Optische Kohärenztomographie: Maus retinalen Ganglienzellen Zellen In Vivo Imaging

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, mithilfe der optischen Kohärenztomographie (OCT) eine schnelle und genaue Beurteilung der Netzhautdicke zu erhalten. Die OCT kann dabei helfen, zentrale Fragen im Bereich der Augenheilkunde zu beantworten, beispielsweise bezüglich der Optikusneuropathie. Der Hauptvorteil dieser Methode liegt darin, dass sie eine nichtinvasive Technik zur Erfassung struktureller Veränderungen in den Ganglienzellen der Mausnetzhaut darstellt.

Diese Technik ist äußerst interessant, da sie eine nichtinvasive, sichere und anerkannte Methode zur Untersuchung der Wirkung einer Behandlung bei optischer Neuropathie darstellt. Zunächst stellen Sie die Einstellungen des Referenzarms entsprechend der Linse ein. Schalten Sie danach die Stromversorgung und den Computer ein.

Wenn der Computer bereit ist, starten Sie das Bildgebungsprogramm. Erstellen Sie eine neue klinische Studie und fügen Sie die gewünschten Protokolle hinzu. Gehen Sie zum Patientenuntersuchungsabschnitt und legen Sie die Standardwerte für die Untersuchung fest.

Klicken Sie auf „Patient hinzufügen“ im Abschnitt Patientenuntersuchung, um einen neuen Patienten hinzuzufügen, und geben Sie die relevanten Patientendaten ein. Klicken Sie anschließend auf „Untersuchung hinzufügen“, „Untersuchung starten“ und fügen Sie voreingestellte Scans aus der Liste hinzu, um das gewünschte Protokoll auszuwählen, beginnend mit dem Auge, das zuerst gemessen wird. Mindestens 15 Minuten vor der Datenaufnahme werden Tropfen mit 10 % Phenylephrin in Raumtemperatur in jedes Auge aller zu testenden Mäuse appliziert.

Entfernen Sie anschließend das überschüssige Reagenz und geben Sie Tropfen mit 0,5 % Tropicamid bei Raumtemperatur hinzu. Ungefähr fünf Minuten vor der Aufnahme wird eine Vollnarkose induziert. Unmittelbar danach wird jedem Auge 0,4 % Oxybuprocainhydrochlorid verabreicht, wobei die Lösung drei Sekunden lang belassen wird, um die Augen zu betäuben und zu immobilisieren.

Entfernen Sie dann die Tropfen und wiederholen Sie die Applikation von 10 % Phenylephrin und 0,5 % Tropikamid. Sobald die Augen ausreichend für die Bildgebung erweitert sind, befeuchten Sie die Augen mit viskosen, glykolk basischen Augentropfen, um die Hornhaut zu hydratisieren, und wickeln Sie die Maus in eine chirurgische Gazebinde, um sie warm zu halten. Tragen Sie mithilfe eines Schwamms oder eines Baumwolldochts ein dünnes Schicht ophtalmologisches Gel, das mit 0,3 % Hypromellose angereichert ist, auf jedes Auge auf.

Legen Sie dabei die Wimpern und Schnurrhaare beiseite. Positionieren Sie die Maus in der Kassette mit geradem, nach vorne zeigendem Kopf und setzen Sie vorsichtig die Beißeinlage in den Mund. Legen Sie eine Wattepolster unter die Seite des Tieres für das Auge, das untersucht wird.

Dann, unter Beibehaltung der Klemme am Zielbügel auf der mausspezifischen Linse, drehen Sie die Z-Translator-Schraube gegen den Uhrzeigersinn, um die Linse näher an das Auge heranzuführen. Stellen Sie die Position der Maus vorab ein, indem Sie das Kassettenhalterung drehen und schwenken sowie den Beißensteg und die X-Translator-Schrauben drehen, bis das Versuchsauge direkt in die Linse blickt. Wenn die optische Achse des Auges und der Linse ausgerichtet sind, wählen Sie den ersten Scan in der Untersuchung aus.

Klicken Sie auf „Start Aiming“ und verwenden Sie die Z-Translator-Schraube, um die Netzhaut im linken Panel vertikal und im rechten Panel horizontal zu bewegen. Durch Drehen der Kassette bewegen Sie den Sehnervenkopf nach oben oder unten, um ihn in die Mitte des rechten Panels zu bringen. Verwenden Sie die Bissstangen-Schraube, um die Netzhaut im rechten Panel zu richten, und schwenken Sie die Kassette, um den Sehnervenkopf in die Mitte des linken Panels zu positionieren.

Verwenden Sie dann die X-Translator-Schraube, um die Netzhaut im linken Feld zu nivellieren, und passen Sie unter Berücksichtigung der Hauptfunktion jedes Modulators die Position der Netzhaut weiter an, um eine optimale Zentrierung auf dem Sehnervenkopf zu erreichen. Sobald die Netzhaut korrekt positioniert ist, klicken Sie auf „Start-Snapshot“, um die optische Kohärenztomographie im Spektralbereich zu starten. Vergessen Sie nicht, den Scan und den Bericht zu speichern.

Passt die Zentrierung gegebenenfalls an. Wenn der Scanvorgang abgeschlossen ist, fahren Sie das Objektiv zurück und positionieren Sie das zweite Auge wie zuvor gezeigt. Nachdem das zweite Auge gescannt wurde, nehmen Sie die Maus aus der Halterung, tragen Sie ein Augengel mit 0,3 % Hypromellose auf jedes Auge auf und legen Sie die Maus auf eine Heizplatte mit Überwachung, bis sie sich vollständig erholt hat.

Um sich auf retinale Ganglienzellen zu konzentrieren, verwenden Sie das für ImageJ erstellte MRI-Hintergrund-Tool-Makro. Öffnen Sie das MRI-Hintergrund-Tool, modifizieren Sie das Polygon-Auswahlwerkzeug und laden Sie das gewünschte Bild. Klicken Sie auf M, um die Messung zu beginnen, dann auf E, um die horizontale Position anzupassen. Wählen Sie das erste Kästchen im neu geöffneten Fenster des Bereichs-Manager aus.

Klicken Sie auf das blaue Polygon und anschließend auf die Ränder der gemessenen Schicht im Bild, um die Position der ersten Kassette anzupassen. Wählen Sie die zweite Kassette im Fenster des Bereichs-Interessen-Managers aus und passen Sie die zweite Kassette an. Klicken Sie dann auf R, um die Netzhaut erneut zu vermessen und die Ergebnisse im Messfenster anzuzeigen.

Auch wenn die Qualität einer spektralen OCT-Aufnahme nicht so gut ist wie die eines Bildes eines retinalen Querschnitts, ermöglicht die OCT die Visualisierung zusätzlicher Schichten. Die Retinaschichten sind in einer OCT-Aufnahme leicht messbar und umfassen die Nervenfaserschicht, die Ganglienzellschicht, die innere Körnerschicht, die äußere Plexiformschicht, die äußere Körnerschicht, die innere und äußere Segmentsschicht, das retinale Pigmentepithel und die Aderhaut, wodurch eine komplexe Untersuchung der gesamten Retina ermöglicht wird. Die OCT-Messung der Retinadicken hat gerade gezeigt, dass genetisch mutierte OPA1-weibliche Mäuse mit Sehbehinderung eine fortschreitende Verdickung des Ganglienzellkomplexes und der peripapillären Nervenfaserschicht der Retina aufweisen.

Ein Vergleich der Nervenfaserschichtdicke in der Ganglienzellschicht der Retina unter Verwendung von Standard- und selbstgebauten Messschiebern zeigt, dass Standardmessschieber eine signifikant geringere Dicke messen als selbstgebaute Messschieber, da die Standardmessschieber deutlich dicker sind und es schwieriger ist, sie an einer dünnen Schichtgrenze anzusetzen. Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie bei korrekter Durchführung in 15 Minuten durchgeführt werden. Nach ihrer Entwicklung ebnete die optische Kohärenztomographie (OCT) den Forschern auf dem Gebiet der Augenheilkunde den Weg, um strukturelle Veränderungen in der Mausretina zu analysieren.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die OCT-Bildgebung für retinale Ganglienzellen bei Mäusen durchführt und analysiert.