Name: Protein Film Infrarot-Elektrochemie für Studie der H2 Oxidation durch ein NiFe Hydrogenase unter Beweis gestellt (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-04T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Erfahren Sie die Protein-Film-Infrarot-Elektrochemie zur Untersuchung der H₂-Oxidation durch [NiFe]-Hydrogenase. Diese Methode ermöglicht präzise elektrochemische Kontrolle und spektroskopische Analyse redoxaktiver Enzyme.

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Die Arbeit des K.A.V. und P.A.A. wurde vom European Research Council (EnergyBioCatalysis-ERC-2010-StG-258600), Engineering and Physical Sciences Research Council IB Catalyst Award EP/N013514/1, und Biotechnologie und biologische Wissenschaften Research unterstützt. Rat (BB/L009722/1 und BB/N006321/1). R.h. wurde unterstützt vom Ministerio de Ciencia y Tecnologìa, Universidad de Costa Rica, und Lincoln College, Oxford. Die Autoren erkennen Mr. Charlie Jones, Mr. Charlie Evans und Mitarbeiter der mechanischen Werkstatt (Chemie) für die Unterstützung bei der Entwicklung und Herstellung von Spectroelectrochemical Zellen, die in dieser Arbeit verwendet.

(1) neu die internen Probenraum ein FTIR-Spektrometer in einem anaeroben, trockenen Glovebox und allgemeine experimentelle Anforderungen
<ol><li>Verwenden Sie eine kommerzielle FTIR-Spektrometer mit externen Quecksilber Cadmium Tellurid (MCT) Detektor und ATR Zubehör ausgestattet. Löschen Sie den Körper des Spektrometers mit trockener Luft oder Distickstoff, oder verwenden Sie alternativ ein Spektrometer mit einer evakuierten optischen Bank.</li>
	<li>Legen Sie das Spektrometer auf eine stabile und vibrationsfreie Tisch auf der gleichen Höhe wie eine anaerobe (< 1 ppm O2), trocknen (Taupunkt <-75 ° C) Glovebox. Leiten Sie den IR-Strahl des Spektrometers in das Handschuhfach, durch ein IR-transparente Fenster, das groß genug für den defokussierten Strahl ist. Hinweis: Es ist wichtig, dass der Abstand zwischen dem Handschuhfach und Spektrometer ist auch gelöscht oder evakuiert, besonders wenn eine hygroskopische Fenstermaterial, z. B. NaCl oder KBr beispielsweise verwendet wird.</li>
	<li>
Replizieren Sie die internen Probenraum des Spektrometers in das Handschuhfach.
	<ol>
<li>Richten Sie den Strahl in das Handschuhfach auf einer einfallenden Ellipsoid Spiegel, idealerweise mit gleicher Brennweite als interne Fokussierung Spiegel des Spektrometers. Hinweis: Es ist nützlich, um zwei weitere Planspiegel vor dieser Fokussierung Spiegel platziert, um die Höhe und Richtung der IR-Strahl in das Handschuhfach angepasst werden können; gegenläufig wird jede Ungenauigkeit bei der anfänglichen Platzierung des Spektrometers.</li>
		<li>Legen Sie einen externe MCT-Detektor, komplett mit einem geeigneten mit Schwerpunkt Optik (z. B. eine kurze Brennweite ZnSe oder einfallenden Parabolspiegel mit einer kurzen Brennweite) innerhalb der Glovebox positioniert wie die Dimensionen der internen Stichprobe replizieren Fach des Spektrometers.</li>
		<li>Einstellen Sie "Schärfe" von den IR-Strahl zu ungefähr äquidistant zwischen der fokussierenden Spiegel und der MCT-Detektor.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cool das Dewar von externen MCT-Detektor mit flüssigem Stickstoff.</li>
	<li>Montieren Sie das ATR-Zubehör in der Glovebox Probenraum. Richten Sie die ein- und Ausgabe mit Schwerpunkt Optik und ATR Accessoire für maximalen Durchsatz an den MCT-Detektor zu erreichen. Verwenden Sie ggf. eine Blende oder andere geeignete Dämpfung (z. B. dem Drahtnetz), Übersättigung des Detektorsignals zu verhindern. Hinweis: für die hier vorgestellten Daten, eine fünf-Reflexion ATR Accessoire mit allen reflektierende Optik und eine abnehmbare trapezförmige Si interne Reflexion Element (IRE) verwendet wird (Crystal GmbH, Maße ca 5 × 8 × 1 mm3, Gesicht Winkel 39,5 °). Das IRE wird in einem abnehmbaren Bodenplatte gefertigt aus Polyether-Ether-Keton (PEEK) montiert.</li>
	<li>Eine Glovebox verwenden, um die neu erstellte Probenraum mit geeigneten Durchführungen ermöglichen Anschluss an ein extern untergebracht Potentiostaten Haus (Gas Dichte BNC-Verbindungen eignen sich für diesen Zweck), Gas-Zugang und Kabel übertragen das Signal aus der MCT Detektor. Es ist wichtig, erhalten Abschirmung am Detektor Kabel einführen Rauschen oder Interferenzen mit den Messungen zu vermeiden.</li>
	<li>Legen Sie eine Schlauchpumpe, in der Lage, Strömungsgeschwindigkeiten größer als 60 mL/min in das Handschuhfach. Eine schematische Darstellung des Spektrometers ist ATR Zubehör, peristaltische Pumpe und Potentiostaten Setup in Abbildung 1dargestellt.</li>
	<li>Eine Spectroelectrochemical Zelle, wie Sie schematisch in Abbildung 2, die auf der ATR Dichtungen Zubehör zu konstruieren. Die Zelle sollte eine hohe Oberfläche Gegenelektrode (Pt-Draht oder Gaze), einen Anschluss für die Arbeitselektrode (Kohlestab) und ein Miniatur-Referenzelektrode enthalten. Die Zelle sollte mindestens zwei weitere Ports als Einlass und Auslass für schnelle Strömung der Lösungen durch die Zelle enthalten. Hinweis: Eine Miniatur gesättigt Kalomel Bezugselektrode ist ideal für diesen Zweck. 36
</li>
</ol>2. Vorbereitung des Ruß-Partikel mit E. Coli Hydrogenase 1 geändert
<ol><li>In einer "nassen" anaerobe Glovebox mix 20 mg hohe Fläche Ruß Partikel (> 1.000 m3/g) mit 1 mL höchste Reinheit Wasser (Widerstand > 18 MΩ cm) in einem Microcentrifuge Schlauch. Die Partikel durch stromsparende Ultraschallbehandlung zu zerstreuen (< 100 W) für mindestens 15 Minuten, oder bis die Dispersion ist einheitlich und tut nicht Sediment innerhalb 1 h um eine Ruß-Dispersion mit einer Belastung von ca. 20 mg/mL zu geben.</li>
	<li>
Nehmen Sie eine Aliquote von E. Coli Hydrogenase 1 (Hyd1, etwa 50 µL, zubereitet nach einem veröffentlichten Verfahren55) in einer Konzentration von ~ 7 mg Protein/mL und tauschen Sie es in einen Puffer geringer Ionenstärke bei einem pH-Wert nahe dem isoelektrischen Punkt (bei Beispiel Kalium Phosphat, 15 mM, pH 5.8, kein zusätzliches Salz). Um beste Ergebnisse zu erzielen, verwenden Sie ein Enzympräparat, die so aktiv wie möglich ist. Führen Sie die Buffer Tausch durch Konzentration und Verdünnung in eine zentrifugale Filter-Gerät mit einer entsprechenden Molekulargewicht cutoff (50 kDa funktioniert gut für Hyd1).
	<ol>
<li>Fügen Sie die Hyd1 auf das Filter-Gerät.</li>
		<li>Mit rund 450 µL Austausch Puffer verdünnen.</li>
		<li>Aufkonzentrierung auf ein Volumen von 50 µL mit milden Zentrifugation (< ~ 2700 × g) irreversibel Niederschlag zu verhindern.</li>
		<li>Wiederholen Sie die Schritte 2.2.2 und 2.2.3 bis Buffer Tausch (in der Regel innerhalb von ~ 5 Zyklen) abgeschlossen ist.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mischen Sie ein 5 µL Volumen von 20 mg/mL Ruß Dispersion (vorbereitet in 2.1) mit 50 µL Aliquot der Puffer ausgetauscht Hyd1. Bewahren Sie die Enzym-Partikel-Mischung im Kühlschrank auf (bei 0 ° C) über Nacht damit das Enzym zu adsorbieren kann. Es möglicherweise notwendig, schütteln Sie die Mischung gelegentlich, um sicherzustellen, dass die Partikel zerstreut bleiben.</li>
	<li>Waschen Sie die Hyd1 modifiziert Teilchen mit geringer Ionenstärke Puffer (Kalium-Phosphat, 15 mM, pH 5.8, kein zusätzliches Salz) von aufeinanderfolgenden Sedimentation und erneute Dispersion Zyklen in einem Microcentrifuge (~ 2.700 × g). Wiederholen Sie diesen Vorgang 3 - 5 Mal, nicht adsorbiert Enzym zu entfernen. Hinweis: Vor der ersten Wäsche sollte der Überstand nahezu farblos, zeigt gute Adsorption des Enzyms sein.</li>
	<li>Konzentrieren sich die Partikel zu einem Endvolumen von ~ 5 µL, um eine endgültige Beladung von ~ 20 mg/mL der Enzym-modifizierte Teilchen geben. Hinweis: Die Hyd1-modifizierte Partikel können gespeichert werden bei 4 ° C für bis zu zwei Wochen wenn sie hydratisiert bleiben; Dies geschieht am besten durch Speicherung von Teilchen mit ~ 50 µL höchste Reinheit Wasser verdünnt.</li>
</ol>3. Vorbereitung für PFIRE Messungen auf E. Coli Hydrogenase 1
<ol><li>Reinigen Sie das Si IRE Niedrigstrom-Beschallung (< 100 W), zunächst in H2SO4 (< 90 % w/w) für ca. 15 min, und dann in Druckaufschluss3 (70 % w/w) für bis zu 1 Stunde. Dieses Reinigungsverfahren sollte zu einer hydrophilen IRE Oberfläche führen. Wenn weitere Reinigung erforderlich ist kann der Zorn in Piranha Lösung gelegt werden (Verhältnis 1:3 H2O2: H2SO4) eventuell verbleibende organische Material zu oxidieren. Hinweis: Harten saure Reinigungsmethoden geeignet für den Einsatz mit allen IRE Materialien möglicherweise nicht. Piranha-Lösung ist stark ätzend und ein starkes Oxidationsmittel, Oberflächen sollten sauber sein, bevor Verwendung von Piranha-Lösung und Sorgfalt, während der Zubereitung getroffen werden und Verwendung von Piranha Lösung aufgrund der exothermen Prozess - immer hinzufügen H2O 2 langsam zu H2SO4 und beziehen sich auf die entsprechenden Sicherheitsvorkehrungen für Vorbereitung, Nutzung und Entsorgung.</li>
	<li>Die saubere IRE in höchster Reinheit Wasser spülen und Trocknen unter einem Strom von trockenem Stickstoffgas. Alle Prism Umgang mit einer sauberen Pinzette zur Vermeidung von Kontaminationen führen.</li>
	<li>Versiegeln Sie den Zorn in der ATR Zubehör Grundplatte mit einem dünnen Streifen von Elektro-Silikon-Dichtstoff. Achten Sie darauf, um die Dichtmasse an den Rändern des IRE zu beschränken. Lassen Sie der Dichtstoff vollständig trocknen.</li>
	<li>Die ATR-Zubehör-Grundplatte auf das Spektrometer Handschuhfach übertragen und auf der ATR-Zubehör montieren. Maßnahme ein Referenzspektrum (Hintergrund) zwischen 4000-1.000 cm-1 4 cm-1 Auflösung, mit der standard Rapid scan Modus des Spektrometers und 1024 gemittelten Interferogrammen (Messung Zeit ~ 3-5 min). Nutzen Sie dieses Spektrum als Eingabe um Berechnung der Absorption Spektren später im Experiment zu ermöglichen. Hinweis: Aufgrund der kleinen Extinktion für Hyd1 aktiven Seite erwartet ist es notwendig, Spektren mit high-Signal zu Rausch-Verhältnis zu sammeln.</li>
	<li>Übertragen Sie die ATR Zubehör Bodenplatte auf der "nassen" Glovebox enthält die vorbereiteten Hyd1 veränderten Partikeldispersion (Abschnitt 2). Drop-Besetzung eine aliquote 1 µL der Partikeldispersion auf der großen Fläche des IRE, und verteilen sie gleichmäßig über die Oberfläche. Hinweis: Lassen Sie nicht die Partikel auf den Zorn völlig trocken werden.</li>
	<li>Schneiden Sie ein Stück von Kohlepapier, z. B. als Gas-Diffusion-lagen-Material in Brennstoffzellen, um eine Größe ~0.1 mm kleiner als die Oberfläche Abmessungen des IRE (d.h. ca. 8,2 × 4,9 mm2). Die Fläche von der Kohlepapier sollte groß genug, um die Drop-Cast Hyd1 veränderten Partikel zu decken, aber nicht so groß, überschneiden sich die Silikon-Dichtstoff verwendet, um den Zorn zu sichern. Einweichen Sie das Kohlepapier in Wasser, und legen Sie sie vorsichtig über den oberen Teil der Partikel-Film. Das Kohlepapier bieten eine gute elektrische Verbindung über die ganze Partikel-Film. Hinweis: Es empfiehlt sich, mehrere Stücke von Kohlepapier im Voraus vorzubereiten, und sie eingeweicht in Wasser höchster Reinheit in der "nassen" anaerobe Glovebox speichern.</li>
	<li>Montieren Sie die Spectroelectrochemical Zelle (1.7 beschrieben und schematisch in Abbildung 2dargestellten) über den Zorn, in die Bodenplatte mit Schrauben sichern. Fügen Sie ~ 200 µL des experimentellen Puffers, das Enzym hydratisiert zu halten. Eine gemischte Puffersystem zur Pufferung über einen weiten pH-Bereich eignet sich für Studien über NiFe Hydrogenasen:56 Natriumacetat, 2-[N"-Morpholino] Ethan-Sulfo Säure (MES), N'-[2-Hydroxyethyl] Piperazin -N" -[2-Ethan-Sulfo Säure] (HEPES), N'-Tris [macht]-Methyl-3-amino-Propan-Sulfo-Säure (TAPS) und 2-[N'-Cyclohexylamino] Ethan-Sulfo Säure (CHES), mit jeder Komponente auf eine Endkonzentration von 15 mM und mit 0,1 M konzentrierte NaCl als unterstützende Elektrolyt, mit pH-Wert eingestellt mit pH 6 NaOH und HCl. Hinweis: Die funktionierende Elektrode Verbindung ragen sollten leicht unterhalb der Ebene der Spectroelectrochemical Zelle oben (~0.1 mm), gute elektronische Anbindung an das Kohlepapier (Abbildung 2) zu gewährleisten.</li>
	<li>Ein Flow-System mit peristaltischen Pumpe Schlauch und ein Fläschchen des Puffers experimentelle herstellen Sie Lösung zu- und Ablauf der Spectroelectrochemical Zelle. Übertragen Sie die montierte Zelle auf der "trockenen" Glovebox mit dem Spektrometer.</li>
	<li>Montieren Sie die Spectroelectrochemical Zelle Assembly auf die ATR-Zubehör. Schließen Sie die Arbeits-, Zähler und Referenzelektroden an dem Potentiostaten. Den peristaltischen Pumpe Schlauch an die Pumpe anschließen.</li>
	<li>Ein Absorptionsspektrum mit 1024 gemittelt Interferogrammen mit 4 cm-1 Auflösung über einem Spektralbereich von 4.000-1.000 cm-1aufnehmen, mit dem Spektrum als Referenz/Hintergrund in 3.4 gesammelt. An dieser Stelle sollte das Spektrum erhebliche enthalten (> 100 mO.D.) Amid II bands bei ~ 1.540 cm-1 und aktiven Bands der Hyd1 sollte in den Spektralbereich 1.850-2.150 cm-1, weitgehend in oxidiert, inaktive Staaten (Abbildung 3 ersichtlich ).</li>
</ol>(4) Aktivierung von E. Coli Hydrogenase 1 und Tests der Spectroelectrochemical Zelle
<ol><li>Hyd1-modifizierte Partikel Film eine Verringerung Potenzial (−0.8 V Vs SCE) zuweisen. Den experimentelle Puffer mit H2 und Flow Puffer langsam durch die Spectroelectrochemical-Zelle zu sättigen. Lassen Sie die Probe über Nacht voll die Hyd1 aktivieren. Hinweis: Es ist wichtig, anaerobe H2, N2 etc.und so alle anaeroben Gase verwenden sollte durch einen O-2 -Filter übergeben werden.</li>
	<li>Zeichnen Sie ein Absorptionsspektrum der Probe nach der Aktivierung. Die νCO und VCN Bands der aktiven Seite sollte nun eine Verteilung der reduzierten, "aktive" Staaten zeigen. Dies wird am einfachsten durch den Einsatz von ein Unterschied-Spektrum, bezogen auf das Spektrum verzeichneten 3.10 (Abbildung 4) beobachtet.</li>
	<li>Testen Sie die elektrische Verbindung der Spectroelectrochemical Zelle. Um dies zu tun, sättigen Sie die experimentelle Puffer mit N2 Gas. Anwenden einer Abfolge von oxidierenden (0 V Vs SCE) und (−0.8 V Vs SCE) Potenziale ( ca 30 min Dauer) auf der Hyd1-modifizierte Partikel-Film zu reduzieren, und zeichnen ein Absorptionsspektrum jeweils. Die Hyd1 rasch oxidiert und reduziert werden sollte, und wenn der Partikel-Film gut verbunden ist 100 % der Stichprobe sollte reagieren auf das angewandte Potenzial.</li>
	<li>Eine entsprechende Durchfluss des experimentellen Puffers gesetzt. Um dies zu tun, gelten Sie eine Verringerung Potenzial (−0.8 V Vs SCE) zur Probe, und sättigen Sie den experimentellen Puffer mit H2. Eine Reihe von zyklischen Voltammograms zwischen-0.707 Rekord - 0.039 V Vs SCE mit einer Scanrate von 10 mV/s erhöhen die Strömungsgeschwindigkeit des H2-gesättigten Puffer zwischen Voltammograms bis die katalytische Wellenform, die bei einer planaren rotierenden ähnelt CD-Elektrode55 und der maximale Strom ist unabhängig vom Durchfluss (Abbildung 5). Hinweis: Die Löslichkeitsgrenze von H2 in Wasser beträgt ~0.8 mM bei 293 K und 1 Bar.</li>
	<li>Da die Probe jetzt bereit für PFIRE Messungen, sammeln Sie Spektren in einem Bereich von Potentialen, unter einer Reihe von Lösungsbedingungen (pH-Wert, Temperatur, H2 Konzentration etc.). Notieren Sie alle elektrochemische Daten mit Hilfe der Potentiostaten Software, da es wichtig ist, spektroskopische und elektrochemische Daten korrelieren vor allem, wenn elektrokatalytische Prozesse wie H2 Oxidation durch Hyd1 studieren zu können.</li>
</ol>(5) spektroskopische Daten-Handling
<ol><li>Bestätigen Sie, dass die aktive Website nicht dauerhaft im Verlauf der Messungen geändert wurde durch die Aufnahme von Spektren bei 0 V und −0.8 V Vs SCE am Ende des Experiments. Diese sollte identisch mit den Spektren in 4.3 aufgezeichnet werden, und kein Verlust des aktiven Zentrums sollte während der Messung (Abbildung 6) beobachtet werden.</li>
	<li>Absolute Absorption Spektren aus der Spektrometer-Software in ein geeignetes Format exportieren (CSV, ASCII, "Matlab", Jcamp etc.) für die Bearbeitung mit einer Software wie Herkunft oder Matlab.</li>
	<li>
Grundlinie korrigieren Sie die Daten mithilfe des Prozesses in Abbildung 7dargestellt.
	<ol>
<li>Die zweite Ableitung der einzelnen Absorptionsspektrum im Bereich 1.800-2.150 cm-1, zu ergreifen, um kleine identifizieren (< 1 mO.D.) aktiven bands vor dem Hintergrund der stark gebogenen Wasser.</li>
		<li>Grundlinie Markierungspunkte auf der ursprünglichen Absorptionsspektrum und Sollwerte um das experimentelle Spektrum zu fangen.</li>
		<li>Passen Sie eine Grundlinie durch die Punkte mit einer interpolierten kubische Spline-Funktion oder eine Polynomfunktion. Subtrahieren Sie diese Basislinie Funktion aus den experimentellen Daten.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

PFIRE ist ein breit anwendbar IR spektroskopischen Verfahren für den Umgang mit Redox-Elektrode immobilisierten Proteine. Insbesondere können elektrokatalytische Reaktionen der Redox-Enzyme schnell Umsatz Bedingungen sondiert werden. Die PFIRE-Methode baut auf der direkten elektrochemischen Kontrolle durch die Technik der PFE, die keine direkten strukturellen informiert, und IR-Spektroskopie an eine Kohlenstoffelektrode Paare zur Verfügung gestellt. Der PFIRE Ansatz so fügt chemische Einblick zu den verfügbaren Informationen von Elektrochemie allein und ist besonders geeignet um zu studieren in niedermolekularer Bindung und Aktivierung von Redox-Proteinen und Enzymen beteiligt. Darüber hinaus kann PFIRE über Potenzial-abhängige strukturelle Veränderungen in den Proteinen in der Abwesenheit von katalytischen Umsatz informieren. Solche nicht Umsatz Electron Transfer Ereignisse sind oft schwer zu erkennen, mit Standardanwendungen der PFE, obwohl die Ausweitung von PFE auf Fourier-transformierten AC Voltammetrie mit großem Erfolg. verwendet worden ist 45 , 46
Die PFIRE-Methode ist prinzipiell geeignet für die Untersuchung Redox-Protein, das mit PFE untersucht werden können. Daher wie bei PFE, ist Protein Adsorption ein wichtiger Schritt für eine erfolgreiche PFIRE-Experiment. In diesem Protokoll beschreiben wir eine Anwendung der PFIRE-Technik mit E. Coli Hyd1 als eine Fallstudie. 36 , 43 jedoch haben wir auch die PFIRE Technik der zytoplasmatischen regulatorischen Hydrogenase von R. Eutropha,44 und Flavin Mononukleotid adsorbiert an Ruß angewendet. 40 in all diesen Fällen bietet einfache physikalische Adsorption, unverändert hohe Fläche Ruß (wie in diesem Protokoll beschrieben) eine Flächendeckung von Protein, das hoch genug, um gute Aufnahmequalität IR Spektren mit hohem Signal-Rausch-Verhältnis ist. In Fällen, wo solche hohe Werte bei der Adsorption erreicht werden kann, kann es erforderlich sein, die Oberfläche der Kohlenstoffpartikel, zum Beispiel erlauben kovalente Bindung des Proteins an der Elektrodenoberfläche zu ändern sein. 60 , 61 , 62 die Verwendung einer Glovebox für PFIRE Messungen ist nur unbedingt erforderlich, bei der Untersuchung von Proben, die anaerob behandelt werden müssen. Aber in der Praxis sehr konstant und niedrig (< 80 ° C Taupunkt) Ebenen von Wasserdampf zur Verfügung gestellt von der Glovebox Atmosphäre geben Sie hohen Signal-Rausch-Ebenen, die die Gewinnung von sehr kleinen Absorptionswerte ermöglichen. 44 in vielen Fällen ist eine anaerobe Umgebung wie durch das Handschuhfach auch wünschenswert, dass die elektrochemische Messung (integraler Bestandteil der PFIRE-Technik) zur Vermeidung von aktuellen wegen O2 -Reduktion an der Arbeitselektrode.
IR Absorptionswerte durch Masse Wasser, experimentelle Puffer und die Kohlenstoffpartikel, auf denen die Probe adsorbiert, alle tragen wesentlich zu den experimentellen Spektren und Bands überschneiden könnten Interesse, vor allem in der Amid I, II und III Regionen der Spektrum. 63 die Amid-Region enthält auch Informationen von biologischen Arten wie Flavinen oder Nicotinamid Cofaktoren, sowie der Substrate und Produkte viele Reaktionen für Oxidation und Reduktion. Im Falle von NiFe Hydrogenasen νCO und νCN Bands der aktiven Seite fallen in einer relativ klaren Region des Spektrums und so die PFIRE-Technik eignet sich sehr gut auf das Studium dieser Enzyme. In anderen Fällen können Unterschied Spektren gepaart mit Isotopen Kennzeichnung Ansätze mussten jedoch werden Änderungen durch das immobilisierte Protein zu isolieren. Ähnliche Ansätze haben zu identifizieren, z. B. Protonierung Änderungen, strukturelle Umstellungen und Michaelis-Menten-komplexe mit IR-Spektroskopie zu studieren. 64 , 65 , 66 PFIRE, daher beschränkt sich auf das Studium der Hydrogenasen jedoch nicht auf jede Redox-Protein enthält (oder deren Substrate, Produkte oder Inhibitoren enthalten) angewendet werden können Gruppen mit diagnostischen IR-aktive Vibrationen; Kohlenmonoxid-Dehydrogeanses, Nitrogenases67 ,68,14 Flavoproteine,40 und Formiat Dehydrogenases, zum Beispiel.
Die damit verbundene Technik, SEIRA, eignet sich sehr gut für die Untersuchung von membranassoziierten Proteine in einer biomimetischen Umgebung. 32 SEIRA ist eine Adaption der IR-Spektroskopie, die auch eine ATR-IR-Konfiguration verwendet und nutzt eine Oberfläche Enhancement-Effekt, der die IR-Absorption von Molekülen liegt nahe (wenige nm) verstärkt die Oberfläche des Prismas ATR (IRE). SEIRA ist daher vorzüglich empfindlich auf spektrale Veränderungen, die auftreten innerhalb der adsorbierten Protein und Membran-Architektur und ist relativ frei von konkurrierenden Signale von Lösungsmittel und Substrate/Inhibitoren in Lösung. Dies ist etwas anders als die hier beschriebene PFIRE Technik stützt sich auf eine deutlich größere Eindringtiefe über der Oberfläche des IRE (~ 1 µm), was bedeutet, dass PFIRE empfindlicher auf Substrate, Produkte oder Inhibitoren in Lösung präsentieren. Diese erhöhte Empfindlichkeit gegenüber "Massen" Lösungsmittel kann von Vorteil sein; Wenn das Substrat oder das Produkt direkt von IR beobachtet werden kann, Berichten beide Steady-State-Kinetik der langlebigen aktiven Spezies und damit verbundenen Produktbildung während Electrocatalysis PFIRE Spektren. 69 die Möglichkeit zu beobachten, Steady-State-Konzentration von Substrat und Produkt werden besonders wertvoll für Enzyme wie Kohlenmonoxid-Dehydrogenase (die katalysiert die reversible Oxidation von CO, CO2, eine starke IR-Absorber) oder Formiat-Dehydrogenase (die katalysiert die reversible Oxidation von Formiat CO2).
PFIRE beschränkt sich derzeit auf stationären kinetische Untersuchungen des Enzyms Electrocatalysis aufgrund der makroskopischen Kohleelektroden verwendet, um "das Enzym auf die Oberfläche ein IRE für Datenerhebung und ATR-IR Geometrie konzentrieren". In dieser Hinsicht sind PFIRE Studien der NiFe-Hydrogenasen ergänzen die Arbeit der Dyer und Mitarbeiter,49,50 , die mit Licht ausgelöste vorübergehende Aufnahme IR-Spektroskopie um Sub Umsatz Kinetik zu studieren. Die Spectroelectrochemical Zelle,40 Miniaturisierung wird gearbeitet und mit dem Einsatz von Mikroelektroden zeitliche Auflösung in der Größenordnung von Mikrosekunden erreichbar sein sollte. Dies ermöglicht Studium der Sub-Umsatz Kinetik für Enzyme mit Umsatz-Frequenzen bis zu ca 100-500 s-1und das Studium der reduktiven und oxidative Prozesse ermöglichen.
Insgesamt ist PFIRE eine spektroskopische Technik, die chemische Charakterisierung elektrokatalytische Reaktionen der Redox-Enzyme unter Steady-State-Bedingungen ermöglicht. Der PFIRE Ansatz ermöglicht mehrere chemische und elektrochemische Titrationen derselben Enzym-Probe durchgeführt werden, da die große Oberfläche Elektroden verwendet, eine robuste Adsorption von Protein bieten und die ATR-IR-Geometrie einfache Lösung Austausch ermöglicht. Die Fähigkeit, solche Strukturinformationen in Situ während Enzymfunktion sammeln ist ein unschätzbares Werkzeug für die Bioelectrochemistry Gemeinschaft.

Eine zentrale Herausforderung in der Studie der Proteinfunktion umfasst die Entwicklung von in Situ -Methoden, die es ermöglichen, dass die direkte Beobachtung von Proteinen, die Durchführung ihrer physiologischen Rollen, entweder in Vivo oder Proteinproben isoliert. Dies erfordert die Integration von Steuerung oder in experimentellen Verfahren und Einsatz von kombinierten Techniken, mit denen sowohl die Reaktivität zu prüfenden Prozesse auslösen und chemischen Einzelschritten während Proteinfunktion gleichzeitig gemessen werden. Bei Redox-Proteinen entspricht dies oft Kombination elektrochemische Techniken, die präzise Kontrolle der angewandten Potenzial aber bieten keine direkte chemische Informationen mit spektroskopischen Techniken, die empfindlich auf chemisch-spezifische Veränderungen im Zusammenhang mit Proteinfunktion. 1 , 2 , 3 Spectroelectrochemistry ist ein allgemeiner Begriff für eine Reihe von gekoppelten elektrochemische und spektroskopische Methoden, die eine Vielzahl von spektroskopischen Techniken und elektrochemische Steuerungsebenen umfassen. Viele Proteine können Elektronen mit künstlichen, lösliches Elektron Spender und Akzeptoren austauschen und dies wurde in Studien die kleine Moleküle zu verwenden, um Elektronentransfer, einschließlich Kupplung mit UV-VIS,4,5 vermitteln ausgeschöpft , 6 , 7 magnetische kreisförmigen Dichroismus8 und Infrarot-5,9,10,11,12,13,14 (IR) Spectroscopies. In einer begrenzten Anzahl von Fällen erwies es sich möglich, unmittelbare, Diffusion-kontrollierte Elektron Austausch zwischen Proteinen und Elektroden zu nutzen. 15 , 16
Für katalytische Reaktionen durchgeführt durch Redox Enzyme, Elektrochemie Lösungsansätze vorhanden einen klaren Nachteil. Diffusion-gesteuerte Elektron Übertragung über Redox Mediatoren in Lösung ist wahrscheinlich zu Bandbreitenbegrenzung. Kinetische und mechanistische Informationen über das Enzym kann verloren gehen, oder zumindest schwer zu deconvolute von Diffusion Artefakte aus der experimentellen Methode geworden. Direkte, unmittelbare elektrochemische Kontrolle ist daher ein wichtiges Instrument für die Untersuchung von Redox-Proteinen und Enzymen. Die Technik des Proteins Film Elektrochemie (PFE) beschäftigt Redox-Elektrode immobilisierten Proteine, in einer Weise, dass Elektronen direkt an oder aus der Redox-Cofaktoren in das Protein übertragen werden, da die Elektrode an einer Reihe von Potentialen polarisiert ist. 17 , 18 , 19 PFE ist von besonderem Wert für die Erforschung der Oxidation oder Reduktion Reaktionen katalysiert durch Redox-Enzyme, wie Grenzflächen Elektronentransfer mit einer sehr hohen Geschwindigkeit erreicht werden kann. Beispielsweise wurde die elektrokatalytische Fluktuationsrate von Nickel-Eisen ([NiFe]) Hydrogenase aus Allochromatium Vinosum ca 1.000-10.000 s−1 für H2 Oxidation von PFE gemessen. 20 mögliche Elektrode wirkt als Auslöser, Katalyse "on" oder "aus" und die elektrokatalytische aktuelle Berichte über die Enzymaktivität zu machen. PFE ist daher eine wertvolle Methode zur Analyse der Reaktivität von komplexen Enzymen, die innig, Potenzial, wie Reaktionen der di-Eisen aktiven Seite des [FeFe abhängen]-Hydrogenasen mit CO und O2,21 oder Potenzial-induzierte Inaktivierung Reaktionen der Hydrogenasen, Kohlenmonoxid-Dehydrogenase22 ,23 und andere komplexe Redox-Enzyme. 24
Das wichtigste Hindernis für Kombination von spektroskopischen Techniken mit der elektrochemischen Direktsteuerung gewährten PFE ergibt sich aus der niedrigen Flächendeckung der Redox-Enzyme in der Größenordnung von 1-2 Pmol cm-2 für die [NiFe] Hydrogenase von A. Vinosum, 20 im Vergleich zu in Situ Oberflächenforschung Studien von niedermolekularer Adsorbate auf Masse Metall-Elektroden. Dies stellt eine Herausforderung für die Empfindlichkeit der spektroskopischen Messung. Verschiedene Spectroelectrochemical Methoden gemeldet wurden für die Untersuchung immobilisiert Redox-Proteine auf eine Reihe von verschiedenen Elektroden: UV-VIS Spektroskopie an transparenten Metalloxid Elektroden; 25 , 26 , 27 -Fluoreszenz-Spektroskopie bei gold-Elektroden; 28 , 29 -Oberfläche verbessert Infrarotabsorption (SEIRA) Spektroskopie an gold-Elektroden; 30 , 31 , 32 , 33 und Oberfläche enhanced Raman spektroskopische Techniken, vor allem an Silber-Elektroden. 34 , 35
Hier beschreiben wir eine Methode zur Kupplung PFE mit IR-Spektroskopie, in einer Technik bekannt als Protein Film Infrarot-Elektrochemie (PFIRE). 36 die PFIRE Methode studiert Redox-Enzyme, die auf eine große Oberfläche Kohlenstoff Arbeitselektrode in Verbindung mit einer abgeschwächten totale Reflexion IR (ATR-IR) Geometrie, nutzen die Leichtigkeit der Adsorption von eine Reihe von Proteinen auf Carbon-Oberflächen immobilisiert. IR-Spektroskopie ist nützlich in Studien von Redox-Enzymen und Proteinen wie viele kleine Moleküle, Liganden und Cofaktoren diagnostische Absorptionswerte, die zur Reaktivität, Bindung, Hemmung und Redox-Zustand Beurteilung herangezogen werden können. Beispiele hierfür sind die Bindung von NO zu Eisen-Schwefel-Zentren,37 Studie der Flavoproteine,38,39,40 kleines Molekül binden an Häm-Zentren etc.. 41 die ATR-IR-Geometrie ermöglicht eine optimierte 3-Elektrode (Spectro) elektrochemische Zelle42 und bietet somit hervorragenden elektrochemischen Kontrolle. Lösung Widerstand und mögliche Drift werden minimiert, indem man eine Referenzelektrode nah an der Arbeitselektrode. Große Oberfläche Zähler Elektroden dienen, die kompatibel mit hohe elektrokatalytische Strömungen durch schnelle Enzym Umsatz an der Arbeitselektrode produziert sind. Lösung durch die Spectroelectrochemical-Zelle ermöglicht einfache Kontrolle über die Konzentration der Substrate, Inhibitoren und pH. 36 , 43 , 44 die PFIRE Methode ermöglicht somit IR Spektren, aufgezeichnete in Situ während nachhaltige Enzym Electrocatalysis zu sein. 36 , 44 PFIRE ist auch in der Lage, chemische Informationen in Ermangelung von katalytischen aktuell43 im Gegensatz zu PFE wo es Informationsextraktion aus nicht-katalytischen Prozessen in Redox Enzyme schwierig sein kann. 45 , 46
Wir haben die PFIRE-Methode für die Studie der elektrokatalytische H2 Oxidation von [NiFe]-Hydrogenasen, bewiesen die intrinsische CO und CN Liganden koordiniert nach Fe an einem Bimetall aktiv-Standort enthalten. 36 , 43 , 44 [NiFe]-Hydrogenasen eignen sich deshalb besonders gut, um PFIRE zu studieren. Die PFIRE-Methode liefert Informationen über die Arten, die bei stationären Umsatzes anwesend sind, und somit entscheidende mechanistischen Erkenntnis neben der Fülle von Literatur auf IR-Spektroskopie der Hydrogenasen ohne experimentelle Kontrolle Umsatz. 47 , 48 Dyer und Mitarbeiter haben Beschäftigte zeitaufgelösten IR Methoden der NiFe Hydrogenasen,49,50,51 mit einen leichten Trigger entweder einen kleinen negativen möglichen Schritt (über Gebrauch anwenden zu studieren der Lösung Mediatoren und ein "Käfig" Elektronenquelle) oder Photolyse gebundene Hydrid. Obwohl die PFIRE-Methode derzeit Zeitauflösung entsprechen diese Messungen40 zur Verfügung stellen kann, es ermöglichen Studium der reduktiven und oxidative katalytischen Prozessen, Zugriff auf eine Reihe von klar definierten Potentiale und frei von Stofftransport Einschränkungen.
Die PFIRE-Methode unterscheidet sich von SEIRA Studien von Redox-Proteine, die auch eine ATR-IR-Geometrie und beschäftigen eine nanoskalige aufgeraut Metallelektroden, die IR-Absorption der Moleküle adsorbiert an der Elektrodenoberfläche zu verbessern. 30 SEIRA ist eine äußerst wertvolle Technik zur Untersuchung der Membranproteine, insbesondere auf adsorbiert oder in mimetischen Membran Architekturen,32 aber das Bedürfnis nach einem Metall-Elektrode kann begrenzen Substrat und Inhibitor durch Reaktivität der Elektrode Unterstützung gegenüber kleinen Molekülen wie CO, CN–, CO2 etc. Proton-Reduktion und selbst-zusammengebauten monomolekularen Film Desorption auf Metalloberflächen bei sehr negativen Potentiale problematisch sein können, wurde1,52 obwohl Enzym Electrocatalysis auf ungeschützten-Elektroden Metall berichtet. 53 , 54 ein Nachteil des PFIRE relativ SEIRA ist die relative Schwierigkeit der Einbeziehung von Membranproteinen in native oder mimetischen Membran-Architekturen. Allerdings macht die relative chemische Inertheit der Kohleelektroden zu konkurrierenden niedermolekularer Aktivierung Reaktionen PFIRE eine hervorragende Technik für das Enzym Electrocatalysis, besonders im Bereich Low-Potential für biologische Redox Studium Prozesse wie Proton Reduktion von Hydrogenasen. 1 , 43
Das Ziel dieses Artikels ist, die PFIRE-Methode als eine Technik zur Untersuchung Redox-Elektrode immobilisierten Proteine, mit NiFe Hydrogenase 1 (Hyd1) von Escherichia coli als Vorbild einzuführen. Überlegungen der Probenvorbereitung, die Voraussetzung für gutes Substrat Fluss und Datenverarbeitung werden diskutiert. PFIRE ist eine allgemein anwendbare Technik, gut geeignet für Studium Redox-Protein (mit charakteristischen IR Absorptionswerte), das auf Kohleelektroden, entweder direkt adsorbiert werden kann oder mit Oberflächenmodifizierung, so dass es Elektronen mit austauschen kann die Elektrode.

<table><tbody><tr><td>Spektrometer</td><td>Agilent</td><td>680-IR</td><td>mit externem MCT-Detektor</td></tr><tr><td>ATR-Zubehör</td><td>Pike Technologies</td><td>GladiATR</td><td>Speziell für die Verwendung mit einer 5-Reflexions-Si-IRE-Handschuhbox</td></tr><tr><td></td><td>Glove Box Technology Ltd.</td><td>N/A</td><td>Speziell entwickelte "Nass"- und "Trocken"-Box für die anaerobe Probenhandhabung und -messung</td></tr><tr><td>KBr-Fenster</td><td>Crystran</td><td>Custom</td><td>Um die Kopplung der Glovebox mit dem externen Strahl des FTIR-Spektrometers zu ermöglichen</td></tr><tr><td>Zusätzliche Optiken</td><td>Agilent</td><td>N/A</td><td>Komponenten aus einem PM-IRRAS-Zubehör</td></tr><tr><td>Silicon IRE</td><td>Crystal GmbH</td><td>Custom</td><td>Trapezförmig: 8,4 mm x 5 mm (große Fläche), 1 mm Dicke, ca 39 Grad Gesichtswinkel</td></tr><tr><td>Potentiostat</td><td>Metrohm</td><td>Autolab PGSTAT 128N</td><td></td></tr><tr><td>Nova 10.1</td><td>Metrohm</td><td></td><td>Software zur Steuerung des Potentiostaten</td></tr><tr><td>Schlauchpumpe</td><td>Williamson Manufacturing Company Ltd</td><td>QL-1000-024-300</td><td></td></tr><tr><td>Pt Draht</td><td>Surepure Chemetals</td><td>3272</td><td>99,95% reiner Platindraht, 0,014 Zoll Durchmesser</td></tr><tr><td>Kohlestab</td><td>WH Smith 30729209</td><td></td><td>0,7 mm HB Bleistiftmine</td></tr><tr><td>Ruß</td><td>Cabot Corporation</td><td>Black Pearls 2000</td><td></td></tr><tr><td>Ultraschallbad</td><td>Ultrawave</td><td>U100</td><td>35 W</td></tr><tr><td>Zentrifugalfilter</td><td>Merck Millipore</td><td>UFC5050BK</td><td>Amicon Ultra, 50 KDa MW Cutoff</td></tr><tr><td>Mikrozentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5452000018</td><td>MiniSpin (Englisch</td></tr>)<tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>71376</td><td></td></tr><tr><td>H2SO4</td><td>Fisher</td><td>S / 9240 / PB17</td><td></td></tr><tr><td>HNO3</td><td>Fisher</td><td>N / 2300 / PB17</td><td></td></tr><tr><td>Silikondichtstoff</td><td>Cow Corning Toray Co., Ltd.</td><td>SE 4486</td><td></td></tr><tr><td>Kohlepapier</td><td>Toray</td><td>TGP-H-030</td><td></td></tr><tr><td>H2 Gas</td><td>BOC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>N2 Gas</td><td>BOC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OriginPro 2015</td><td>OriginLab</td><td></td><td>Software für Datenanalyse/Grafik</td></tr><tr><td>Resolutions Pro 4.0</td><td>Varian</td><td></td><td>Software zur Steuerung des FTIR-Spektrometers</td></tr></tbody></table>

protein film infrarot-elektrochemie für studie der h2 oxidation durch ein [nife] hydrogenase unter beweis gestellt

Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase

Verständnis der Chemie der Redox Proteine Anforderungen Methoden, die präzise Kontrolle über Redox-Zentren innerhalb des Proteins. Die Technik des Proteins Film Elektrochemie, in denen ein Protein auf eine Elektrodenoberfläche immobilisiert ist, so dass die Elektrode physiologischen Elektron Spender oder Akzeptoren, ersetzt hat funktionelle Einblick in die Redox-Reaktionen einer Reihe von unterschiedlichen zur Verfügung gestellt. Proteine. Vollständige chemische Verständnis erfordert eine elektrochemische Steuerung mit anderen Techniken kombiniert werden, die zusätzliche strukturelle und mechanistische Einblicke hinzufügen können. Hier zeigen wir eine Technik, die Protein Film Infrarot-Elektrochemie, das Protein Film Elektrochemie mit Infrarot-Spektroskopie Probenahme von Redox-Proteinen verbindet. Die Technik nutzt eine abgeschwächte totale Reflexion Multiple-Reflexion-Geometrie, ein Redox-Protein immobilisiert auf eine große Oberfläche Ruß Elektrode Sonde. Einbeziehung dieser Elektrode in einer Durchflusszelle ermöglicht Lösung pH oder gelöste Konzentrationen während der Messung verändert werden. Dies ist besonders leistungsfähig bei der Bewältigung Redox Enzyme, wo schnelle katalytischen Umsatz nachhaltig und an der Elektrode so dass spektroskopischen Beobachtung von langlebigen zwischen-Arten in der katalytischen Mechanismus gesteuert werden kann. Wir zeigen die Technik mit Experimenten auf E. Coli Hydrogenase 1 Umsatz (H2 Oxidation) und nicht-Umsatz-Bedingungen.

Hier beschreiben wir eine Technik, die Protein Film Infrarot-Elektrochemie, wodurch immobilisiert Redox Proteine unter direkter elektrochemischer Kontrolle eine Kohlenstoffelektrode spektroskopisch untersucht werden. Infrarot-Spektren einer einzigen Proteins Probe können eine Reihe von angewandten Potenziale und unter einer Vielzahl von Lösungsbedingungen aufgezeichnet werden.

Protein Film Infrarot-Elektrochemie für Studie der H2 Oxidation durch ein [NiFe] Hydrogenase unter Beweis gestellt

Understanding the chemistry of redox proteins demands methods that provide precise control over redox centers within the protein. The technique of protein ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, die aktive Seitenchemie eines Nickel-Eisen-Wasserstoffase-Redoxenzyms unter nicht umsatzbedingten sowie unter stationären elektrokatalytischen Umsatzbedingungen mittels Protein-Flüssigkeits-Infrarot-Elektrochemie (Protein Film Infrared Electrochemistry, PFIRE) zu untersuchen. Der Hauptvorteil der PFIRE-Technik liegt darin, dass sie eine gleichzeitige präzise elektrochemische Steuerung und infrarotspektroskopische Untersuchung von auf einer Kohlenstoffelektrode immobilisierten Redoxproteinen ermöglicht. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in den Bereichen Biophysik und Bioelektrochemie zu beantworten, beispielsweise welche Zustände von Redoxproteinen während des stationären katalytischen Umsatzes vorliegen.Um den Vorgang zu beginnen, suspendieren Sie 20 Milligramm Kohlenstoffrußpartikel mit großer Oberfläche in einem Milliliter ultrareinem Wasser in einer feuchten anaeroben Handschuhbox. Beschallen Sie die Suspension mindestens 15 Minuten lang mit niedriger Leistung oder bis die Partikel gleichmäßig dispergiert sind und sich innerhalb einer Stunde in Ruhe kein Sediment bildet. Geben Sie anschließend 15 Mikroliter einer etwa sieben Milligramm pro Milliliter betragenden Lösung des E.Coli-Hydrogenase-1 in eine Zentrifugalfiltereinheit mit 50 Kilodalton.Verdünnen Sie die Lösung mit 450 Mikrolitern eines Puffers mit niedriger Ionenstärke und einem pH-Wert nahe dem isoelektrischen Punkt der Hydrogenase. Konzentrieren Sie das Gemisch durch Zentrifugation bei 27.000 × g auf 50 Mikroliter. Führen Sie die erneute Konzentrierung des Gemischs noch viermal durch, um den Pufferaustausch abzuschließen.Anschließend fünf Mikroliter der 20 Milligramm pro Milliliter Carbon Black-Dispersion mit der puffergewechselten Hydrogenase mischen. Die Mischung über Nacht bei null Grad Celsius lagern, um die Adsorption der Hydrogenase an die Carbon Black-Partikel zu ermöglichen. Die Mischung regelmäßig überprüfen, um die Partikeldispersion aufrechtzuerhalten.Zentrifugieren Sie die modifizierten Partikel bei 27.000 × g und überprüfen Sie, ob der Überstand nahezu farblos ist, was auf eine gute Absorption der Hydrogenase an die Partikel hinweist. Eine hohe Absorption ist entscheidend für den Erfolg des Experiments. Wir optimieren den Absorptionspuffer, wobei wir einen Puffer mit niedriger Ionenstärke und einem pH-Wert nahe dem isoelektrischen Punkt des Proteins als Ausgangspunkt verwenden.Waschen Sie die Partikel mit drei bis fünf Zyklen aus Zentrifugation und erneuter Suspension in frischem Austauschpuffer. Konzentrieren Sie die Partikelmischung auf etwa fünf Mikroliter, um eine Partikelladung von 20 Milligramm pro Milliliter zu erreichen. Um mit der Vorbereitung der PFIRE-Messungen zu beginnen, reinigen Sie ein silikonbasiertes internes Reflexionselement durch Ultraschallbehandlung mit niedriger Leistung in Schwefelsäure für 15 Minuten. Anschließend eine Stunde lang mit Salpetersäure behandeln. Danach das Element mit ultrareinem Wasser spülen und unter einem Strom trockenen Stickstoffgases trocknen. Zum Befestigen des IRE in der Basisplatte eines ATR-Zubehörs mit fünf Reflexionen elektrisch isolierendes Silikon-Dichtungsmittel verwenden, wobei darauf zu achten ist, dass das Dichtungsmittel nur an den Rändern des IRE aufgetragen wird.Lassen Sie das Dichtmittel vollständig trocknen. Bringen Sie dann die Basisplatte in eine trockene anaerobe Handschuhbox mit einem IR-transparenten Fenster neben einem FTIR-Spektrophotometer. Befestigen Sie die Basisplatte am ATR-Zubehör.Erfassen Sie ein Hintergrundspektrum im Schnellscan-Modus. Danach trennen Sie die ATR-Zubehör-Basiseinheit ab und übertragen sie in die feuchte anaerobe Handschuhbox. Geben Sie einen Mikroliter der enzymmodifizierten Rußpartikel gleichmäßig auf die IRE-Oberfläche, ohne dass die Partikel vollständig trocknen.Es ist wichtig, dass die enzymatisch modifizierte Partikelmischung auf eine Konzentration von möglichst nahezu 20 Milligramm pro Milliliter angereichert wurde. Andernfalls kann es schwierig sein, beim Aufbringen der Partikel in diesem Schritt einen gut verbundenen Partikelfilm zu erzielen. Legen Sie vorsichtig ein Stück Kohlepapier, das in ultrareinem Wasser getränkt wurde, auf die IRE-Oberfläche, wobei sichergestellt werden muss, dass der Partikelfilm bedeckt ist, ohne dass das Papier den Silikondichtstoff berührt.Platzieren Sie eine spezielle spektroelektrochemische Zelle über der IRE. Geben Sie 200 Mikroliter Experimentpuffer über den Lösungszulauf hinzu, um das Enzym während der Systemvorbereitung hydratisiert zu halten. Verbinden Sie den Lösungszulauf und -ablauf über Schlauchleitungen einer Peristaltikpumpe mit einem Gefäß, das Experimentpuffer enthält.Überführen Sie die zusammengesetzte Zelle anschließend in die trockene Handschuhbox. Befestigen Sie die Zellenanordnung am ATR-Zusatzgerät und schließen Sie die Schläuche an die peristaltische Pumpe an. Nehmen Sie ein Absorptionsspektrum auf, wobei Sie das zuvor aufgenommene Spektrum als Hintergrund verwenden.Überprüfen Sie, dass die MI2-Banden bei 1.540 reziproken Zentimetern deutlich sichtbar sind und dass die Peaks der Hydrogenase-Aktivstelle im Bereich von 1.850 bis 2.150 nachweisbar sind. Bereiten Sie das Experiment vor, indem Sie eine reduzierende Potential von minus 0,8 Volt gegenüber einer gesättigten Kalomel-Referenzelektrode auf den Partikelfilm aufbringen. Sättigen Sie den Experimentpuffer mit anaerobem Wasserstoffgas.Beginnen Sie anschließend damit, den Puffer mit etwa 12 Milliliter pro Minute durch die spektroelektrochemische Zelle zu leiten. Lassen Sie die Probe über Nacht unter Durchfluss des mit Wasserstoff gesättigten Experimentierpuffers, um die Hydrogenase zu aktivieren. Nehmen Sie ein Absorptionsspektrum der aktivierten Probe auf und überprüfen Sie, ob die CO- und CN-Banden der aktiven Stelle mehrere reduzierte Zustände zeigen.Danach den Versuchspuffer mit anaerobem Stickstoffgas sättigen und den Puffer durch die Zelle leiten. Eine oxidierende Potentialdifferenz von null Volt gegenüber einer gesättigten Kalomel-Elektrode 30 Minuten lang anlegen und ein Absorptionsspektrum aufnehmen. Anschließend eine reduzierende Potentialdifferenz 30 Minuten lang anlegen und ein weiteres Spektrum aufnehmen.Überprüfen Sie, ob das Enzym vollständig oxidiert und anschließend reduziert wurde. Falls nicht, überprüfen Sie die elektrischen Anschlüsse der Zelle. Erstellen Sie unter Verwendung eines anaeroben, wasserstoffgesättigten Puffers eine Reihe von zyklischen Voltammogrammen bei steigenden Durchflussraten, um die optimale Durchflussrate für das Experiment zu bestimmen.Unter Verwendung dieser Durchflussrate Spektren über einen Bereich von Potentialen und Lösungsbedingungen aufnehmen. PFIRE-Messungen der E.coli-Wasserstoffase eins wurden bei verschiedenen Potentialen unter Inertgasatmosphäre und in Gegenwart von Wasserstoffgas erhalten. Die unter Wasserstoffatmosphäre aufgenommenen Spektren repräsentierten die stationären Verteilungen der aktiven Zentrenzustände, die während der katalytischen Wasserstoffoxidation vorliegen.Die anaerobe oxidative Aktivierung der Hydrogenase über die Bildung des Nickel-B-Zustands aus dem Nickel-Si wurde anschließend untersucht, indem Spektren zu verschiedenen Zeitpunkten während der Potentialapplikation aufgezeichnet und verschiedene Spektren relativ zum ersten Spektrum erstellt wurden. Die beobachtete schrittweise Umwandlung von Nickel-Si in Nickel-B stand im Einklang mit dem monotonen Abfall der Stromstärke. Außerdem wurden Spektren über einen Bereich verschiedener pH-Werte der Lösung aufgezeichnet, um die Protonentransferschritte des katalytischen Zyklus der Hydrogenase zu untersuchen.Bei niedrigem pH-Wert war der Nickel-C-Zustand vorherrschend, während der Nickel-L-Zustand bei hohem pH-Wert vorherrschend war. Die pH-Abhängigkeit der relativen Konzentrationen von Nickel-C und Nickel-L wurde anhand der maximalen Extinktionswerte an den jeweiligen Peaks bei jedem im Experiment untersuchten pH-Wert bestimmt. Diese Technik eröffnet Forschern auf dem Gebiet der Bioelektrochemie die Möglichkeit, die stationären Kinetiken der Wasserstoffaktivierung durch Hydrogenasen zu untersuchen.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis eines typischen PFIRE-Experiments haben. Die Technik eignet sich für jedes Redoxprotein, das mittels Proteinfilmelektrochemie untersucht werden kann, und ergänzt die elektrochemische Messung durch direkte chemische Erkenntnisse.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

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