Protein Film Infrarot-Elektrochemie für Studie der H2 Oxidation durch ein [NiFe] Hydrogenase unter Beweis gestellt

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, die aktive Nebenchemie eines Nickel-Eisen-Hydrogenase-Redox-Enzyms sowohl unter Nicht-Umsatz- als auch unter stationären elektrokatalytischen Umsatzbedingungen unter Verwendung der Proteinfilm-Infrarot-Elektrochemie oder PFIRE zu untersuchen. Der Hauptvorteil der PFIRE-Technik besteht darin, dass sie gleichzeitig eine präzise elektrochemische Kontrolle und infrarotspektroskopische Probenahme von Redoxproteinen ermöglicht, die auf einer Kohlenstoffelektrode immobilisiert sind. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen in den Bereichen Biophysik und Bioelektrochemie darüber zu beantworten, welche Zustände von Redoxproteinen während des stationären katalytischen Umsatzes vorhanden sind.

Zu Beginn des Verfahrens werden in einem nassen anaeroben Handschuhfach 20 Milligramm Rußpartikel mit hoher Oberfläche in einem Milliliter Reinstwasser suspendiert. Beschallen Sie die Suspension mindestens 15 Minuten lang bei geringerer Leistung oder bis die Partikel gleichmäßig verteilt sind und sich innerhalb einer Stunde im Ruhezustand kein Sediment bildet. Laden Sie dann 15 Mikroliter einer etwa sieben Milligramm pro Milliliter Lösung der E.Coli-Hydrogenase eins in eine 50-Kilodalton-Zentrifugalfiltereinheit.

Verdünnen Sie die Lösung mit 450 Mikrolitern eines Austauschpuffers mit geringer Ionenstärke und einem pH-Wert nahe dem isoelektrischen Punkt der Hydrogenase. Konzentrieren Sie die Mischung durch Zentrifugation bei 27.000 g auf 50 Mikroliter. Konzentrieren Sie die Mischung noch viermal, um den Pufferaustausch abzuschließen.

Kombinieren Sie dann fünf Mikroliter der 20 Milligramm pro Milliliter Rußdispersion mit der pufferausgetauschten Hydrogenase. Lagern Sie das Gemisch über Nacht bei null Grad Celsius, damit die Hydrogenase von den Rußpartikeln absorbiert werden kann. Überprüfen Sie das Gemisch regelmäßig, um die Partikeldispersion aufrechtzuerhalten.

Zentrifugieren Sie die modifizierten Partikel bei 27.000 g und stellen Sie sicher, dass der Überstand nahezu farblos ist, was auf eine gute Absorption der Hydrogenase an die Partikel hinweist. Das Erreichen eines hohen Absorptionsgrades ist entscheidend für den Erfolg des Experiments. Wir optimieren den Absorptionspuffer, indem wir den Puffer mit niedriger Ionenstärke bei einem pH-Wert nahe dem isoelektrischen Punkt des Proteins als Ausgangspunkt verwenden.

Waschen Sie die Partikel mit drei bis fünf Zyklen Zentrifugation und Resuspension in frischem Austauschpuffer. Konzentrieren Sie das Partikelgemisch auf etwa fünf Mikroliter, um eine Partikelbeladung von 20 Milligramm pro Milliliter zu erreichen. Um mit der Vorbereitung der PFIRE-Messungen zu beginnen, reinigen Sie ein internes Reflexionselement aus Silikon durch 15-minütige Beschallung mit geringer Leistung in Schwefelsäure.

Gefolgt von Salpetersäure für eine Stunde. Spülen Sie das Element dann in Reinstwasser ab und trocknen Sie es unter einem Strahl trockenen Stickstoffgases. Verwenden Sie einen elektrischen Silikondichtstoff, um den IRE in der Grundplatte eines ATR-Zubehörs mit fünf Reflexionen zu befestigen, und achten Sie darauf, dass der Dichtstoff an den Rändern des IRE bleibt.

Lassen Sie den Dichtstoff vollständig trocknen. Bringen Sie dann die Grundplatte in ein trockenes anaerobes Handschuhfach mit einem IR-transparenten Fenster neben ein FTIR-Spektralphotometer. Montieren Sie die Grundplatte am ATR-Zubehör.

Erfassen Sie ein Hintergrundspektrum im Rapid-Scan-Modus. Nehmen Sie dann die ATR-Zubehör-Grundplatte ab und übertragen Sie sie in das nasse anaerobe Handschuhfach. Lassen Sie einen Mikroliter der enzymmodifizierten Rußpartikel gleichmäßig über die IRE-Oberfläche tropfen, ohne die Partikel vollständig trocknen zu lassen.

Es ist wichtig, dass das enzymmodifizierte Partikelgemisch auf eine Beladung von so nahe wie möglich an 20 Milligramm pro Milliliter konzentriert wurde. Andernfalls kann es schwierig sein, beim Dropcasting der Partikel in diesem Schritt einen gut verbundenen Partikelfilm zu erzielen. Legen Sie vorsichtig ein in Reinstwasser getränktes Stück Kohlepapier auf die IRE-Oberfläche und stellen Sie sicher, dass der Partikelfilm bedeckt ist, ohne dass das Papier mit dem Silikondichtstoff in Berührung kommt.

Montieren Sie eine kundenspezifische spektroelektrochemische Zelle über dem IRE. Geben Sie 200 Mikroliter Experimentpuffer über den Lösungseinlass hinzu, um das Enzym während der Systemvorbereitung hydratisiert zu halten. Verbinden Sie den Lösungseinlass und -auslass über einen Schlauch der Peristaltikpumpe mit einem Fläschchen mit Experimentpuffer.

Übertragen Sie dann die zusammengebaute Zelle in die trockene Handschuhbox. Montieren Sie die Zellenbaugruppe am ATR-Zubehör und verbinden Sie den Schlauch mit der Schlauchpumpe. Erfassen Sie ein absorbierendes Spektrum mit dem zuvor erfassten Spektrum als Hintergrund.

Stellen Sie sicher, dass die MI2-Banden bei 1.540 reziproken Zentimetern stark sichtbar sind und dass die Peaks des aktiven Hydrogenase-Zentrums im Bereich von 1.850 bis 2.150 nachweisbar sind. Zur Vorbereitung des Experiments wird ein Reduktionspotential von minus 0,8 Volt gegenüber einer gesättigten Kalomel-Referenzelektrode an den Partikelfilm angelegt. Sättigen Sie den Experimentpuffer mit anaerobem Wasserstoffgas.

Beginnen Sie dann, den Puffer mit etwa 12 Millilitern pro Minute durch die spektroelektrochemische Zelle fließen zu lassen. Lassen Sie die Probe über Nacht unter dem Strom von wasserstoffgesättigtem Experimentpuffer, um die Hydrogenase zu aktivieren. Erfassen Sie ein Absorptionsspektrum der aktivierten Probe und stellen Sie sicher, dass die CO- und CN-Banden des aktiven Zentrums mehrere reduzierte Zustände aufweisen.

Sättigen Sie anschließend den Experimentpuffer mit anaerobem Stickstoffgas und strömen Sie den Puffer durch die Zelle. Legen Sie 30 Minuten lang ein Oxidationspotential von null Volt gegenüber einer gesättigten Kalomel-Referenzelektrode an und erhalten Sie ein absorbierendes Spektrum. Tragen Sie dann 30 Minuten lang ein Reduktionspotenzial auf und nehmen Sie ein weiteres Spektrum auf.

Stellen Sie sicher, dass das Enzym vollständig oxidiert und dann reduziert wurde. Wenn nicht, überprüfen Sie die elektrischen Anschlüsse der Zelle. Unter Verwendung eines anaeroben wasserstoffgesättigten Puffers wird eine Reihe von zyklischen Voltammogrammen bei steigenden Flussraten aufgenommen, um die optimale Flussrate für das Experiment zu bestimmen.

Mit dieser Flussrate erfassen Sie Spektren bei einer Reihe von Potentialen und Lösungsbedingungen. PFIRE-Messungen der E.coli-Hydrogenase eins wurden bei verschiedenen Potentialen in einer inerten Atmosphäre und in Gegenwart von Wasserstoffgas durchgeführt. Die unter Wasserstoffatmosphäre aufgenommenen Spektren stellten die stationären Verteilungen der Zustände des aktiven Zentrums dar, die während der katalytischen Wasserstoffoxidation vorhanden sind.

Das anaerobe Oxidativ und die Aktivierung der Hydrogenase durch Bildung des Nickel-B-Zustands aus dem Nickel-Si wurde dann untersucht, indem Spektren zu verschiedenen Zeitpunkten während der potentiellen Anwendung aufgenommen und verschiedene Spektren relativ zum ersten Spektrum hergestellt wurden. Die beobachtete allmähliche Umwandlung von Nickel-Si in Nickel-B stimmte mit der monotonen Abnahme des Stroms überein. Spektren wurden auch über einen Bereich des pH-Werts der Lösung aufgenommen, um die Protonentransferschritte des katalytischen Hydrogenasezyklus zu untersuchen.

Bei niedrigem pH-Wert war der Nickel-C-Zustand vorherrschender, während der Nickel-L-Zustand bei hohem pH-Wert häufiger vorkam. Die pH-Abhängigkeit der relativen Konzentrationen von Nickel-C und Nickel-L wurde aus den maximalen Absorptionsmittelwerten an den jeweiligen Peaks bei jedem im Experiment ausgewerteten pH-Wert bestimmt. Diese Technik ebnet Forschern auf dem Gebiet der Bioelektrochemie den Weg, die stationäre Kinetik der Wasserstoffaktivierung durch Hydrogenese zu erforschen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis für ein typisches PFIRE-Experiment haben. Die Technik eignet sich für jedes Redoxprotein, das durch Proteinfilmelektrochemie untersucht werden kann, und fügt der elektrochemischen Messung direkte chemische Erkenntnisse hinzu.