Neue Methoden zum Studieren der Gustatory Coding

Das übergeordnete Ziel dieser Methoden ist es, die gustatorische Kodierung in einem einfachen Tier zu untersuchen, indem die Aktivität mehrerer Rezeptorneuronen in vivo aufgezeichnet wird, während präzise getimte Impulse von Tastentern abgegeben und überwacht werden. Diese Methoden können helfen, wichtige Fragen zur Geschmackstherapie zu beantworten, z. B. wie Verkoster von Populationen gustatorischer Rezeptorneuronen kodiert werden. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie in vivo Aufzeichnungen für mehrere gustatorische Neuronen vor, während und nach präzise abgegebenen Geschmacksreizen ermöglicht.

Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, könnten es schwierig finden, da das Präparierverfahren kompliziert ist. Aus diesem Grund hoffen wir, dass die visuelle Demonstration der Methode hilfreich sein wird. Diese Techniken wurden von Sam Writer entwickelt, als er Doktorand in meinem Labor war, zusammen mit Alejandra, Kui Sun wird diese Verfahren demonstrieren.

Drei Tage nach der Eklosion wählen Sie eine Motte beiderlei Geschlechts, die im Allgemeinen ein gesundes Aussehen hat. Die Flügel sollten vollständig ausgestreckt sein, und der Rüssel und die Fühler sollten gut geformt und intakt sein. Führen Sie die ausgewählte Motte in einem Abzug in ein Rückhalterohr ein, bis der Kopf freiliegt.

Lege dann die Motte ruhig, indem du Seidenpapier in das andere Ende der Tube einführst. Entfernen Sie nun mit Druckluft, die aus einer Spritze abgegeben wird, die Haare vom freiliegenden Kopf. Legen Sie dann das Röhrchen auf eine Tonplattform in einer Petrischale.

Richten Sie den Kopf mit der Rückenseite nach oben aus. Schützen Sie als Nächstes die Antennen und den Rüssel. Stellen Sie zunächst Abdeckungen für jede Struktur aus 200-Mikroliter-Pipettenspitzen her, die in halbe Zentimeter Länge geschnitten sind.

Um den Rüssel zu manipulieren, bereite einen Haken aus einem Stück Draht vor. Verlängern Sie den Rüssel in eine der Abdeckungen, bis der nächstgelegene Teil des Rüssels geschützt ist. Befestigen Sie den Schlauch mit festem Batikwachs am dorsalen Teil der Kopfkapsel.

Ziehen Sie dann die Antennen vorsichtig ab und befestigen Sie die Röhren mit Batikwachs. Stabilisieren Sie nun das Gehirn, indem Sie den Schnallenkompressor-Muskel durchtrennen. Verwenden Sie unter dem Präpariermikroskop Mikrodissektionswerkzeuge, um die Kopfkapsel zu öffnen, indem Sie einen kleinen Schnitt direkt unter dem Rüssel machen.

Um zu bestätigen, dass der Muskel durchtrennt ist, bieten Sie Saccharoselösung zu den distalen zwei Dritteln des Rüssels an und stellen Sie fünf Minuten lang sicher, dass sich der Rüssel nicht ausdehnt. Verschließen Sie dann die Kopfkapsel mit einer Schicht geschmolzenem Batikwachs. Um das Gehirn mit Kochsalzlösung zu durchbluten, bauen Sie einen Wachsbecher um die Bauchseite des Kopfes.

Beginne mit einem elektrischen Wachser mit dem Bau eines Wachsbechers entlang der Vorderseite des Kopfes, der sich nach hinten bewegt. Bewahren Sie den Rüssel und die Antennenrohre in der Pfanne auf. Bauen Sie den Becher weiter nach außen und oben, bis er die Höhe der Augen erreicht.

Nehmen Sie mit einer Pinzette die Lippenpalpen und befestigen Sie sie mit geschmolzenem Wachs am Wachsbecher. Versiegeln Sie als Nächstes alle Öffnungen im Wachsbecher und in den Röhrchen mit einer Schicht auf binärem Epoxidharz. Mischen Sie das Epoxidharz mit einem Zahnstocher.

Decken Sie zunächst die Außen- und Innenflächen des Bechers ab. Füllen Sie zweitens den Teil des Rückhalteschlauchs, der den Hals umgibt, so dass der Kopf fester gehalten wird. Überprüfen Sie den Becher nach 20 Minuten auf Undichtigkeiten.

Um mit der Gehirnoperation zu beginnen, schneiden Sie zuerst die Lippenpalpen ab. Um die ventrale Seite der Kopfkapsel zu öffnen, schneiden Sie die Nagelhaut entlang der Rückseite und Vorderseite des Kopfes und um die Augen herum. Schneide dann entlang des Hinterkopfes und mache weitere Schnitte entlang der Vorderseite des Kopfes in der Nähe des Rüssels.

Heben Sie dann den Nagelhautlappen vorsichtig mit einer Pinzette an, um das Gehirn freizulegen. Führen Sie nun den kritischsten Schritt durch und legen Sie die SWZ und die Kiefernerven frei. Entfernen Sie langsam und vorsichtig das Fettgewebe und die Luftröhre.

Spülen Sie das Gehirn häufig mit frischer Kochsalzlösung aus. Seien Sie sehr vorsichtig, denn es ist sehr leicht, die Oberkiefernerven zu zerquetschen. Wenn die SEZ und die Nervus maxillaris endlich sichtbar sind, werden sie von einer dünnen Hülle bedeckt.

Um diese Hülle zu entfernen, lassen Sie überschüssige Kochsalzlösung ab und schwächen Sie die Hülle dann, indem Sie eine 10%ige Kollagenase-Dispase-Lösung auftragen. Nachdem Sie die Lösung fünf Minuten lang eingeweicht haben, spülen Sie sie mehrmals mit Kochsalzlösung aus. Dann, nach mehrmaligem Spülen mit Kochsalzlösung, entfernen Sie die Schleuse vorsichtig mit einer superfeinen Mikrodissektionszange.

Befestigen Sie zum Schluss eine Kochsalzlösung in der Perfusionstasse. In diesem Abschnitt wird beschrieben, wie Sie ein Tastants-Bereitstellungssystem erstellen und verwenden. Das System besteht aus einem Reagenzglas mit mehreren Öffnungen.

Die Öffnungen bieten Zugang für den Rüssel des Tieres, die Schmackhaftigkeit, einen Farbsensor und ermöglichen den Durchfluss von Wasser. Um dieses System zu bauen, bereiten Sie zunächst ein Reagenzglas für den Rüssel vor. Mache mit einem Lötkolben ein rüsselgroßes Loch.

Baue dann einen abgeschirmten Abschnitt innerhalb des Rohrs, um den Rüssel an Ort und Stelle zu halten. Schneiden Sie fünf Millimeter oberhalb des Lochs, platzieren Sie das Netz dort mit Wachs und verbinden Sie die Rohre wieder mit Wachs und Epoxidharz. Verwenden Sie ein Druckperfusionssystem, um die Geschmackstoffe zu liefern.

Verbinden Sie so viele geschmackvolle Rohre wie nötig mit einem Verteiler. Um das geschmackvolle Ausgangsrohr anzuschließen, bohren Sie ein Loch etwa einen Zentimeter über dem Netz und befestigen Sie dann das Ausgangsrohr mit Epoxidharz daran. Fügen Sie in jeden Geschmack einen künstlichen Farbstoff ein, der von einem Farbsensor erkannt wird.

Befestigen Sie einen Farbsensor an einem Loch einen halben Zentimeter um das Netz herum und befestigen Sie ihn dort mit Epoxidharz. Verwenden Sie eine Schlauchpumpe, um destilliertes Wasser über Silikonschläuche in das System zu fördern. Sammeln Sie das Abwasser mit einem großen Behälter.

Verwenden Sie eine pneumatische Pumpe, um den Geschmack mit Luftstößen zu fördern. Beginnen Sie nun, sauberes Wasser durch die Schläuche zu pumpen, und geben Sie Geschmacksimpulse ab, um den Farbsensor zu testen. Laden Sie nun die destillierten zwei Drittel des Mottenrüssels in das Reagenzglas.

Strecken Sie mit einer Pinzette den Rüssel aus und schieben Sie ihn vorsichtig in das Loch. Versiegeln Sie dann den Rüssel mit weichem Zahnwachs und einer Schicht Epoxidharz. Verbinden Sie nun die Kochsalzlösungsperfusionsleitung und stellen Sie den Perfusionsfluss ein.

Tauchen Sie dann die Masseelektrode der verdrillten Drahttetrode in das Salzbad ein. Positionieren Sie dann mit einem Mikromanipulator die Tetrode neben dem Nervus maxillaris und schieben Sie sie langsam in den Nerv vor. Lassen Sie die Vorbereitung nach dem Erkennen von Spike-Signalen mindestens 10 Minuten lang stabilisieren, bevor Sie Aufnahmen machen.

Die Aufzeichnungen wurden von gustatorischen Rezeptorneuronen vor, während und nach der geschmacklichen Verabreichung unter Verwendung des beschriebenen Protokolls gemacht. Der Beginn und Offset eines einsekündigen Impulses jedes Geschmacks wurde vom Farbsensor überwacht. Die Tasteranten lösten Spikes aus, die von jedem der vier Kanäle detektiert wurden.

Innerhalb der Spike-Züge konnten einzelne Aktionspotentiale beobachtet werden. Eine Spike-Sortiersoftware wurde verwendet, um diese Spikes eindeutigen Neuronen zuzuordnen. Die Reaktion von drei verschiedenen gustatorischen Rezeptorneuronen auf sechs nacheinander abgegebene Geschmacksrezeptoren zeigt ein unterschiedliches Maß an Ausgangsaktivität und Selektivität gegenüber den Geschmacksrezeptoren.

Außerdem hatten die Antworten ein unterschiedliches Timing. Einige sind an die Dauer des Stimulus gebunden, während andere den Stimulus überdauern. Intrazelluläre Ableitungen könnten auch von gustatorischen Rezeptor-Axonen mit herkömmlichen scharfen Glaselektroden gemacht werden.

Die intrazellulären Aufzeichnungen waren den Reaktionen, die mit der beschriebenen Tetrodentechnik beobachtet wurden, sehr ähnlich, aber die Tetrodenaufzeichnungen waren einfacher zu machen, länger anhaltend und robuster. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie in der Lage sein, die Nervus maxillaris und die subösophagale Zone in mandi-casecsta freizulegen und ein schmackhaftes Verabreichungssystem mit präziser zeitlicher Kontrolle aufzubauen. Tragen Sie während der Durchführung dieses Protokolls Laborschutzhandschuhe und eine Gesichtsmaske, da die feinen pulverförmigen Schuppen, die von mandi-casecsta abgegeben werden, allergen sein können.

Einmal gemeistert, kann dieses Verfahren in dreieinhalb Stunden abgeschlossen werden. Im Anschluss an dieses Verfahren können auch gleichzeitige Aufzeichnungen aus mehreren Hirnarealen durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. wie gustatorische Rezeptorneuronenantworten auf Geschmäcker transformiert werden, wenn sie an die postsynaptischen Zielneuronen übertragen werden.