Analyse der Gap-Junction-abhängigen Übertragung von miRNA mit 3D-FRAP-Mikroskopie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, den Gap-Junction-abhängigen Transfer von microRNA in lebenden Kardiomyozyten zu untersuchen. Diese Methode kann dazu beitragen, die Rolle von microRNA für das interzelluläre Signaltransaktionssystem zu untersuchen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass der Gap-Junction-Austausch von microRNA in lebenden Zellen mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung sichtbar gemacht und quantifiziert werden kann.

Nach der Isolierung von Kardiomyozyten gemäß dem Textprotokoll werden die Zellen auf sechs Well-Platten mit einer Dichte von dreimal 10 bis zu den fünften Zellen pro Quadratzentimeter plattiert. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Geben Sie am nächsten Tag 0,5 Trypzin zu den Zellen und inkubieren Sie die Kulturen fünf Minuten lang, um die Zellen zu lösen.

Inaktivieren Sie das Trypzin durch Zugabe von Zellkulturmedium. Nachdem Sie die Zellen gezählt haben, zentrifugieren Sie sie 10 Minuten lang bei 300 mal g. Verwenden Sie dann Elektroporationspuffer, um die Zellen viermal 10 bis zu den fünften Zellen pro 100 Mikroliter wieder zu suspendieren.

Mischen Sie anschließend 100 Mikroliter Zellsuspension mit fluoreszierender Mikro-RNA in einem Röhrchen und laden Sie die Mischung in eine Elektroporationsküvette. Führen Sie dann die Elektroporation mit dem Programm G009 auf dem Elektroporator durch. Fügen Sie 500 Mikroliter vorgewärmtes Zellkulturmedium hinzu und überführen Sie das gesamte Volumen der Zellsuspension in eine Vertiefung eines Objektträgers mit vier Vertiefungen mit Glasboden.

Kultivieren Sie die Zellen einen Tag lang bei 37 Grad Celsius in einer Atmosphäre mit 5 % Kohlendioxid. Nachdem Sie den Mikroskop-Inkubator vorgewärmt und das Konfukalsystem eingeschaltet haben, setzen Sie den Kammerobjektträger in den Probenhalter ein. Verwenden Sie ein 1,4-na-Ölobjektiv und 561 Nanometer Laseranregungslicht bei geringer Laserleistung mit einem Nachweisbereich von 570 bis 680 Nanometern, um den Cluster transvektierter Kardiomyozyten zu finden.

Aktivieren Sie anschließend im Setup-Manager die Schaltflächen "Z-Stapel", "Zeitreihen", "Bleichen" und "Regionen". Um dann die Frap-Parameter zu definieren, stellen Sie im Menü für den Aufnahmemodus die Bildgröße auf 512 x 512, den Zeilenschritt auf eins und die Scanzeit auf weniger als eine Sekunde ein. Passen Sie im Kanalmenü die Einstellungen für Laserleistung, Offset und Verstärkung an, um maximale Fluoreszenz bei minimaler Laseranregung zu erzielen und eine Intensitätssättigung zu vermeiden.

Stellen Sie dann die Lochblendengröße auf zwei Mikrometer ein. Wählen Sie anschließend im Menü "Regionen" das Roy-Zeichenwerkzeug aus und markieren Sie mit dem Cursor die Zielzelle, die Referenzzelle und den Hintergrundbereich. Wählen Sie bei Bedarf mehrere Zielzellen für das Photobleaching aus.

Passen Sie im Bleaching-Menü die Einstellungen für das Foto-Bleaching an. Definieren Sie dann im Menü "Z-Stapel" die Grenzwerte für die Erfassung des Z-Stapels, abhängig von der Dicke der Zellen. Stellen Sie die Anzahl der Z-Schichten auf 12 bis 15 ein, starten Sie dann das Frap-Experiment und zeichnen Sie die Fluoreszenzwiederherstellung auf.

Um die Daten zu analysieren, erstellen Sie die maximale Projektion der erfassten Z-Stapel mit mikroskopspezifischer Software, klicken Sie auf Verarbeitung, Projektion mit maximaler Intensität, Datei auswählen, anwenden. Kopieren Sie abschließend die Fluoreszenzintensitätsdaten zu allen Zeitpunkten vom Target, dem Hintergrund und der Referenzzelle in eine Tabelle und führen Sie die Datenanalyse gemäß dem Textprotokoll durch. Hier sind isolierte Kardiomyozyten mit dem typischen quergestreiften alpha-Actinin-Muster und großen Plaques von Connexin43 entlang der Zell-zu-Zell-Grenzen.

In der Kultur waren einige Nicht-Kardiomyozyten vorhanden. Wie hier zu sehen ist, wurde mittels Durchflusszytometrie eine Transvektionseffizienz von 45 % erreicht. Darüber hinaus zeigte ein Aufsatz über lebende Tote, dass die Mehrheit der Zellen eine hohe Lebensfähigkeit zeigte, was für die Analyse der Gap-Junctional-Kommunikation wichtig ist.

Für die Frap-Analyse werden die Zielzellen innerhalb eines Zellclusters ausgewählt und mit 100 % Laserleistung photogebleicht, was zu einer reduzierten Mikro-RNA-Fluoreszenz in den ausgewählten Zellen führt. Die quantitative Analyse und Normalisierung der gewonnenen Daten zeigte eine durchschnittliche Wiederfindung von 20%In diesem Experiment führte der siRNA-vermittelte Knockdown von Connexin43 zu einer verminderten Proteinexpression und der Hemmung der Gap-Junctional-Kommunikation. Die Fluoreszenzrückgewinnung wurde um mehr als 50 % reduziert, was darauf hindeutet, dass die Effizienz des Miro-RNA-Transfers stark von der Gap-Junctional-Kopplung zwischen den Zellen abhängt.

Diese Abbildung zeigt ein 3D-Oberflächen-Rendering eines Frap-Experiments. Im Vergleich zu maximalen Projektionen kann die Erfassung von z-Stacks verwendet werden, um 3D-Rekonstruktionen zu erstellen, um die Lokalisierung und Mobilität von micro-RNA innerhalb von Zellen zu untersuchen. Einmal gemeistert, können Frap-Messungen in zwei bis drei Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt werden.

Bei diesem Verfahren ist es wichtig, Zielzellen auszuwählen, die die gleiche Anzahl benachbarter Zellen haben. Darüber hinaus sollten meine Bleichparameter und Bildaufnahmebedingungen so gewählt werden, dass phototoxische Effekte vermieden werden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Frap-Mikroskopie verwenden, um die Bewegung von microRNA innerhalb zellulärer Cluster zu quantifizieren und zu visualisieren.