Gleichzeitige Messung von HDAC1 und HDAC6 Tätigkeit in HeLa-Zellen mit UHPLC-MS

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, das HDAC-Hemmpotenzial von Verbindungen zu bestimmen und die Selektivität gegenüber HDAC6 oder HDAC1 in Zellen mit Hilfe eines einzigen Ultrahochleistungs-Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie-Assays zu identifizieren. Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen im Bereich der Wirkstoffforschung zu beantworten, z. B. die Bestimmung, ob ein HDAC-Inhibitor für HDAC6 gegenüber Klasse-I-HDACs in lebenden Zellen selektiv ist. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie einen einzigen Inkubationsschritt mit Zellen, Inhibitoren und selektiven Substraten erfordert, um die Wirksamkeit gegen zwei HDAC-Isoformen gleichzeitig zu bestimmen.

Die Implikation dieser Technik erstreckt sich auf die frühe Wirkstoffforschung selektiver HDAC-Inhibitoren, da sie erkennt, ob die HDAC6-Selektivität in lebenden Zellen aufrechterhalten wird, wodurch endogene Proteinacetylierungsassays vermieden werden. Obwohl diese Methode die Selektivität von HDAC-Inhibitoren in HeLa-Zellen bewertet, kann sie auch auf andere Zelllinien wie Primär- und andere Tumorzellen, einschließlich klinischer Proben, angewendet werden. Kultur von HeLa-Zellen bis zu 80 % Konfluenz in einem T75-Zellkulturkolben in einem Minimum an essentiellen Medien, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum, Penicillin G und Streptomycin.

Waschen Sie die Zellen zweimal mit fünf Millilitern Dulbecco's Phosphat-Buffered Saline. Aspirieren Sie dann den Puffer und fügen Sie einen Milliliter Zelldissoziationsreagenz hinzu. Inkubieren Sie fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius, um die Zellen zu lösen.

Geben Sie nach fünf Minuten neun Milliliter MEM-Kulturmedium in die Zellen und resuspendieren Sie die Zellsuspension gründlich. Übertragen Sie die Zellen in ein neues 15-Milliliter-Röhrchen und zählen Sie die Zellen dann mit einem Hämozytometer. Stellen Sie die Dichte der Zellsuspension auf 60.000 Zellen pro Milliliter in MEM ein.

Geben Sie anschließend 100 Mikroliter der Zellsuspension in die Kontroll- und Testvertiefungen einer sterilen 96-Well-Platte mit flachem Boden und Gewebekultur. Geben Sie dann 100 Mikroliter MEM-Nährmedium in die leeren Vertiefungen der 96-Well-Platte. Inkubieren Sie die 96-Well-Platte 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius.

Saugen Sie das Medium aus den Vertiefungen der 96-Well-Platte an. Vermeiden Sie beim Ansaugen des Mediums das Ablösen und Entfernen von Zellen aus der Vertiefung. Dies kann erreicht werden, indem eine niedrige Absaugrate verwendet und die Aspirierspitzen vorsichtig in der unteren Ecke der Well-Oberfläche platziert werden.

Geben Sie dann 25 Mikroliter der zweifachen Testverbindungen in MEM in die Testvertiefungen, einschließlich Trichostatin A, MS275 und Tubastatin A.Geben Sie 25 Mikroliter MEM in die Kontroll- und Blindvertiefungen. Geben Sie anschließend 25 Mikroliter der Substratmischung in die Kontroll- und Testvertiefungen. Geben Sie dann 25 Mikroliter MEM in die Blindvertiefungen.

Inkubieren Sie die 96-Well-Platte acht Stunden lang bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten 5%igen Kohlendioxid-Inkubator. Um eine Zelllyse durchzuführen, geben Sie zunächst 10 Mikroliter sechsfachen RIPA-Puffer, der mit einem Proteaseinhibitor ergänzt ist, in jede Vertiefung der 96-Well-Platte. Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie 160 Mikroliter kaltes Acetonitril in jede Vertiefung geben und durch Auf- und Abpipettieren mischen.

Stellen Sie die Platte für 10 Minuten in einen Gefrierschrank bei minus 80 Grad Celsius. Nehmen Sie die Platte aus dem Gefrierschrank und geben Sie 220 Mikroliter des Inhalts jeder Vertiefung auf eine unsterile, konische Bodenplatte mit 96 Vertiefungen. Zentrifugieren Sie die Platte bei 5.000 g und vier Grad Celsius für 10 Minuten.

Nach der Zentrifugation werden 200 Mikroliter Überstand in eine 96-Well-Platte überführt, die mit dem UHPLC-System kompatibel ist. Verschließen Sie dann die Platte mit abziehbarer Heißsiegelfolie mit einem Plattenversiegeler. Bereiten Sie das Ultrahochleistungs-Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometriesystem vor, indem Sie es mit dem mobilen Phasensystem befüllen.

Setzen Sie die 96-Well-Platte in einen Probenmanager ein, der einen Plattenhalter enthält. Führen Sie die Beispiele gemäß den UHPLC ESI MS/MS-Bedingungen aus, die im Text zu finden sind. Um eine Datenanalyse durchzuführen, integrieren Sie die Peakfläche jedes Substrats und seines deacetylierten Produkts in die entsprechende UHPLC-Integrationssoftware.

Berechnen Sie für jedes Substrat das Peakflächenverhältnis von deacetyliert zu acetyliert in jedem Chromatogramm. Fügen Sie die Test- und Kontrollproben hinzu. Berechnen Sie abschließend die prozentuale HDAC-Hemmung jeder Testprobe gemäß der Gleichung im Textprotokoll.

Hier wird das UHPLC-MS-Chromatogramm einer Probe dargestellt. Die Peaks, die den den Zellen zugesetzten Substraten entsprechen, werden entsprechend ihren Massenübergängen detektiert, wie in Tabelle eins des schriftlichen Protokolls beschrieben. MOCPAC wird durch HDAC1 deacetyliert, um den deacetylierten MOCPAC-Peak bereitzustellen.

In ähnlicher Weise wird BATCP durch HDAC6 deacetyliert, um den deacetylierten BATCP-Peak bereitzustellen. Schließlich liefert MAL den deacetylierten MAL-Peak, der die Deacetylierung mehrerer endogener HDACs unspezifisch widerspiegelt. Hier gezeigt wurde die Abbildung mit dem Chromatogramm, das mit unterschiedlichen Konzentrationen des HDAC-Inhibitors Trichostatin A.A erhalten wurde, zur Dosis-Wirkungs-Bewertung von Standard-HDAC-Inhibitoren durchgeführt.

Die integrierten Werte aus MOCPAC und dMOCPAC wurden verwendet, um die Wirksamkeit von Standardinhibitoren gegen HDAC1 zu berechnen. Nach IC 50-Berechnungen zeigte MS275, ein selektiver HDAC-Inhibitor der Klasse I, niedrigere IC 50-Werte für HDAC1 als Tubastatin A, ein bekannter HDAC6-Inhibitor. Zum anderen wurden die isolierten Werte aus BATCP und dBATCP verwendet, um die Wirksamkeit der Standards gegenüber HDAC6 zu berechnen.

Diesmal lieferte Tubastatin A einen niedrigeren IC-50-Wert als MS275, was ihr Isoform-Selektivitätsprofil bestätigte. Trichostatin A ist ein potenter, nichtselektiver Inhibitor. Einmal gemeistert, kann diese Technik in 72 Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird, einschließlich der Zellbehandlungszeit und der Analyse der 96-Well-Platte.

Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass die hier angegebenen Inkubationszeiten für HeLa-Zellen gelten. Wird eine andere Zelllinie verwendet, muss diese optimiert werden. Nach diesem Verfahren konnte die selektive HDAC-Hemmaktivität anderer Isoformen gemessen werden, solange spezifische Substrate vorhanden sind.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit organischen Lösungsmitteln und anderen Chemikalien äußerst gefährlich sein kann und dass bei diesem Verfahren immer eine Schutzbrille, Handschuhe und ein Laborkittel getragen werden sollten.