Neue Methoden zum Studieren der Gustatory Coding

Das übergeordnete Ziel dieser Methoden besteht darin, die gustatorische Kodierung bei einem einfachen Tiermodell Mandi-casecsta zu untersuchen, indem die Aktivität mehrerer Rezeptorneuronen in vivo aufgezeichnet wird, während präzise zeitgesteuerte Reizimpulse von Geschmacksstoffen appliziert und überwacht werden. Diese Methoden können helfen, zentrale Fragen zur Geschmackswahrnehmung zu beantworten, beispielsweise wie Geschmacksreize durch Populationen gustatorischer Rezeptorneuronen kodiert werden. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie in vivo-Aufzeichnungen von mehreren gustatorischen Neuronen vor, während und nach präzise applizierten Geschmacksreizen ermöglicht.

Personen, die mit dieser Methode neu sind, könnten dies als herausfordernd empfinden, da der Dissektionsvorgang komplex ist. Daher hoffen wir, dass die visuelle Demonstration der Methode hilfreich sein wird. Diese Techniken wurden von Sam Writer entwickelt, als er Doktorand in meinem Labor war, zusammen mit Alejandra, und Kui Sun wird diese Verfahren demonstrieren.

Drei Tage nach der Eclose ein Falter beliebigen Geschlechts mit allgemein gesundem Erscheinungsbild auswählen. Die Flügel sollten vollständig ausgefaltet sein, und Rüssel sowie Fühler sollten gut geformt und intakt sein. In einer Abzugshaube den ausgewählten Falter in eine Fixierhülle schieben, bis der Kopf herausragt.

Dann fixieren Sie den Schmetterling, indem Sie Papiertuch in das andere Ende des Röhrchens einführen. Entfernen Sie nun mithilfe von Druckluft, die aus einer Spritze abgegeben wird, die Haare vom freiliegenden Kopf. Stellen Sie danach das Röhrchen auf eine Tonhalterung in einer Petrischale ab.

Richten Sie den Kopf mit der dorsalen Seite nach oben aus. Schützen Sie anschließend die Antennen und den Saugrüssel. Stellen Sie zuerst Abdeckungen für jede Struktur aus 200-Mikroliter-Pipettenspitzen her, die in halbzentimeterlange Stücke geschnitten wurden.

Um den Rüssel zu manipulieren, bereiten Sie einen Haken aus einem Stück Draht vor. Strecken Sie den Rüssel in eine der Abdeckungen hinein, bis der proximalste Teil des Rüssels geschützt ist. Befestigen Sie das Röhrchen mit festem Batikwachs am dorsalen Teil der Kopfkapsel.

Danach die Antennen vorsichtig abstreifen und die Röhrchen mit Batikwachs sichern. Nun das Gehirn stabilisieren, indem der Schnallenmuskulaturkompressor durchtrennt wird. Unter dem Dissektionsmikroskop mit Mikrodissektionswerkzeugen die Kopfkapsel öffnen, indem ein kleiner Schnitt direkt unterhalb des Rüssels angelegt wird.

Um zu überprüfen, ob der Muskel durchtrennt ist, wird eine Saccharoslösung auf die distalen zwei Drittel des Rüssels aufgetragen, und fünf Minuten lang sichergestellt, dass sich der Rüssel nicht ausstreckt. Anschließend wird die Kopfkapsel mit einer Schicht geschmolzenem Batikwachs verschlossen. Um das Gehirn mit physiologischer Kochsalzlösung zu perfundieren, wird ein Wachskübel um die ventrale Seite des Kopfes gebaut.

Verwenden Sie einen elektrischen Wachsaufträger, um entlang der Vorderseite des Kopfes in Richtung der Rückseite einen Wachstrichter zu formen. Halten Sie die Rüssel- und Fühlerkanäle innerhalb des Trichters. Setzen Sie das Formen des Trichters nach außen und nach oben fort, bis er die Höhe der Augen erreicht.

Entnehmen Sie mit einer Pinzette die labialen Palpen und befestigen Sie sie mit geschmolzenem Wachs an der Wachstülle. Dichten Sie anschließend alle Öffnungen in der Wachstülle und den Röhren mit einer dünnen Schicht zweikomponentigem Epoxidharz ab. Mischen Sie das Epoxidharz mit einem Zahnstocher.

Zuerst die äußeren und inneren Oberflächen des Bechers bedecken. Danach den Teil des Halterohrs, der den Hals umgibt, füllen, damit der Kopf fester gehalten wird. Nach 20 Minuten den Becher auf Undichtigkeiten überprüfen.

Um die Gehirnoperation zu beginnen, schneiden Sie zuerst die labialen Palpen ab. Um die ventrale Seite der Kopfkapsel zu öffnen, schneiden Sie die Cuticula entlang der Rückseite und Vorderseite des Kopfes sowie um die Augen herum. Anschließend schneiden Sie entlang der Rückseite des Kopfes und führen weitere Schnitte entlang der Vorderseite des Kopfes in der Nähe des Rüssels durch.

Heben Sie dann vorsichtig mit einer Pinzette die Cuticula-Falte an, um das Gehirn freizulegen. Führen Sie nun den wichtigsten Schritt durch: die Freilegung der SEZ und der maxillären Nerven. Entfernen Sie langsam und sorgfältig Fettgewebe und die Trachee.

Spülen Sie das Gehirn häufig mit frischer Kochsalzlösung. Seien Sie sehr vorsichtig, da es sehr leicht ist, die Maxillarnerven zu zerquetschen. Wenn die SEZ und die Maxillarnerven schließlich sichtbar sind, werden sie von einer dünnen Hülle bedeckt sein.

Um diese Hülle zu entfernen, abfließen lassen Sie überschüssige Kochsalzlösung ab und schwächen Sie die Hülle anschließend durch Auftragen einer 10 %igen Kollagenase-Dispase-Lösung. Nach einer Einwirkzeit von fünf Minuten spülen Sie die Lösung mehrmals mit Kochsalzlösung aus. Danach entfernen Sie vorsichtig die Hülle nach mehrmaligem Spülen mit Kochsalzlösung mithilfe von feinsten Mikrodissektionspinzetten.

Zuletzt befestigen Sie eine Kochsalzlösungs-Tropfleitung in der Perfusionskappe. Dieser Abschnitt beschreibt, wie ein System zur Applikation von Geschmacksstoffen aufgebaut und verwendet wird. Das System besteht aus einem Prüfrohr mit mehreren Öffnungen.

Die Öffnungen dienen als Einstieg für den Rüssel des Tieres, das Aromastoff-Mehrwegeventil, einen Farbsensor und ermöglichen den Durchfluss von Wasser. Um dieses System aufzubauen, bereiten Sie zunächst ein Teströhrchen für den Rüssel vor. Erstellen Sie mit einem Lötkolben ein loch in der Größe des Rüssels.

Danach einen abgeschirmten Bereich innerhalb des Rohrs anlegen, um den Rüssel an Ort und Stelle zu halten. Fünf Millimeter oberhalb des Lochs abschneiden, das Netz mit Wachs dort befestigen und die Röhrchen mit Wachs und Epoxidharz wieder verbinden. Ein unter Druck stehendes Perfusionsystem verwenden, um die Geschmacksstoffe zuzuführen.

Verbinden Sie so viele Geschmacksstoffröhrchen, wie benötigt, mit einem Verteiler. Um das Auslassröhrchen für den Geschmacksstoff anzuschließen, bohren Sie ein Loch etwa einen Zentimeter über dem Netz und befestigen Sie das Auslassröhrchen mit Epoxidharz daran. Geben Sie in jeden Geschmacksstoff einen künstlichen Farbstoff ein, der von einem Farbsensor erfasst werden kann.

Befestigen Sie einen Farbsensor an der Vorrichtung an einer Öffnung einen halben Zentimeter über dem Netz und sichern Sie ihn dort mit Epoxidharz. Verwenden Sie eine peristaltische Pumpe, um destilliertes Wasser über Silikonschläuche in das System zu leiten. Sammeln Sie das Abwasser mit einem großen Behälter auf.

Verwenden Sie eine pneumatische Pumpe, um die Geschmacksstoffe mit Luftstößen zuzuführen. Beginnen Sie nun damit, sauberes Wasser durch die Schläuche zu pumpen, und geben Sie kurze Impulse des Geschmacksstoffes ab, um den Farbsensor zu testen. Führen Sie nun die destillierte Flüssigkeit zu zwei Dritteln des Schmetterrüssels in das Probenglas ein.

Strecken Sie mit einer Pinzette den Rüssel aus und schieben Sie ihn vorsichtig in das Loch. Dichten Sie den Rüssel dann mit weichem Zahnwachs und einer Schicht Epoxidharz ab. Schließen Sie nun die Pufferperfusionsleitung an und stellen Sie den Perfusionsfluss ein.

Danach tauchen Sie die Masselektrode des verdrillten Draht-Tetroden in das Salzlösungsbad. Positionieren Sie anschließend mithilfe eines Mikromanipulators die Tetrode neben dem Nervus maxillaris und führen Sie sie langsam in den Nerv ein. Nach dem Nachweis von Aktionspotentialen lassen Sie das Präparat mindestens 10 Minuten lang stabilisieren, bevor Sie die Aufzeichnungen beginnen.

Die Ableitungen erfolgten von gustatorischen Rezeptorneuronen vor, während und nach der Applikation der Geschmacksstoffe gemäß dem beschriebenen Protokoll. Der Beginn und das Ende eines einsekündigen Pulses jedes Geschmacksstoffs wurden durch den Farbsensor überwacht. Die Geschmacksstoffe lösten Spikes aus, die von jedem der vier Kanäle detektiert wurden.

Innerhalb der Spiketrainings konnten einzelne Aktionspotentiale beobachtet werden. Eine Spike-Sortierungssoftware wurde verwendet, um diese Spikes einzelnen Neuronen zuzuordnen. Die Reaktion von drei verschiedenen gustatorischen Rezeptorneuronen auf sechs nacheinander applizierte Geschmacksstoffe zeigt unterschiedliche Grundaktivitätsniveaus und Selektivitäten gegenüber den Geschmacksstoffen auf.

Außerdem unterschieden sich die Antworten in ihrem zeitlichen Verlauf. Einige sind an die Dauer des Reizes gekoppelt, während andere den Reiz überdauern. Intrazelluläre Ableitungen konnten ebenfalls von den Axonen gustatorischer Rezeptoren mit herkömmlichen scharfen Glaselektroden durchgeführt werden.

Die intrazellulären Ableitungen waren den Reaktionen, die mit der beschriebenen Tetroden-Technik beobachtet wurden, sehr ähnlich, jedoch waren die Tetroden-Ableitungen einfacher durchzuführen, langlebiger und robuster. Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie in der Lage sein, die maxillären Nerven und die subösophageale Zone in Mandi-casecsta freizulegen, und sollten ein Geschmacksstoff-Zufuhrsystem mit präziser zeitlicher Steuerung aufbauen können. Während Sie dieses Protokoll durchführen, tragen Sie Laborschutzhandschuhe und eine Gesichtsmaske, da das feine, pulverförmige Schuppenmaterial, das von Mandi-casecsta abgegeben wird, allergen wirken kann.

Wenn die Methode einmal beherrscht ist, kann das Verfahren innerhalb von dreieinhalb Stunden abgeschlossen werden. Mit diesem Verfahren können anschließend auch gleichzeitige Ableitungen aus mehreren Gehirnarealen durchgeführt werden, um weitere Fragestellungen zu beantworten, beispielsweise wie die Antworten gustatorischer Rezeptorneuronen auf Geschmacksstoffe transformiert werden, wenn sie an die nachgeschalteten Zielneuronen weitergeleitet werden.