusinfektiosität zu bewahren, während sie gefroren sind (aus einem 1 M sterilen Bestand). </li><li> Mischen Sie das Virus durch Vortexen und Aliquot in Schraubverschluss-Durchstechflaschen. Bei -80 ° C für zukünftige Verwendung lagern. </li></ol> 5. Titration des wiederhergestellten Virus <ol><li> Saat die passende Anzahl von 6- oder 12-Well-Platten von Vero-Zellen am Tag vor der Titration. </li><li> Virus aus dem Gefrierschrank entfernen und serielle 10-fache Verdünnungen in DMEM + 2% FBS in Röhrchen oder 96-Well-Platten herstellen. HINWEIS: Der erwartete Titer aus wiederhergestellten Klonen liegt zwischen 1 x 10 6 und 5 x 10 7 PFU / mL. </li><li> Hinzufügen 200 oR 400 &amp; mgr; l jeder Verdünnung in Duplikat zu einer Vertiefung einer 12- bzw. 6-Well-Platte. </li><li> Legen Sie Platten in 37 ° C Inkubator und Felsen alle 15 min, für insgesamt 1-1,5 h Adsorption Zeitraum. </li><li> Entfernen Sie das Virus-Inokulum und fügen Sie 1 ml (12-Well) oder 2 ml (6-Well) DMEM-Tragacanth-Overlay zu jeder Vertiefung hinzu. HINWEIS: Hierbei können Agarose, Agar, Methylcellulose oder andere Überlagerungsmedien verwendet werden. </li><li> Inkubieren von Zellen in 37 ° C Inkubator für 5 Tage. Die Zeit für die richtige Plaque-Bildung hängt von der verwendeten Überlagerung ab. </li><li> Um die Zellen zu fixieren, entfernen Sie die Platten aus dem Inkubator und dekantieren Sie die Überlagerung sanft in das Desinfektionsmittel. </li><li> Füge ausreichend 20% Ethanol / 0,1% Kristallviolett (CV) zu jeder Vertiefung hinzu, um zu bedecken und zu mischen zu mischen. HINWEIS: Viele andere Fixiermittel existieren und können hier verwendet werden. Zusätzlich kann bei Verwendung eines Agarose- oder Agar-Overlays eine zweite Overlay in Verbindung mit neutralem Rot verwendet werden, um Plaques ohne Fixierung zu visualisieren. 20% Ethanol hat sich gezeigtWirksam bei der Inaktivierung von umhüllten Viren in früheren Studien; Verwenden Sie diesen Betrag nicht für nicht umhüllte Viren, da sie nicht inaktiviert werden. 19 . </li><li> Inkubieren von Platten für 30-60 min bei Raumtemperatur (in einem Klasse II Biosicherheitsschrank); CV (nach örtlichen Vorschriften) verwerfen und Platten mit Leitungswasser waschen. </li><li> Lassen Sie die Platten trocknen und legen Sie Plaques manuell ein. HINWEIS: Referenz 20 kann als zusätzliche Referenz für die Durchführung von Plaque-Assays verwendet werden. </li></ol>

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<li>Kinney, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avian+virulence+and+thermostable+replication+of+the+North+American+strain+of+West+Nile+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">Avian virulence and thermostable replication of the North American strain of West Nile virus.</a> J Gen Virol. 87 (Pt 12), 3611-3622 (2006).</li>
<li>Chang, A. C., Cohen, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+characterization+of+amplifiable+multicopy+DNA+cloning+vehicles+derived+from+the+P15A+cryptic+miniplasmid%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Construction and characterization of amplifiable multicopy DNA cloning vehicles derived from the P15A cryptic miniplasmid.</a> J Bacteriol. 134 (3), 1141-1156 (1978).</li>
<li>Weger-Lucarelli, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+Characterization+of+Recombinant+Virus+Generated+from+a+New+World+Zika+Virus+Infectious+Clone%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Development and Characterization of Recombinant Virus Generated from a New World Zika Virus Infectious Clone.</a> J Virol. 91 (1), (2017).</li>
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<li>Baer, A., Kehn-Hall, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+concentration+determination+through+plaque+assays%3A+using+traditional+and+novel+overlay+systems%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems.</a> J Vis Exp. (93), e52065(2014).</li>
<li>Weger-Lucarelli, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+Characterization+of+Recombinant+Virus+Generated+from+a+New+World+Zika+Virus+Infectious+Clone%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Development and Characterization of Recombinant Virus Generated from a New World Zika Virus Infectious Clone.</a> J Virol. , (2016).</li>
<li>Grubaugh, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+Drift+during+Systemic+Arbovirus+Infection+of+Mosquito+Vectors+Leads+to+Decreased+Relative+Fitness+during+Host+Switching%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Genetic Drift during Systemic Arbovirus Infection of Mosquito Vectors Leads to Decreased Relative Fitness during Host Switching.</a> Cell Host Microbe. 19 (4), 481-492 (2016).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Hier beschreiben wir eine Methode zur Rückgewinnung eines bipartiten infektiösen cDNA-Klonsystems für ZIKV. Zuvor beschriebene Klone für ZIKV leiden entweder unter einer Abschwächung oder erfordern die Zugabe von Introns, wodurch die Plasmide größer werden und die Rettung in Insektenzellen verhindert wird. Infektiöse Viren können mit dem Zwei-Plasmid-Klonsystem entweder in Säugetier- oder Insektenzellen wiedergefunden werden (Daten nicht gezeigt). Darüber hinaus verhalten sich Viren, die aus diesem System gewonnen werden...

Zika-Virus (ZIKV, Familie Flaviviridae : Gattung Flavivirus ) ist ein Moskito-getragenes Flavivirus, das in Brasilien in den Jahren 2013-14 angekommen ist und anschließend mit einem massiven Ausbruch der fiebrigen Krankheit verbunden war, die sich in ganz Amerika verbreitete 1 . Darüber hinaus wurde ZIKV mit schwerwiegenden Erkrankungen wie dem Guillain-Barré-Syndrom bei Erwachsenen und Mikrozephalie bei Föten und Neugeborenen verknüpft 2 . Wenig war über ZIKV vor seiner schnellen Verbreitung in der westlichen Hemisphäre bekannt. Dazu gehört ein Mangel an molekularen Werkzeugen, was die mechanistische Forschung behindert. Molekulare Werkzeuge für Viren, wie infektiöse cDNA-Klone, erleichtern die Impfung und die antivirale therapeutische Entwicklung und ermöglichen die Bewertung von viralen genetischen Faktoren, die mit der differentiellen viralen Pathogenese, der Immunantwort und der viralen Evolution zusammenhängen. Flavivirus-infektiöse Klone sind bekannt, dass sie in Bakterien aufgrund von cr stark instabil sindYptische prokaryotische Promotoren, die in ihren Genomen vorhanden sind 3 . Es wurden mehrere Ansätze verwendet, um dieses Problem zu lindern; Einschließlich der Insertion von Tandemwiederholungen stromaufwärts von viralen Sequenzen 4 , Mutation von mutmaßlichen prokaryotischen Promotorsequenzen 5 , Aufteilen des Genoms in mehrere Plasmide 6 , Vektoren mit niedriger Kopienzahl (einschließlich bakterieller künstlicher Chromosomen) 7 , 8 und Insertion von Introns im viralen Genom 9 . Ein einseitiges System ohne Modifikationen wurde für ZIKV beschrieben; Dieser Klon schien jedoch in der Zellkultur und bei den Mäusen 10 zu dämpfen. Andere Gruppen haben Introns in das ZIKV-Genom konstruiert, was eine Störung von instabilen Sequenzen in Bakterien ermöglicht, die in Säugetierzellen in vitro zur Herstellung von infektiösem Virus 11 gespleißt werden können, 12 Zusätzlich wurde ein PCR-basiertes System mit dem Titel Infectious-Subgenomic-Amplicons erfolgreich eingesetzt, um den Prototyp MR766-Stamm von ZIKV 13 zu retten. Der hier beschriebene Ansatz erfordert keine Fremdsequenzen, sondern stört das Genom im Bereich hoher Instabilität durch die Verwendung mehrerer Plasmide, die bisher erfolgreich mit Gelbfieber 6 , Dengue 14 , 15 und West-Nil-Viren 16 verwendet wurden. Darüber hinaus erleichtert die Zugabe der Hepatitis-D-Ribozym-Sequenz an den viralen genomischen Termini die Schaffung eines authentischen 3&#39;-Endes ohne die Notwendigkeit der Addition einer Linearisierungsstelle. Zusätzlich werden beide Plasmide in einem Vektor mit niedriger Kopienzahl (pACYC177, ~ 15 Kopien pro Zelle) konstruiert, um jegliche Resttoxizität 17 zu mildern. Das gewonnene Virus zeigt ein vergleichbares Wachstumsprofil anElterliches Virus in in vitro Wachstumskurven in 8 Zelllinien, die eine Vielzahl von Zelltypen umfassen, die von Säugetieren und Insekten abgeleitet sind, und hat identische pathogene Profile bei Mäusen und Infektions-, Verbreitungs- und Übertragungsraten in den Mücken 18 gezeigt . Hierin beschreiben wir ein Protokoll, in dem beschrieben wird, wie man die infektiösen Klonplasmide wächst, in vitro eine Volllängen-Virus-RNA (das virale Genom) erzeugt und in der Zellkultur ein infektiöses Virus wiederherstellt. Zuerst beschreiben wir die Ausbreitung von Plasmiden in Bakterien oder bakterienfreien Verstärkung mittels Rollkreisverstärkung (RCA). Als nächstes zeigen wir, wie die beiden Plasmide verdaut werden und dann anschließend miteinander ligiert werden, um ein Volllängenvirus zu erzeugen. Schließlich beschreiben wir die Produktion von transkribierter RNA und deren anschließende Elektroporation in Vero-Zellen, gefolgt von Titration des gewonnenen Virus (Abbildung 1 ). Der beschriebene Ansatz ist schnell, so dass foR Erholung von infektiösen Virusbeständen in 1-2 Wochen.

<table><tbody><tr><td>NEB Stable CompetentE. coli</td><td>New England BioLabs</td><td>C3040H</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicillin, Dinatriumsalz</td><td>verschiedene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zyppy Plasmid Miniprep Kit</td><td>Zymo Research</td><td>D4036</td><td></td></tr><tr><td>ZymoPURE Plasmid Maxiprep Kit</td><td>Zymo Research</td><td>D4202</td><td></td></tr><tr><td>SalI-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3138S</td><td>20.000 Einheiten/ml</td></tr><tr><td>NheI-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3131S</td><td>20.000 Einheiten/ml</td></tr><tr><td>ApaLI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0507S</td><td>10.000 Einheiten/ml</td></tr><tr><td>EcoRI-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3101S</td><td>20.000 Einheiten/ml</td></tr><tr><td>BamHI-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3136S</td><td>20.000 Einheiten/ml</td></tr><tr><td>HindIII-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3104S</td><td>20.000 Einheiten/ml</td></tr><tr><td>illustra TempliPhi 100 Amplifikationskit</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>25640010</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin Gel und PCR Clean-up</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740609.5</td><td></td></tr><tr><td>Alkalische Phosphatase (rSAP)</td><td>New England BioLabs</td><td>M0371S</td><td>1.000 Einheiten/ml</td></tr><tr><td>Alkalische Phosphatase, Kälberdarm (CIP)</td><td>New England BioLabs</td><td>M0290S</td><td>10.000 Einheiten/ml</td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>New England BioLabs</td><td>M0202S</td><td>400.000 Einheiten/ml</td></tr><tr><td>HiScribe T7 ARCA mRNA Kit</td><td>New England BioLabs</td><td>E2065S</td> Vero Zellen <td></td></tr><tr><td></td><td>ATCC</td><td>CCL-81</td><td></td></tr><tr><td>ECM 630 Hochdurchsatz-Elektroporationssystem</td><td>BTX</td><td>45-0423</td><td>Andere Geräte sind akzeptabel.</td></tr><tr><td>LB Bouillon mit Agar (Miller)</td><td>Sigma</td><td>L3147</td><td>Kann auch hausgemacht werden.</td></tr><tr><td>Grandiose Brühe</td><td>Sigma</td><td>T0918</td><td>Kann auch hausgemacht werden.</td></tr><tr><td>Petrischale</td><td>Celltreat</td><td>229693</td><td></td></tr><tr><td>Kulturröhrchen</td><td>VWR International</td><td>60818-576</td><td></td></tr><tr><td>T75 Kolben</td><td>Celltreat</td><td>229340</td><td></td></tr><tr><td>T182 Kolben</td><td>Celltreat</td><td>229350</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 mit L-Glutamin</td><td>Corning</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>DMEM mit L-Glutamin und 4,5 g/L Glukose</td><td>Corning</td><td>10-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>Fetales Rinderserum (FBS)</td><td>Atlas Biologicals</td><td>FP-0500-A</td><td></td></tr><tr><td>Traganth Pulver</td><td>MP Bio</td><td>MP 104792</td><td></td></tr><tr><td>Crystal Violet</td><td>Amresco</td><td>0528-1006</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol denaturiert</td><td>VWR International</td><td>BDH1156-1LP</td><td></td></tr><tr><td>6-Well-Platte</td><td>Celltreat</td><td>229106</td><td></td></tr><tr><td>12-Well-Platte</td><td>Celltreat</td><td>229111</td><td></td></tr><tr><td>Sequencing Oligos</td><td>IDT</td><td>siehe Tabelle 1</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 3.0</td><td>ThermoFisher</td><td>Qubit 3.0</td><td>andere Methoden sind akzeptabel.</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA BR Assay Kit</td><td>ThermoFisher</td><td>Q32850</td><td>andere Methoden sind akzeptabel.</td></tr><tr><td>Qubit RNA HS Assay Kit</td><td>ThermoFisher</td><td>Q32852</td><td>andere Methoden sind akzeptabel.</td></tr><tr><td>Biosicherheitswerkbank der Klasse II</td><td>variiert</td><td>N/A</td><td>Dies ist für die Arbeit mit lebenden Viren erforderlich.</td></tr></tbody></table>

rettung und charakterisierung des rekombinanten virus aus einer neuen welt zika virus infectious clone

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

Infektiöse cDNA-Klone erlauben die genetische Manipulation eines Virus und erleichtern so die Arbeit an Impfstoffen, Pathogenese, Replikation, Übertragung und Virusentwicklung. Hier beschreiben wir den Aufbau eines infektiösen Klons für Zika Virus (ZIKV), der derzeit einen explosiven Ausbruch in Nord- und Südamerika verursacht. Um Toxizität gegenüber Bakterien zu verhindern, die häufig mit Flavivirus-abgeleiteten Plasmiden beobachtet wird, erzeugten wir ein Zwei-Plasmid-System, das das Genom am NS1-Gen trennt und stabiler ist als Volllängen-Konstrukte, die ohne Mutationen nicht erfolgreich gewonnen werden konnten. Nach der Verdauung und Ligation, um die beiden Fragmente zu verbinden, kann eine Volllängen-Virus-RNA durch in vitro- Transkription mit T7-RNA-Polymerase erzeugt werden. Nach der Elektroporation von transkribierter RNA in Zellen wurde das Virus gewonnen, das ähnliche In-vitro- Wachstumskinetiken und In-vivo- Virulenz- und Infektions-Phänotypen in Mäusen und Mücken zeigte.

Das hier beschriebene Protokoll ermöglicht die Wiederherstellung von infektiösem Klon-abgeleiteten Zika-Virus. Das Manipulieren des Zwei-Plasmid-Infektios-Klonsystems ist einfach, wenn es mit Sorgfalt durchgeführt wird, im Vergleich zu Volllängen-Versionen, die sehr instabil sind (Daten nicht gezeigt). Nach der Verdauung und Ligation der beiden verschiedenen Stücke wird eine Capped-RNA unter Verwendung einer in vitro- Transkription mit T7-Polymerase hergestellt, die dann in Vero...

Dieses Protokoll beschreibt die Wiederherstellung des infektiösen Zika-Virus aus einem zwei-Plasmid-infektiösen cDNA-Klon.

Rettung und Charakterisierung des rekombinanten Virus aus einer neuen Welt Zika Virus Infectious Clone

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, infektiöses Virus aus einem zweiteiligen Z-DNA-Klon des Zika-Virus zu gewinnen. Diese Methode kann zentrale Fragen auf dem Gebiet der Flavivirologie beantworten, wie beispielsweise zur Impfstrategie, Pathogenese, Übertragung und Virusentwicklung. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass das zweiteilige System stabiler ist als Ansätze mit voller Länge.Obwohl diese Methode Einblicke in das Zika-Virus ermöglichen kann, ist sie auch auf andere virale Systeme anwendbar, die sich aufgrund von Plasmidinstabilität als schwierig zu klonen erwiesen haben. Die Durchführung des Verfahrens wird James Weger, ein Postdoktorand aus meinem Labor, demonstrieren. Beginnen Sie damit, die Verdauungsreaktionen für beide Plasmide vorzubereiten, die das Genom des Zika-Virus codieren, P1 und P2. Verdauen Sie 3,3 Mikrogramm von P1 mit ApaL1 und BamH1 High Fidelity in Gegenwart einer kompetenten Phosphatase in einem Endvolumen von 100 Mikrolitern.Für P2 verdauen Sie 13,3 Mikrogramm P2-DNA mit ApaL1 und EcoR1 High Fidelity in einem Endvolumen von 100 Mikrolitern. Inkubieren Sie beide Ansätze bei 37 Grad Celsius für 1,2 Stunden. Nach der Reinigung der verdauten Plasmide mit einem kommerziellen Gel- und PCR-Reinigungs-Kit geben Sie 30 Mikroliter Elutionspuffer, der auf 70 Grad Celsius vorgewärmt wurde, auf die Säule und inkubieren für fünf Minuten.Nachdem die gereinigten, verdauten Plasmide abzentrifugiert wurden, bereiten Sie die Ligationsreaktion vor, indem Sie 29&nbsp;Mikroliter gereinigtes P1 und 29&nbsp;Mikroliter gereinigtes P2 mit T4-DNA-Ligationspuffer und T4-DNA-Ligase in doppelt destilliertem Wasser zu einem Endvolumen von 100&nbsp;Mikrolitern kombinieren. Inkubieren Sie die Ligationsreaktion zwei Stunden lang bei Raumtemperatur. Reinigen Sie danach das ligierte Plasmid wie zuvor beschrieben. Verwenden Sie diesmal 10 Mikroliter vorgewärmten Elutionspuffer. Führen Sie anschließend die undigestierte Plasmide, die digestierte Plasmide und die Ligationsreaktion auf einem Agarosegel durch. Eine erfolgreiche Ligationsreaktion sollte ein Ligationsprodukt von etwa 11 kb ergeben.Nachdem bestätigt wurde, dass die Plasmide die korrekte molare Masse aufweisen, richten Sie eine T7-In-vitro-Transkriptionsreaktion mit acht Mikrolitern der gereinigten Ligationsreaktion ein und inkubieren diese vier Stunden bei 37 Grad Celsius. Nach der Inkubation bestimmen Sie die RNA-Konzentration mittels eines UV-Spektrophotometers. Ein oder zwei Tage vor der Elektroporation bereiten Sie pro zu isolierendem Konstrukt einen T182-Fläschchen mit Vero-Zellen vor.Schließen Sie eine T182-Flasche ein, die als Mock-Elektroporationskontrolle verwendet wird. Wenn die Zellen eine Konfluenz von 70 bis 80 % erreicht haben, erwärmen Sie DMEM, das 15 % FBS und 10 Millimolar HEPES enthält, in einem Wasserbad auf 37 Grad Celsius. Lösen Sie die Zellen durch Trypsinierung gemäß Standardverfahren ab, und sammeln Sie die Zellen sowie das Medium mit 10 % FBS, um die Trypsinaktivierung zu gewährleisten.Anschließend die Zellen bei 150 ×g fünf Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren. Nach dem dreimaligen Waschen der Zellen mit PBS wird jedes Zellenpellet in RPMI 1640 mit 10 Millimolar HEPES auf eine Konzentration von etwa 0,5 × 10⁷ Zellen pro Milliliter resuspendiert. 200 Mikroliter der Zellsuspension in ein steriles Gefäß überführen.Fügen Sie anschließend als Mock-Kontrolle 20 Mikroliter Wasser oder 20 Mikroliter RNA zu jedem Zellansatz hinzu. Mischen Sie die Zellen vorsichtig durch leichtes Anstoßen des Röhrchens und überführen Sie dann den Inhalt des Röhrchens in eine Elektroporationsküvette mit zwei Millimeter Abstand. Stellen Sie den Elektroporator auf 170 Volt, null Omega Widerstand und 950 Mikrofarad ein.Pulsiere die Zellen einmal und gebe sofort 600 Mikroliter des vorgewärmten Mediums hinzu. Gib die Zellen in einen T75-Zellkulturflasche, die 10 Milliliter des vorgewärmten Mediums enthält. Entferne das restliche Medium aus der Küvette mithilfe des mit der Küvette mitgelieferten Tropfers.Schwenken Sie den Kolben, um das Medium und die Zellen zu mischen, und stellen Sie ihn dann in den Inkubator bei 37 Grad Celsius. Am nächsten Tag und an jedem darauf folgenden Tag überprüfen Sie die Zellen auf ihre Vitalität, bis eine Zelltodrate von 50 bis 75 % im Vergleich zur mock-elektroporierten Kontrolle beobachtet wird. Sobald ein Zelltod von 50 bis 75 % festgestellt wird, gewinnen Sie das Überstandmedium in einem kegelförmigen Reaktionsgefäß und zentrifugieren es anschließend bei über 3.000 ×g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius, um zelluläre Trümmer zu entfernen.Nach der Zentrifugation das geklärte Überstand auf ein neues Gefäß übertragen und FBS auf eine Endkonzentration von 20 % hinzufügen. Zusätzlich sterile HEPES auf eine Endkonzentration von 10 Millimolar als Puffermittel hinzufügen, um die Virusinfektiosität während der Gefrierlagerung zu bewahren. Abschließend das Virus durch Vortexen mischen und in Aliquots auf Schraubverschlussgefäße aufteilen. Das Virus bei minus 80 Grad Celsius für zukünftige Verwendung lagern.Dieses Bild zeigt den ähnlichen Effekt des Wildtyps PRVABC59 und des aus einem infektiösen Klon stammenden Zika-Virus auf die Wachstumsdynamik der bei nichtmenschlichen Primaten stammenden Vero-Zelllinie. Dieses Bild zeigt den Effekt beider Viren auf humane Plazentazellen. Ähnliche Wachstumsdynamiken werden in einer aus Mücken stammenden C6/36-Zelllinie beobachtet.Diese Überlebenskurve zeigt Daten von vier Wochen alten Knockout-Mäusen für die Interferon-alpha-, -beta- und -gamma-Rezeptoren, die mit 1.000 PFU des PRVABC59-Virus oder des aus dem infektiösen Klon stammenden Virus infiziert wurden. Aedes aegypti wurden 14 Tage nach einer Blutmahlzeit, die Zika-Virus enthielt, seziert. Plaque-Assays wurden verwendet, um die Infektion in den Moskito-Körpern und Beinen zur Beurteilung der Dissemination bzw. in den Speichelsekreten zur Beurteilung der Übertragung infektiösen Virusmaterials zu untersuchen.Die Raten werden als Prozentsatz der insgesamt getesteten Mücken angegeben. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, das gesamte Virus zu sequenzieren. Ebenso wichtig ist es, das Virus bei 50 bis 75 % CPE zu gewinnen, um die Anzahl der Virusvermehrungszyklen zu minimieren.Diese Technik ist wichtig für die Forschung im Bereich der Flavivirologie, um Impfstoffe, Pathogenese und die Virusentwicklung beim Zika-Virus zu untersuchen.

rescue-characterization-recombinant-virus-from-new-world-zika-virus

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Rettung von Influenza A-Viren von Plasmid-DNA ist eine grundlegende und wichtige experimentelle Technik, die Influenza-Forscher an rekombinanten Viren zu erzeugen, um mehrere Aspekte in der Biologie des Influenza-Virus zu untersuchen und als potentielle Vektoren oder Impfstoffe verwendet werden können.

Erzeugung von rekombinanten Influenza Virus von Plasmid-DNA

Dieses Video zeigt ein Verfahren zur Infektion menschlicher fetaler neuraler Stammzellen mit dem Zika-Virus. Die infizierten Zellen können für weitere Studien verwendet werden.

Zika-Virus-Infektion von fötalen neuralen Stammzellen

Rettung von rekombinanten Arenaviren von geklonten cDNAs, ein Ansatz, so genannte Reverse Genetik, ermöglicht es den Forschern, die Rolle der spezifischen viralen Genprodukte, sowie den Beitrag ihrer unterschiedlichen spezifischen Domänen und Rückstände zu untersuchen, um viele verschiedene Aspekte der Biologie von Arenavirus . Ebenso Techniken reverser Genetik in FDA-zugelassenen Zelllinien (Vero) für die Impfstoffentwicklung bietet neue Möglichkeiten für die Erzeugung und sichere Impfstoffe...

Erzeugung von rekombinanten Arenavirus für die Impfstoffentwicklung in FDA-zugelassenen Vero-Zellen

Zika-Virus (ZIKV), ein neu auftretender Erreger, wird mit fetalen Entwicklungsstörungen und Mikrozephalie in Verbindung gebracht. Die Etablierung eines effektiven infektiösen Zellkultursystems ist entscheidend für die Erforschung der ZIKV-Replikation sowie für die Entwicklung von Impfstoffen und Medikamenten. In dieser Arbeit werden verschiedene virologische Assays zum ZIKV dargestellt und diskutiert.

Zika Virus Infectious Zellkultursystem und die<em&gt; In Vitro</em&gt; Prophylaktische Wirkung von Interferonen

Hier beschreiben wir eine Methode für den Aufbau eines Modells von Zika virusbedingte Mikrozephalie in Maus. Dieses Protokoll enthält Methoden zum embryonalen, Neugeborenen und Erwachsenen-Bühne intrazerebrale Inokulation von Zika-Virus.

Mausmodelle für Zika-Virus-induzierte neurologische Erkrankungen mit intrazerebrale Injektion Strategien etablieren: embryonale, Neugeborene und Erwachsene

Ein Protokoll, Antigen-spezifische T-Zell-Reaktionen in den Organen der Immunabwehr des Ifnar1- / - Mausmodell für die Zika-Virusinfektion (ZIKV) zu bewerten ist beschrieben. Diese Methode ist von zentraler Bedeutung für die Untersuchung der zellulären Mechanismen des Schutzes und immunpathogenese ZIKV Impfstoffe und ist auch wertvoll für die Beurteilung der Wirksamkeit.

Bewertung der Zika-Virus-spezifischen T-Zell-Reaktionen in Organe der Immunabwehr von infizierten Ifnar1- / - Mäusen

Wir beschreiben eine Methode zur Bewertung der Wirkung der vorbestehenden Immunität gegen Dengue-Virus auf der Zika-Virus-Infektion mit humanem Serum, primären humanen Zellen und Infektion Quantifizierung durch quantitative Real-Time Polymerase-Kettenreaktion.

Quantifizierung der Antikörper-abhängige Verstärkung der Zika-Virus in primären humanen Zellen

Die jüngste Epidemie des Zika-Virus unterstreicht, wie wichtig es ist, umgekehrte genetische Ansätze zur Entwicklung von Impfstoffen und/oder therapeutischen Strategien zu entwickeln. Hier beschreiben wir das Protokoll zur Rettung eines infektiösen rekombinanten Zika-Virus aus einem cDNA-Klon in voller Länge, der in einem bakteriellen künstlichen Chromosom unter der Kontrolle des menschlichen Zytomegalievirus zusammengebaut wurde.

Rettung des rekombinanten Zika-Virus aus einem bakteriellen künstlichen Chromosom cDNA-Klon

Das Ziel des Protokolls ist es, die Techniken zu demonstrieren, die verwendet werden, um Viruserkrankungen zu untersuchen, indem das Zika-Virus von mehreren Organen in einer Maus nach einer Infektion isoliert und quantifiziert wird.

Isolierung und Quantifizierung des Zika-Virus aus mehreren Organen in einer Maus

Das vorgestellte Protokoll kann die Vektorkompetenz von Aedes aegypti-Mückenpopulationen für ein bestimmtes Virus, wie Zika, in einer Containment-Umgebung bestimmen.

Vektorkompetenzanalysen an Aedes aegypti Mücken mit Zika-Virus

In dieser Arbeit beschreiben wir die Protokolle, die in replikonbasierten und viralen enzymbasierten Assays verwendet werden, um in einem Hochdurchsatz-Screening-Format nach Inhibitoren der Zika-Virusreplikation zu suchen.

Antivirale Hochdurchsatz-Assays zum Screening auf Inhibitoren der Zika-Virusreplikation

Erfahren Sie die Rettung infektiösen Zika-Virus aus einem zweiteiligen cDNA-Klon für Flavivirus-Forschung. Diese Methode ermöglicht Impfstoffstudien und kann auf andere instabile virale Systeme übertragen werden.

Rettung und Charakterisierung des rekombinanten Virus aus einer neuen Welt Zika Virus Infectious Clone

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