Name: Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen in der Autophagie-Forschung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 8 s
Description: Lernen Sie Immunofluoreszenz und Immunopräzipitation zur Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen in der Autophagie-Forschung. Diese Methoden ermöglichen die Analyse endogener Proteindynamiken in Säugetierzellen.

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Diese Arbeit wurde durch wissenschaftliche und technologische Forschung Rat der Türkei (TÜBITAK) 1001 Grant 107T153, der Sabanci-Universität unterstützt. SEB und NMK werden durch ein TUBITAK BIDEB 2211-Stipendium für Promotion unterstützt.

1. Immunfluoreszenz <ol><li>pflegen HEK293T menschliche embryonale Nieren-Zellen in DMEM hohe Glukose Medium und N2A Neuroblast Mauszellen in DMEM niedrige Glukose Medium in einer 5 % CO 2-befeuchteten Inkubator bei 37 ° C. Ergänzen die Nährmedien mit 10 % Hitze-inaktivierten fetalen Rind (FBS) Serum, Antibiotika (50 U/mL Penicillin, 50 µg/mL Streptomycin) und L-Glutamin (2 mM).</li>
	<li>Lösen die Zellen mittels Trypsin 0,25 %. Zuerst entfernen Sie das Medium der Zellkultur dann waschen Sie die Zellen mit 10 mL sterile Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) und inkubieren Sie mit 1 mL Trypsin bei 37 ° C für 5 min. Inaktivierung Trypsin durch Zugabe von 2 mL DMEM Medium.</li>
	<li>Waschen die Platte gut durch pipettieren. Entfernen Sie 10 µL der Zelle Lösung zu und mischen Sie es mit 10 µL Trypan blau. Die Anzahl der lebenden Zellen mit einem Hemocytometer.</li>
	<li>Sowohl HEK293T und N2A adhärenten Zelllinien, jedoch HEK293T Zellen von der Platte leicht lösen. Aus diesem Grund arbeiten mit HEK293T Zelllinie Mantel der Coverslides mit sterilen gefiltert 0,01 % Poly-L-Lysin vor der Aussaat Zellen.
	<ol><li>Ort sterile Coverslides in einer 10 cm Petrischale. Fügen Sie die entsprechende Menge an Poly-L-Lysin-Lösung auf jeder Coverslide. Inkubieren Sie die Coverslides mit Poly-L-Lysin-Lösung für 10 min.</li>
		<li>Die Poly-L-Lysin-Lösung entfernen. 
		Hinweis: Poly-L-Lysin ist wiederverwendbar; Es ist optional zu sammeln und für weitere Experimente wiederverwenden. Da Poly-L-Lysin giftig ist, warten Sie, bis die Lösung auf die Coverslides vollständig verdampft und dann Wiederherstellen der Poly-L-Lysin.</li>
		<li>Die Coverslides mit sterilen PBS waschen.</li>
	</ol></li> <li>Fügen Sie 1 mL DMEM in jede Vertiefung eine 12-Well-Platte. Legen Sie eine Coverslide in jede Vertiefung.</li>
	<li>Samen 20.000 Zellen/Brunnen, Tropfen für Tropfen beim Schütteln der Plattenrandes gleichzeitig für eine homogene Verteilung der Zellen auf die Coverslides. Halten die Zellen in der CO 2 Inkubator bei 37 ° C und fügen Sie das Medikament so, dass die gesamte Inkubationszeit 48 h nicht überschreitet, d.h. 3 h Torin Behandlung, fügen Sie das Medikament am 45 h Post Aussaat.
	<ol><li>Für RACK1-LC3 Wechselwirkungsstudien, Torin 1, Rapamycin und Hunger dienten als Autophagie Induktoren. Zellen wurden mit Torin 1 (250 nM Endkonzentration); 3 h inkubiert. mit Rapamycin für 16 h (200 nM Endkonzentration); und mit Earle &#39; s ausgewogen Salz Lösung (EBSS) für 2 h um Zellen verhungern. 
		Hinweis: Inkubation in DMEM mit 10 % FBS als der Kontrollbedingung diente.</li>
	</ol></li> <li>Nach 48 h insgesamt Inkubationszeit, die Medien auf die Coverslides zu entfernen und waschen Sie sie mit 1 mL PBS.</li>
	<li>Um die Zellen zu beheben inkubieren Sie die Zellen mit 1 mL Eis kalte sterile gefilterte 4 % Paraformaldehyd (PFA) mit 1 X PBS-Puffer (pH-Wert 7,4), für 20 min bei Raumtemperatur ohne jede Aufregung. 
	Da PFA lichtempfindlich ist, halten Sie (wichtig) die Platte in der Dunkelheit während der Inkubationszeit; die Abdeckplatte mit Alu-Folie kann helfen. Darüber hinaus PFA ist giftig, daher, unter einem Abzug zu arbeiten, während die Zellen fixieren. 
	Hinweis: Denken Sie daran, die die Fixierung treten in Immunfluoreszenz Experimente sollten optimiert werden, wie spezifische Antikörper funktionieren am besten mit verschiedenen Fixierung Mittel und Bedingungen.</li>
	<li>Nach 20 min PFA Inkubation, entfernen Sie zunächst die PFA-Lösung auf den Coverslides und dann waschen jede Probe 3 Mal mit 1 mL sterile gefilterte PBS. Bei diesem Schritt (wichtig) waschen Brunnen eins nach dem anderen um nicht trocknen lassen. Zu vermeiden, trocknen, da es mit anschließenden Reaktionen der Zellen stören, ändert sich die Zellmorphologie und unspezifische Signale zu erhöhen.</li>
	<li>Wenn die Wäsche abgeschlossen ist, halten Sie die Proben in 1 mL PBS auf Eis.</li>
	<li>Bereiten Sie die blockierende Lösung: PBS mit 0,1 % Bovine Serum Albumin (BSA) und 0,1 % Saponin.</li>
	<li>Decken eine 6-Well-Platte mit Paraffin Film. Sicherstellen Sie, dass die Platte unten glatt nach Paraffin Film Deckung. Beschriften Sie die 6-Well-Platte.</li>
	<li>Mit einer Pinzette, Übertragung der Coverslides aus der 12-Well-Platten auf der 6-Well-Platten mit Paraffin Film bedeckt.</li>
	<li>Verwerfen die PBS auf Coverslides und fügen Sie 100 µL Lösung auf jeder Coverslide für Permeabilisierung zu blockieren. Inkubieren Sie die Proben auf Eis für 30 min.</li>
	<li>Bereiten den primären Antikörper blockieren Lösung. Vor Experimenten, optimieren die Antikörper-Verdünnungen definieren die beste Arbeit-Konzentrationen für beflecken. 
	Hinweis: LC3 Antikörper ist z. B. bei einer Verdünnung von 1: 100 Lösung blockieren.</li>
	<li>Nach 30 min Inkubation, die blockierende Lösung zu verwerfen und die Proben vorsichtig mit 1 mL PBS einmal waschen.</li>
	<li>Hinzufügen 100 µL Primärantikörper Lösung für jedes Coverslide. Inkubieren Sie die Proben bei Raumtemperatur 1 h auf einem Schüttler. 
	Hinweis: Mit dem primären Antikörper Inkubationszeit sollte optimiert werden. Abhängig von der Antikörper kann eine Übernachtung Inkubation bei 4 ° C vorzuziehen. Es empfiehlt sich, auf einen Shaker sanft inkubieren (100 Umdrehungen/min) zu verteilen die Antikörper auf die Coverslides.</li>
	<li>Nach der Inkubation mit dem primären Antikörper Proben einzeln, 3 Mal mit 1 mL PBS waschen.</li>
	<li>Vorbereiten 1: 500 Sekundärantikörper in blocking-Lösung (Optimierungen der Verdünnungen des sekundären Antikörpers können erforderlich sein). Hier, Anti-Kaninchen IgG Alexa Fluor 568 diente als ein Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper.
	<ol><li>Inkubieren Sie die Proben mit 100 µL der Sekundärantikörper Lösung für 1 h bei Raumtemperatur in einen Shaker geben. Da der Fluorophor-markierten Sekundärantikörper sind lichtempfindlich, (wichtig) halten Sie die Lösung in der Dunkelheit. Die Proben im Dunkeln zu platzieren, während und nach der Inkubation Sekundärantikörper.</li>
	</ol></li> <li>Nach der Sekundärantikörper Inkubation, waschen Sie die Platte 3 Mal mit PBS. 
	Hinweis: Baed auf Erfahrung, einige Antikörper haben hohen Hintergrund-Signale, die von PBS nicht beseitigt werden können wäscht. Wenn mit solchen Antikörpers nach Schritt 1.21, kann es helfen, halten die Proben mit PBS-Puffer bei 4 ° C für 6 h.
	<ol><li>Bei Bedarf färben die Zellen mit einem DNA-bindenden Farbstoff, wie Hoechst, um die Kerne zu markieren.</li>
	</ol></li> <li>Um mehr als ein Protein zu färben, gilt das gleiche Verfahren ab Schritt 1.16 für das zweite Protein.
	<ol><li>Stellen Sie sicher, dass es keine Arten Reaktivität zwischen die Antikörper bei Färbung mit mehr als einem Antikörper (z. B. Verwendung Maus und Kaninchen-Antikörper). 
		Hinweis: Hier RACK1 wird gefärbt, als die zweite Protein mit Anti-RACK1 primären Antikörper und Anti-Maus IgG Alexa Fluor 488 Sekundärantikörper verwenden die gleichen Konzentrationen, die oben genannten.</li>
	</ol></li> <li>Bereiten Sie die Montage-Lösung: 50 % Glycerin in 1 X PBS. Filter durch ein 22 µm-Sieb.</li>
	<li>Die Folien mit Ethanol mit einem fusselfreien Tuch abwischen und jede Folie 10 µL Befestigungslösung hinzufügen. Legen Sie mit Hilfe einer Pinzette, die Coverslides auf jeder Dropso, die die Seite mit den Zellen in direkten Kontakt mit dem Montage-Medium ist. Entsorgen Sie überschüssige Befestigungslösung sanft mit fusselfreien Wischtücher.</li>
	<li>Abdichtung der Coverslides mit einem transparenten Nagellack. Zuerst die Coverslides zu stabilisieren, indem Tropfen Nagellack auf die 4 Kanten und dann vollständig zu versiegeln.</li>
	<li>Analysieren die Proben unter dem Leuchtstoff oder confocal Mikroskop so bald wie möglich, da nach ein paar Stunden das Fluoreszenzsignal bleichen kann.</li>
</ol> 2. Immunopräzipitation <ol><li>trennen und zählen die Zellen als Schritte 1.2 und 1.3 beschriebenen.</li>
	<li>Samen funktioniert mit HEK293T Zellen, 4 Millionen Zellen für jede Bedingung in 15 cm Petrischalen. Arbeiten mit Zellen N2A Samen Sie 5 Millionen Zellen in 15 cm Petrischalen. Die Zellen in einem CO 2 Inkubator bei 37 ° C inkubieren Sie bis zum Ende des Experiments.</li>
	<li>Behandeln die Zellen mit den entsprechenden Drogen oder Bedingungen für eine festgelegte Dauer, so dass die gesamte Inkubationszeit der Zellen nicht mehr 48 h als 
	Hinweis: Für die Immunopräzipitation Tests in dieser Studie wurden Zellen für 3 h mit Torin 1 behandelt (250 nM), 16 h mit Rapamycin (200 nM), und 2 h mit EBSS. DMEM mit 10 % FBS, um die Zellen als Steuerelement der hinzugefügt wurde.</li>
	<li>Nach 48 h der totalen Inkubationszeit, entfernen Sie das Medium und die Zellen zu ernten. Da HEK293T Zellen leicht von der Platte zu lösen, kann waschen der Platte mit Eis kaltem PBS für Ernte ausreichend. N2A Zellen sind jedoch widerstandsfähiger gegen Ablösung; Zelle Schaber verwenden, um die Zellen zu ernten.
	<ol><li>Sammeln alle Zellen in Mikrozentrifugenröhrchen.</li>
	</ol></li> <li>Zentrifuge Proben bei 16.000 x g für 15 min bei 4 ° C. verwerfen der Überstand und waschen das Pellet mit 1 mL PBS dadurch, dass es erneut durch pipettieren.</li>
	<li>Zentrifuge Schritt zu wiederholen, aber wirf die höchste Geschwindigkeit der Zentrifuge bei 4 ° C für 15 min. Überstands.</li>
	<li>Bereiten Radio Immuno-Niederschlag Assay (RIPA) Puffer vor Beginn des Experiments. 
	Hinweis: Es gibt 3 Arten von RIPA Puffer; Wählen Sie abhängig von der Intensität der Interaktion der Proteine untersucht (siehe Formeln unten).
	<ol><li>Ist eine starke Protein-Protein-Interaktion, wählen Sie den regelmäßigen RIPA Puffer.</li>
		<li>Wenn die Interaktion schwach ist, wählen Sie entweder milde RIPA oder milder RIPA. 
		Hinweis: Die Rezepte dieser Puffer sind in den folgenden Schritten. Alle Puffer, die Immunopräzipitation Tests verwendet werden sollte mit Protease-Inhibitoren ergänzt werden.
		<ol><li>Bereiten regelmäßige RIPA-Puffer mit 1 % NP-40, 150 mM NaCl, 0,5 % Natrium Deoxycholate und 0,1 % Sodium Dodecyl Sulfat in 50 mM Tris pH 8.</li>
			<li>Bereiten Sie milde RIPA-Puffer mit 1 % NP-40, 150 mM NaCl und 0,25 % Natrium-Deoxycholate in 50 mM Tris pH 7,5.</li>
			<li>Bereiten den milderen RIPA-Puffer mit 1 % Triton X-100, 137 mM NaCl, 1 % Glycerin und 1 mM Natrium Orthovanadate 50 mM Tris pH 7.4.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Nach der Wahl des geeigneten RIPA-Puffers, ergänzen den Puffer mit Protease-Inhibitoren (RIPA +). Dann lösen Sie die Zellen mit 3 x das Volumen der Zelle Pellet in RIPA +.</li>
	<li>Vortex die Suspension für 15 s. lassen Sie ihn auf Eis für 5 min. Wirbel und Puderzucker 5 Mal wiederholen und Zentrifugieren Sie die Proben bei 16.000 x g für 15 min bei 4 ° c</li>
	<li>Übertragen den Überstand auf eine saubere Microcentrifuge Schlauch und Zentrifuge, Überrest Zelle Ablagerungen zu entfernen. Überstand in ein sauberes Röhrchen zu übertragen.</li>
	<li>Das Protein Lysates 01:50 verdünnen und bereiten eine 96-Well-Platte mit Blank und Normen. Die Proben zu verdünnen.
	<ol><li>Mix Proben mit Bradford Lösung 01:20. 15 Minuten im Dunkeln inkubieren.</li>
		<li>Messung die optische Dichte bei 595 nm Wellenlänge. Berechnen Sie die Konzentration des Proteins über Absorption Werte für jede Probe.</li>
	</ol></li> <li>Am Tag vor der Ernte der Zellen paar Protein A Plus Perlen mit Antikörpern, die spezifisch an das Protein des Interesses sind.
	<ol><li>Die Schnittkante ein 200 µL-Tip mit einer Schere und 25 µL aus der Perle Gülle für jede Bedingung verwenden.</li>
		<li>Waschen die Perlen einmal mit 1 mL PBS, einmal mit 1 mL RIPA Puffer und einmal mit 1 mL RIPA +. Führen Sie die Wäsche bei 3.300 x g, 4 ° C für 1 min.</li>
		<li>Nach der letzten Wäsche 300 µL RIPA + auf die Perlen hinzufügen und fügen Sie 1,5 µg-Antikörper, der spezifisch an das Protein abgerissen werden.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Röhrchen über Nacht bei 4 ° C auf ein Rotator (20 Umdrehungen/min). 
		Hinweis: Hier ATG5 war Immunoprecipitated mit speziellen Anti-ATG5 Antikörpern.</li>
	</ol></li> <li>Nach der Übernachtung Inkubation von Perlen mit dem Antikörper, die Perlen einmal mit PBS, einmal mit RIPA und einmal mit RIPA + waschen wie im Schritt 2.12.2 beschrieben.</li>
	<li>Add 2 mg Protein lysate auf die Perlen für jede Bedingung und füllen Sie das Gesamtvolumen auf 300 µL mit RIPA + Puffer/Schlauch. Inkubieren Sie die Röhrchen über Nacht auf ein Rotator bei 4 ° c</li>
	<li>Nach der Inkubation, waschen Sie die Perlen wie oben beschrieben (Schritt 2.12.2).
	<ol><li>Nach dem letzten Waschen, verwenden Sie eine kleinere Pipettieren Spitze, um den Überstand zu entfernen, ohne Sie zu berühren die Perlen.</li>
		<li>Fügen Sie 10 µL 3 x laden Farbstoff: 6 % SDS, 30 % Glycerin, 16 % β-Mercaptoethanol und 0,1 % Bromophenol Blue 1M Tris-HCl pH 6,8.</li>
	</ol></li> <li>Bereiten die Eingabesteuerelemente mit mindestens 100 µg Protein lysate für jede Bedingung. Ausgleich der Probenvolumina mit Wasser und fügen Sie das entsprechende Volumen der 3 x laden Farbstoff.</li>
	<li>Kochen Proben bei 95 ° C für 10 min. 
	Hinweis: In der Regel bei die Proben zu kochen, die Kappen der Rohre können sich öffnen, spontan und Proben sind verloren. Vermeiden, indem Sie die Kappen mit einem bestimmten GAP-Blocker geschlossen halten.</li>
	<li>Spin die Proben und die Ladung auf SDS-PAGE Gelen, die Proteine entsprechend ihrer Größe mit standard-Protokolle zu trennen. 
	Hinweis: In dieser Studie über RACK1 und ATG5, wurden Proben durch 12 % Polyacrylamid-Gele bei 80 V für 30 min, und dann bei 120 V für ca. 90 min laufen. Jedoch für kleinere Proteine wie LC3, besser geeignet ist mit 15 % Polyacrylamid-Gele.</li>
	<li>Nach Abschluss der Gel ausgeführt, die Proteine auf Nitrozellulose oder PVDF-Membranen mit entweder nass oder halbtrocken Transfermethoden übertragen. Dann blockieren die Membranen durch Inkubation in 5 % fettfreie Milch in PBS mit 0,05 % Tween 20 (PBST) bei Raumtemperatur 1 Stunde waschen Membranen 3 Mal mit PBST für 5 min.</li>
	<li>Inkubieren der Membranen mit primären Antikörper bei Arbeiten Konzentrationen für 1 h bei Raumtemperatur. Für Primärantikörper Verdünnungen verwenden BSA mit roten Lösungen (5 % BSA Cohn V Bruchteil, 0,02 % Natriumazid in PBST, pH 7,5; Phenol rot hinzugefügt als pH Marker hinzufügen) ermöglicht die Wiederverwendung von Antikörpern. 
	Hinweis: zum Beispiel verdünnen Sie ATG5 Antikörper 2.000 x in die rote Lösung.
	<ol><li>Am Ende der Inkubationszeit, waschen die Membranen 3 Mal mit PBST.</li>
	</ol></li> <li>Brüten die Membranen mit HRP-konjugierten Sekundärantikörper in 5 % fettfreie Milchlösung hergestellt wurden (hier Anti-Kaninchen IgG bei 1:10.000 eingesetzt wurde). Dann waschen Sie die Membranen 3 X mit PBST für 5 min.</li>
	<li>Machen die ECL-Lösung: 25 mM Luminol, Cumarsäure Säure 9 mM, 3 x 10 -4 % H 2 O 2 70 mM Tris-HCl pH 8,8. Verwenden Sie frische H 2 O 2 für jedes Experiment. 
	Hinweis: Die Reaktion beginnt nach H 2 O 2-Zufuhr und es dauert ca. 20 min.
	<ol><li>Brüten die Membranen und x-ray Filme für 20 min in ECL. Entwickeln und befestigen Sie sie in einem dunklen Raum.</li>
	</ol></li> <li>Um die co-Immunopräzipitation von Proteinen mit schließen oder sich überschneidende Molekulargewichte zu überprüfen, ist es möglicherweise erforderlich, die Antikörper aus den Membranen Streifen durch Inkubation der Membranen bei 60 ° C für 30 min in den abstreifenden Puffer: (25 mM Tris-HCl pH 2 und 1 % SDS).</li>
	Wiederholen Sie die Schritte 2,20 bis 2.23 <li>für co-Immunopräzipitation mit verschiedenen Antikörpern zu überprüfen. Zum Beispiel wurde folgende ATG5 Erkennung und Abisolieren der Membranen, RACK1 Protein auf den gleichen Membranen mit einem Anti-RACK1 Primärantikörper (1:1 000) und sekundäre Antikörper (01:10, 000) getestet. Β-Aktin diente als das Steuerelement laden; und IgG Signal diente als das Steuerelement laden für Immunoprecipitated Proben.</li>
</ol>

<ol><li>Oral, O., Akkoc, Y., Bayraktar, O., Gozuacik, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+and+pathological+significance+of+the+molecular+cross-talk+between+autophagy+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Histol+Histopathol%22%5BJournal%5D)">Physiological and pathological significance of the molecular cross-talk between autophagy and apoptosis.</a> Histol Histopathol. 31, 479-498 (2016).</li>
<li>Korkmaz, G., Tekirdag, K. A., Ozturk, D. G., Kosar, A., Sezerman, O. U., Gozuacik, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MIR376A+is+a+regulator+of+starvation-induced+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">MIR376A is a regulator of starvation-induced autophagy.</a> PLoS One. 8, e82556(2013).</li>
<li>Itah, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrodynamic+cavitation+kills+prostate+cells+and+ablates+benign+prostatic+hyperplasia+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Biol+Med+%28Maywood%29%22%5BJournal%5D)">Hydrodynamic cavitation kills prostate cells and ablates benign prostatic hyperplasia tissue.</a> Exp Biol Med (Maywood). 238, 1242-1250 (2013).</li>
<li>Gozuacik, D., Kimchi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+as+a+cell+death+and+tumor+suppressor+mechanism%29%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Autophagy as a cell death and tumor suppressor mechanism).</a> Oncogene. 23, 2891-2906 (2004).</li>
<li>Erzurumlu, Y., Kose, F. A., Gozen, O., Gozuacik, D., Toth, E. A., Ballar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unique+IBMPFD-related+P97%2FVCP+mutation+with+differential+binding+pattern+and+subcellular+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A unique IBMPFD-related P97/VCP mutation with differential binding pattern and subcellular localization.</a> Int J Biochem Cell Biol. 45, 773-782 (2013).</li>
<li>Kuzuoglu-Ozturk, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy-related+gene%2C+TdAtg8%2C+in+wild+emmer+wheat+plays+a+role+in+drought+and+osmotic+stress+response%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Autophagy-related gene, TdAtg8, in wild emmer wheat plays a role in drought and osmotic stress response.</a> Planta. 236, 1081-1092 (2012).</li>
<li>Longatti, A., Tooze, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicular+trafficking+and+autophagosome+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Vesicular trafficking and autophagosome formation.</a> Cell Death Differ. 16, 956-965 (2009).</li>
<li>Erbil, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RACK1+Is+an+Interaction+Partner+of+ATG5+and+a+Novel+Regulator+of+Autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">RACK1 Is an Interaction Partner of ATG5 and a Novel Regulator of Autophagy.</a> J Biol Chem. 291, 16753-16765 (2016).</li>
<li>Gozuacik, D., Yagci-Acar, H. F., Akkoc, Y., Kosar, A., Dogan-Ekici, A. I., Ekici, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anticancer+use+of+nanoparticles+as+nucleic+acid+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Anticancer use of nanoparticles as nucleic acid carriers.</a> J Biomed Nanotechnol. 10, 1751-1783 (2014).</li>
<li>Phizicky, E. M., Fields, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-protein+interactions%3A+methods+for+detection+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Protein-protein interactions: methods for detection and analysis.</a> Microbiol Rev. 59, 94-123 (1995).</li>
<li>Uetz, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+analysis+of+protein-protein+interactions+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A comprehensive analysis of protein-protein interactions in Saccharomyces cerevisiae.</a> Nature. 403, 623-627 (2000).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

Immunopräzipitation und Immunfluoreszenz-Techniken sind entscheidend für die Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen. Obwohl diese beiden Techniken weit verbreitet sind und gut etablierte, mehrere Kriterien berücksichtigt werden, die Qualität der Experimente zu definieren, bei der Verwendung dieser Techniken.
Erste, primäre Antikörper, die in diesen Tests verwendet werden sollte für die interessierenden Proteine spezifisch sein. Um dies zu gewährleisten, verwenden Sie ShRNA Niedersch...

Macroautophagy (Autophagie, hierin) ist ein zellulären Stress-Mechanismus, der durch die Sequestrierung von Schüttgut Zytoplasma, Proteinen und Organellen in Doppelmembran Vesikel genannt selbstverdauende Vesikel auszeichnet. Durch Verschmelzung der äußeren Schicht der doppelten Membran selbstverdauende Vesikel und ihre Ladung an Lysosomen geliefert und darin1abgebaut. Autophagie tritt auf einem niedrigen basalen Niveau in allen Zelltypen und in allen Organismen, homöostatischen Funktionen wie Protein Degradation und Organelle (z.B. Mitochondrien) Umsatz. Unter Bedingungen, die auf zellulären Stress, wie Hunger Autophagie ist schnell hochreguliert und ermöglicht es die Zelle, Energie und Grundumsatz1,2,3zu erhalten.
Rund 30 Autophagie Gene haben von der Hefe geklont worden und ihre Protein-Produkte wurden gezeigt, um eine Rolle in verschiedenen Stadien des selbstverdauende Prozesses, einschließlich der Vesikel Keimbildung, Ausbau, Vesikel Fusion zu späten Endosom/Lysosomen und Fracht Abbau 4 , 5. Orthologe der Mehrheit dieser Gene wurden identifiziert und Studien in verschiedenen Organismen bestätigt Erhalt der ihre Zellfunktionen6. Studien in den letzten zehn Jahren hat gezeigt, dass mehrere Autophagie-bezogene Proteinkomplexe und Protein-Protein-Wechselwirkungen vorhanden sind und dass sie Autophagie Wege in eine komplizierte und kontrolliert zu bestimmen. Kreuzungen, Sicherungen, Feedback und Feedforward-Mechanismen existieren, und sie ermöglichen der Zelle Autophagie mit anderen Ereignissen (z. B. vesikuläre Sekretion, Lysosomen Biogenese, Endosomal Sortierung und Transport7, etc.) zu koordinieren In eine unvoreingenommene Hefe-zwei-Hybrid-Bildschirm mit der Autophagie Protein ATG5 als Köder (ATG5 ist ein wichtiger Autophagie Protein beteiligt das E2-artigen conjugating System, das LC3 Lipidation verhungern vermittelt induzierte Autophagie), wir haben ausgemacht, Rezeptor aktiviert C-Kinase 1 (RACK1; GNB2L1) als eine starke Interaktor und eine neuartige Autophagie Komponente8. Wichtig ist, zeigte der Bildschirm, dass die ATG5-RACK1 Interaktion unverzichtbar für Autophagie Induktion durch klassische Autophagie Induktoren (d.h., Hunger und mTOR-Inhibition).
Immunfluoreszenz-basierte Methoden werden häufig verwendet, um Protein-Protein-Wechselwirkungen zu überwachen. Diese Techniken basieren hauptsächlich auf Antikörper und helfen, zu visualisieren Interaktionen und zelluläre Lokalisierungen zu bestätigen. Bei dieser Technik markieren fluoreszierende konjugierten Antikörper, die speziell für interessierender Proteine werden im Allgemeinen verwendet für spezifische Färbung. Jedes Protein kann mit Antikörpern gekoppelt mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen markiert werden. Mit Protein-spezifischen Antikörpern, zeigt eine Überlappung des Signals beim Zusammenführen von Bildern die Co Lokalisierung der Proteine unter konfokalen Mikroskopie. Das Verfahren ist anwendbar auf Zellen oder sogar Gewebe. Immunfluoreszenz-Techniken Aufschlüsse über Interaktion Dynamik und helfen, die Größe und Verteilung der Proteinkomplexe, während allgemeine Veränderungen im zellulären Morphologie unter verschiedenen Bedingungen9tracking zu identifizieren. Immunopräzipitation ist eine weitere häufig verwendete Antikörper-basierte Technik, die ermöglicht eine Analyse der Wechselwirkungen zwischen Proteinen10gegeben. Mit dieser Technik interessierender Proteine sind isoliert von Zellen oder Gewebe extrahiert mit spezifischen Antikörpern, wodurch die Fällung von Proteinen, die in einer Anlage oder in Kontakt mit einem Protein des Interesses sind. Co-Immunopräzipitation, wo das Protein und seine Co Interaktor erkannt werden, zeigt nicht nur die Interaktion zwischen den beiden Proteinen, aber seine Stärke der Interaktion unter verschiedenen Umständen11messen kann.
Dieses Protokoll beschreibt im Detail wichtige Techniken, die verwendet wurden, um zu bestätigen und ATG5-RACK1 und RACK1 LC3 Interaktion zu charakterisieren. Der Schwerpunkt liegt auf Immunfluoreszenz und Immunopräzipitation Techniken, mit Betonung der kritischen Schritte und Fallstricke für Autophagie Forschung, sowie die Vorschläge zur Fehlerbehebung.

<table><tbody><tr><td>Trypsin EDTA Lösung A</td><td>Biologische Industrie&nbsp;</td><td>BI03-050-1A</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>GE Gesundheitswesen</td><td>SH-30256.01</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (hoher Glukose)</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>5671</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (low glucose)</td><td>Sigma</td><td>5546</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Hämozytometer</td><td>Sigma</td><td>Z359629-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Deckfolien</td><td>Jena Bioscience</td><td>CSL-103</td><td></td></tr><tr><td>Objektträger</td><td>Isolab</td><td>I.075.02.005</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysin</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>Torin</td><td>Tocris</td><td>4247</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>VWRSAD2650</td><td></td></tr><tr><td>EBSS</td><td>Biological Industries&nbsp;</td><td>BI02-010-1A</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (PFA)</td><td>Sigma</td><td>15812-7</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>&nbsp; A4503</td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Sigma</td><td>84510</td><td></td></tr><tr><td>LC3 Antikörper</td><td>Sigma</td><td>L7543</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Kaninchen IgG Alexa Fluor 568</td><td>&nbsp; Invitrogen</td><td>A11011</td><td></td></tr><tr><td>RACK1 Antikörper</td><td>Santa Cruz Biotechnologie</td><td>&nbsp; sc-17754</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus IgG Alexa Fluor 488</td><td>&nbsp; Invitrogen</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Applichem</td><td>A16694.0250</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Applichem</td><td>A9242.5000</td><td></td></tr><tr><td>Sodium deoxycholate</td><td>Sigma</td><td>30970</td><td></td></tr><tr><td>Sodium dodecyl sulfat (SDS)</td><td>Biochemika</td><td>A2572</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X&nbsp;</td><td>Applichem</td><td>4975</td><td></td></tr><tr><td>Natriumorthovanadat</td><td>Sigma</td><td>450243</td><td></td></tr><tr><td>ATG5 Antikörper</td><td>Sigma</td><td>A0856</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Applichem</td><td>A4453</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Mercaptoethanol&nbsp;</td><td>Applichem</td><td>A1108.0250</td><td></td></tr><tr><td>Bromphenolblau&nbsp;</td><td>Applichem</td><td>A3640.0005</td><td></td></tr><tr><td>Fettfreie Milch</td><td>Applichem</td><td>A0830</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P5927</td><td></td></tr><tr><td>Natriumazid</td><td>Riedel de Haen</td><td>13412</td><td></td></tr><tr><td>Phenol rot&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>114537-5G</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Kaninchen-IgG, HRP-konjugiertes</td><td>Jackson Immuno.</td><td></td><td></td>1110305144</tr><tr><td>Luminol</td>, <td>Fluka</td><td>9253</td><td></td></tr>, <tr><td>Cuniersäure</td>, <td>Sigma</td><td>C9008</td><td></td></tr>, <tr><td>Wasserstoffperoxid</td>, <td>Merck</td><td>K35522500604</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus-IgG, HRP, konjugiertes</td><td>Jackson Immuno.</td><td>115035003</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Aktin-Antikörper</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>A5441</td><td></td></tr><tr><td>Normales Kaninchenserum</td><td>Santa Cruz Biotechnologie</td><td>sc-2027</td><td></td></tr><tr><td>Rapamycin</td><td>Sigma</td><td>&nbsp; R0395</td><td></td></tr><tr><td>Protein A-Agarose-Kügelchen</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2001</td><td></td></tr><tr><td>fötales Rinderserum</td><td>Biowest</td><td>S1810-500</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin-Lösung</td><td>Biological Industries&nbsp;</td><td>03-031-1B</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin&nbsp;</td><td>Biologische Industrien&nbsp;</td><td>BI03-020-1B</td><td></td></tr><tr><td>Bradford Solution</td><td>Sigma</td><td>6916</td><td></td></tr><tr><td>Nitocellulosemembran</td><td>GE Healthcare</td><td>A10083108</td><td></td></tr><tr><td>Röntgenfilme</td><td>Fujifilm</td><td>47410 19289</td><td></td></tr><tr><td>Proteaseinhibitor</td><td>Sigma</td><td>P8340</td><td></td></tr></tbody></table>

untersuchung von protein-protein-interaktionen in der autophagie-forschung

Study of Protein-protein Interactions in Autophagy Research

Protein-Protein-Interaktionen sind wichtig für Verständnis zellulärer Signalisierung Kaskaden und Identifizierung neuer Weg Komponenten und Proteindynamik. Die Mehrheit der zellulären Aktivitäten erfordern physikalische Wechselwirkungen zwischen Proteinen. Um zu analysieren und ordnen Sie diese Interaktionen, wurden verschiedene experimentelle Techniken sowie Bioinformatik-Werkzeuge entwickelt. Autophagie ist ein Handy recycling-Mechanismus, der die Zellen mit verschiedenen Stressoren, wie Nährstoff Entbehrung, Chemikalien und Hypoxie zu bewältigen. Um besser zu verstehen, Signalisierung Autophagie-Veranstaltungen und neuartige Faktoren zu entdecken, die Proteinkomplexe Autophagie regulieren, führten wir durch Protein-Protein Interaktion Bildschirme. Überprüfung dieser Screening-Ergebnisse erfordert den Einsatz von Immunfluoreszenz und Immunopräzipitation Techniken. In diesem System wurden spezifische Autophagie-related Protein-Protein-Interaktionen, die wir entdeckt in Neuro2A getestet (N2A) und HEK293T-Zell-Linien. Details der verwendeten technischen Verfahren werden in diesem Papier visualisiertes Experiment erklärt.

In Abbildung 1 ein Beispiel für eine Co Lokalisierung ist Ergebnis unter Verwendung dieses Protokolls dargestellt. Eine Figur aus unserem jüngsten Papier wird8vorgestellt. Hier war endogenen RACK1 Protein in grün gefärbt, während endogene LC3 rot gefärbt war. Die gelben Punkte, die in den fusionierten Bildern beobachtet werden zeigen Websites der Überlappung zwischen den grünen und roten Signalen. Die gelben Punkte stellen somit die teilweise Co Lokalisierung dieser b...

Präsentiert hier sind zwei Antikörper-basierten Proteinprotein Interaktion Forschungstechniken: Immunfluoreszenz und Immunopräzipitation. Diese Techniken eignen sich für das Studium der physikalischer Wechselwirkungen zwischen Proteinen für die Entdeckung der neuartige Komponenten der zelluläre Signalwege und Proteindynamik Verständnis.

Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen in der Autophagie-Forschung

Protein-protein interactions are important for understanding cellular signaling cascades and identifying novel pathway components and protein dynamics. ...

Mein Name ist Devrim Gozuacik. Wir arbeiten an der Sabanci-Universität in Istanbul, Türkei, an der Regulation der Autophagie bei Säugetieren. Unser Fokus liegt auf verschiedenen Proteinen, Signalwegen und RNA-Molekülen, die die Autophagie regulieren.Es gibt mehrere Methoden, um die Autophagie zu untersuchen. Wir verwenden Techniken aus der Molekularbiologie, Biochemie und Zellbiologie, um verschiedene von uns entdeckte Signalwege zu analysieren. Zur Untersuchung der Autophagie-Wege setzen wir Immunpräzipitation, Immunfluoreszenzmethoden, konfokale Mikroskopie und verschiedene andere Techniken ein.Die Details verschiedener Techniken sowie mögliche Fallstricke und die Fehlerbehebung werden von meiner Doktorandin Secil Erbil erläutert. Das übergeordnete Ziel von Immunfluoreszenz- und Immunkomplexpräzipitationsverfahren besteht darin, endogene Protein-Protein-Interaktionen in einer Zelle zu untersuchen. Diese Methode kann dabei helfen, zentrale Fragen zu Protein-Protein-Interaktionen und deren zellulärer Lokalisation zu beantworten.Der Hauptvorteil dieser Techniken liegt in der Möglichkeit, die Interaktionsintensität während bestimmter Behandlungen und Bedingungen im Vergleich zur Kontrolle zu quantifizieren. Zunächst lösen Sie die Zellen mit Trypsin ab. Anschließend zählen Sie die Zellen mithilfe eines Hämozytometers und berechnen die Zellkonzentration. Nehmen Sie gepackte und autoklavierte Deckgläser und legen Sie sie in eine 10 cm große Petrischale. Wenn Sie mit einer Zelllinie arbeiten, die sich leicht ablöst, wie in diesem Experiment HEK293T, beschichten Sie die Deckgläser mit einer sterilfiltrierten 0,01 %igen Poly-L-Lysin-Lösung. Nach einer 10-minütigen Inkubation entfernen Sie die Lösung.Warten Sie, bis das gesamte Poly-L-Lysin verdunstet ist und die Deckgläser vollständig trocken sind. Anschließend spülen Sie sie mit steriler PBS-Lösung. Geben Sie ein Milliliter Medium in eine 12-Loch-Platte und legen Sie die Deckgläser in jedes Loch. Säen Sie 20.000 Zellen pro Vertiefung aus. Es ist wichtig, die Platte während und nach der Inokulation zu schütteln, um eine homogene Verteilung der Zellen auf den Deckgläsern zu gewährleisten. Behandeln Sie Ihre Zellen mit dem gewünschten Wirkstoff und dessen Kontrolle so, dass die gesamte Inkubationszeit der Zellen 48 Stunden nicht überschreitet.Nach Ablauf von 48 Stunden entfernen Sie das Medium auf den Deckgläsern und waschen die Zellen einmal mit PBS. Anschließend entfernen Sie unter einem Abzugshaube das PBS und fixieren die Zellen, indem Sie sie 20 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 4 % PFA inkubieren. Da PFA lichtempfindlich ist, decken Sie die Platte während der Inkubationszeit mit Aluminiumfolie ab.Entfernen Sie anschließend die PFA und waschen Sie die Proben dreimal mit PBS. In diesem Schritt ist es wichtig, die Proben einzeln zu waschen, um sie nicht austrocknen zu lassen. Beschriften Sie dann eine sechswellige Platte entsprechend Ihren Behandlungsbedingungen und decken Sie jede Vertiefung mit Parafilm ab.In diesem Schritt darauf achten, dass nach dem Abdecken mit Parafilm eine glatte Unterseite vorliegt. Anschließend die Deckgläser in eine 6-Loch-Platte geben, je 100 Mikroliter der BSA-Saponin-Mischung auf jedes Deckglas pipettieren und 30 Minuten auf Eis zur Blockierung inkubieren. Danach die Blockierungslösung entfernen und die Proben einmal mit PBS waschen.Ein primärer Antikörper in der BSA-Saponin-Mischung herstellen und 100 Mikroliter dieser Lösung auf jede Deckkammer auftragen. Eine Stunde bei Raumtemperatur inkubieren. Während der Inkubation ist es besser, die Platte zu schütteln, um eine gleichmäßige Verteilung des Antikörpers auf den Deckkammern zu gewährleisten.Entfernen Sie dann den Primärantikörper und waschen Sie die Proben dreimal mit PBS. Bereiten Sie einen 1:500 verdünnten Alexa Fluor Sekundärantikörper in BSA-Saponin-Mischung vor und geben Sie 100 Mikroliter dieser Lösung auf jeden Deckglasausschnitt. Da Alexa Fluor lichtempfindlich ist, ist es wichtig, die Proben ab diesem Schritt im Dunkeln aufzubewahren.Daher die Sechs-Loch-Platte mit Aluminiumfolie abdecken und eine Stunde bei Raumtemperatur auf dem Rüttler inkubieren. Anschließend den Sekundärantikörper entfernen und die Proben dreimal mit PBS waschen. Die Objektträger mit Ihren Behandlungsbezeichnungen beschriften und sie mit Ethanol unter Verwendung von Kimwipes reinigen.Tragen Sie dann 10 Mikroliter Eindecklösung in die Mitte jedes Objektträgers auf. Mit einer Pinzette wird jede Deckglasplatte auf die Objektträger gelegt. Anschließend wird die überschüssige Menge an Eindecklösung vorsichtig mit Kimwipe entfernt.Zunächst jede Deckplatte mit vier Tropfen Nagellack stabilisieren. Anschließend die Deckplatte vollständig versiegeln. Die Probe mit einem konfokalen Mikroskop analysieren.Hier sehen Sie ein Beispiel für ein mit diesem Protokoll erhaltenes Ergebnis zur Kolokalisation, das aus unserer kürzlichen Publikation stammt. In diesem Video wurde das endogene RACK1-Protein grün und das endogene LC3 rot angefärbt. Die gelben Punkte, die in den Merge-Bildern erscheinen, zeigen die Stellen an, an denen sich grüne und rote Signale überlappen.Mit anderen Worten stellen gelbe Punkte die Kolokalisation dieser beiden Proteine dar. Die Immunpräzipitation ist eine weitere häufig verwendete Methode zur Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen. Beginnen Sie damit, vier Millionen HEK293T-Zellen pro Bedingung in 15-Zentimeter-Petri-Schalen auszusäen.Behandeln Sie die Zellen mit den gewünschten Wirkstoffen, sodass die gesamte Inkubationszeit der Zellen 48 Stunden nicht überschreitet. Nach 48-stündiger Inkubation sammeln Sie die Zellen mit eiskalter PBS-Pufferlösung. HEK293T-Zellen lösen sich leicht vom Kulturgefäß. Daher ist das Waschen der Platte mit PBS mittels Pipettieren ausreichend, um alle Zellen zu lösen und zu gewinnen. Sammeln Sie Ihre Zellen in Eppendorf-Röhrchen und zentrifugieren Sie diese 15 Minuten bei maximaler Drehzahl bei vier Grad. Entsorgen Sie danach das Überstandsvolumen und waschen Sie das Zellpellet mit einem Milliliter PBS, indem Sie es durch Pipettieren resuspendieren.Dann erneut zentrifugieren und den Überstand verwerfen. Danach das Zellpellet in RIPA-Puffer mit Proteaseinhibitoren resuspendieren. Die Suspension 15 Sekunden lang verwirbeln und das Eppendorf-Röhrchen fünf Minuten lang auf Eis stellen.Wiederholen Sie das Vortexen fünfmal im Abstand von jeweils fünf Minuten. Anschließend zentrifugieren Sie die Probe 15 Minuten lang mit der höchsten Drehzahl bei vier Grad. Danach nehmen Sie den Überstand und zentrifugieren erneut, um die Zelltrümmer vollständig zu entfernen.Verdünnen Sie die Proteinlysate im Verhältnis 1 zu 50 und bereiten Sie eine 96-Well-Platte mit der Blindprobe, den Standards und den verdünnten Proben vor. Mischen Sie diese im Verhältnis 1 zu 20 mit der Bradford-Lösung, lassen Sie 15 Minuten im Dunkeln stehen und messen Sie die optische Dichte bei 595 Millimeter. Berechnen Sie die Protein-Konzentration anhand der Extinktionswerte jeder Probe. Bereiten Sie anschließend die Kügelchen zur Antikörper-Kopplung vor.Schneiden Sie die Kante einer 200-Mikroliter-Pipettenspitze mit einer Schere ab und entnehmen Sie für jede Bedingung 25 Mikroliter der Perlen-Suspension. Waschen Sie die Perlen einmal mit PBS, einmal mit RIPA-Puffer und einmal mit RIPA-Puffer, der Proteaseinhibitoren enthält. Nach dem letzten Waschschritt resuspendieren Sie die Perlen in 300 Mikrolitern RIPA-Puffer mit Proteaseinhibitoren und geben 1,5 Mikrogramm Antikörper hinzu, der spezifisch für das Protein ist, das Sie anreichern möchten.Die Antikörper-Beads-Mischung über Nacht bei vier Grad auf dem Rotator inkubieren. Nach der Inkubation die Beads mit RIPA-Puffer, der Proteaseinhibitoren enthält, waschen und zwei Milligramm Gesamtzelllysat aus jeder Bedingung aufnehmen. Das Gesamtvolumen mit RIPA-Puffer, der Proteaseinhibitoren enthält, auf 300 Mikroliter auffüllen und die Probe über Nacht bei vier Grad auf dem Rotator inkubieren.Anschließend die Kügelchen dreimal mit RIPA-Puffer, der Proteaseinhibitoren enthält, waschen. Nach der letzten Wäsche versuchen, unter Verwendung einer kleineren Pipette, sämtliches Überstand entfernen, ohne die Kügelchen zu berühren. Danach 10 Mikroliter 3X-Ladefarbstoff hinzufügen.Zur Kontrolle der endogenen Expression von Proteinen, die im Co-Immunpräzipitationsexperiment überprüft werden, bereiten Sie Input-Proben unter Verwendung von mindestens 100 Mikrogramm Protein-Lysat vor. Geben Sie das entsprechende Volumen an 3X-Ladepuffer zu jeder Probe hinzu. Um die IP- und Input-Kontrollproben zu denaturieren, erhitzten Sie diese 10 Minuten bei 95 Grad.Dann die Proben abzentrifugieren und auf ein SDS-Gel laden, um die Proteine entsprechend ihrer Größe mittels Western Blot zu trennen. Die Proteinstichproben durch ein SDS-Gel laufen lassen und anschließend die Proteine auf Nitrocellulose-Membranen übertragen. Nach Abschluss des nassen Transfers die Nitrocellulose-Membran blockieren, indem sie eine Stunde bei Raumtemperatur auf dem Schüttler mit einer 5 %igen Magermilchlösung inkubiert wird.Anschließend die Membran dreimal mit PBS-Torin-Lösung jeweils fünf Minuten auf dem Schüttler bei Raumtemperatur waschen. Die Membran mit dem primären Antikörper, der spezifisch für das nachzuweisende Protein ist, eine Stunde bei Raumtemperatur inkubieren. Es kann vorteilhaft sein, die primären Antikörper in roter Lösung vorzubereiten, um sie wiederverwenden zu können, ohne dass ihre Qualität nachlässt.Nach der Inkubation mit dem primären Antikörper die PBS-Torin-Waschschritte dreimal wiederholen. Anschließend die mit HRP konjugierte sekundäre Antikörperlösung in 5 % fettfreier Milch herstellen und die Membran eine Stunde bei Raumtemperatur auf dem Schüttler damit inkubieren. Nach der Inkubation die Waschschritte erneut wiederholen.Dann bereiten Sie eine selbst hergestellte ECL-Lösung vor und geben die Membran in eine Kassette. Fahren Sie anschließend mit der Entwicklung Ihrer Fixierungsschritte gemäß der im Text beschriebenen vollständigen Abbildung fort. Nach der Fixierung und dem Trocknen der Folie markieren Sie entsprechend den Rändern der Membran und dem Proteinmarker, um das spezifische Band vorhersagen zu können.Wiederholen Sie alle diese Antikörper-Inkubationsschritte zusammen mit den Dunkelraumverfahren für alle Proteine, bei denen Sie eine Interaktion überprüfen möchten. Anschließend analysieren Sie die Ergebnisse. Hier sehen Sie ein Ergebnis einer endogenen Immunpräzipitation aus unserer jüngsten Veröffentlichung.In diesem Video wurde das endogene ATG5-Protein präzipitiert und die Stufen der endogenen RACK1-Ko-Immunpräzipitation unter verschiedenen Bedingungen überprüft. Bei der Durchführung dieser Verfahren ist es wichtig, so viele biologische Wiederholungen wie möglich durchzuführen und positive sowie negative Kontrollen einzubeziehen, um die quantifizierten Interaktionsniveaus nach unterschiedlichen Behandlungen erfassen zu können. Das Gesamtbild, das alle biologischen Wiederholungen liefern, wird als Interaktionsmuster unter verschiedenen Bedingungen definiert.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Dynamik von Protein-Protein-Wechselwirkungen untersucht.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Autophagie ist ein allgegenwärtiges Prozess, Zellen zu zersetzen und zu recyceln Proteine ​​und Organellen ermöglicht. Wir bieten fortschrittliche Fluoreszenzmikroskopie zu visualisieren und zu quantifizieren, die klein, aber wichtig, körperliche Veränderungen mit der Induktion von Autophagie verbunden sind, einschließlich der Bildung und Verteilung von Autophagosomen und Lysosomen, und deren Verschmelzung zu autolysosomes.

Quantitative Analyse von Autophagie mit Advanced 3D Fluoreszenzmikroskopie

Zeitraffer-Mikroskopie von fluoreszenzmarkierten Autophagie Marker erlaubt die Überwachung der dynamischen Autophagie Reaktion mit hoher zeitlicher Auflösung. Mit spezifischen Autophagie und Organellen Marker in einer Kombination aus 3 verschiedenen Farben, können wir folgen den Beitrag eines Proteins an Autophagosom Bildung in einem robusten räumlichen und zeitlichen Kontext.

Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

Wir haben ein Verfahren zur Reinigung von Koregulierung Wechselwirkung Proteine ​​etabliert unter Verwendung der LC-MS / MS-System.

Ein Protein Herstellungsverfahren für die Hochdurchsatz-Identifizierung von Proteinen Interagieren mit nuklearen Cofaktor LC-MS / MS-Analyse

Autophagy Aktivierung ist bei der Prävention von einer Reihe von Krankheiten nützlich. Eine der physiologischen Ansätze Autophagie in vivo zu induzieren körperliche Bewegung ist. Hier zeigen wir, wie die Autophagie von Aerobic-Übungen zu aktivieren und die Autophagie Ebenen bei Mäusen messen.

Die Aktivierung Autophagy von Aerobic-Übung bei Mäusen

Hier wurde die multispektrale bildgebende Durchflusszytometrie mit einem analytischen Merkmal, das helle Detailbilder von 3 Autophagie-Markern vergleicht und deren Co-Lokalisierung zusammen mit der LC3-Spotzählung quantifiziert, verwendet, um Autophagie objektiv, quantitativ und statistisch robust zu messen.

Assessing Autophagic Flux durch Messung von LC3, p62 und LAMP1 Co-Lokalisierung mittels Multispektral Imaging Flow Cytometry

Hier ist eine einfache und gut validierte Protokoll zur Messung der Masse selbstverdauende Sequestrierung Aktivität in Säugetierzellen beschrieben. Die Methode basiert auf der Quantifizierung des Anteils der Laktat-Dehydrogenase (LDH) im Sedimentable Zelle Fraktionen gegenüber dem gesamten zellulären LDH Niveau.

Laktat-Dehydrogenase Sequestrierung Assay – Eine einfache und zuverlässige Methode zur Bestimmung Bulk Selbstverdauende Sequestration Aktivität in Säugerzellen

Field-Effect Biosensing (FEB) ist eine markierungsfreie Technik zum Nachweis biomolekularer Wechselwirkungen. Es misst den elektrischen Strom durch den Graphen-Biosensor, an den die Bindungsziele immobilisiert werden. Die FEB-Technologie wurde verwendet, um biomolekulare Wechselwirkungen zwischen Hsp90 und Cdc37 zu bewerten und eine starke Wechselwirkung zwischen den beiden Proteinen wurde nachgewiesen.

Erforschung der biomolekularen Interaktion zwischen dem molekularen Chaperon Hsp90 und seiner Client-Proteinkinase Cdc37 unter Verwendung der Feldeffekt-Biosensortechnologie

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Induktion von Autophagie im Fettkörper der Drosophila melanogaster-Larve durch Nährstoffmangel und analysiert Veränderungen in der Autophagie anhand transgener Fliegenstämme.

Analyse der Hunger-induzierten Autophagie in der Drosophila melanogaster-Larve des Fettkörpers

Dieses Protokoll beschreibt verschiedene Methoden, die bei der Untersuchung der ATG9A-Biologie hilfreich sein können, einschließlich Immunfluoreszenz, gefolgt von Bildanalyse, Überexpressionsüberlegungen zu transienten und der Untersuchung des ATG9A-Glykosylierungsstatus mittels Western Blot.

Bildgebung von ATG9A, einem mehrspannigen Membranprotein

Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für die Verwendung eines Luciferase-basierten Reporter-Assays in einem halbautomatischen Hochdurchsatz-Screening-Format.

Zellbasiertes Wirkstoff-Screening auf Inhibitoren der Autophagie-verwandten 4B-Cystein-Peptidase

Hier stellen wir die Methodik zur prägnanten Bestimmung des Autophagosomenmarkers LC3-II-Spiegel in extrazellulären Vesikeln (EVs) durch Immunblotting vor. Die Analyse der LC3-II-Spiegel in EVs, der Autolysosomenbildung und der Omegasomenbildung deutet auf die neue Rolle von STX6 bei der Freisetzung von LC3-II-positiven EVs hin, wenn die Autophagosomen-Lysosomenfusion gehemmt wird.

Bewertung der LC3-II-Freisetzung über extrazelluläre Vesikel in Bezug auf die Akkumulation intrazellulärer LC3-positiver Vesikel

Lernen Sie Immunofluoreszenz und Immunopräzipitation zur Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen in der Autophagie-Forschung. Diese Methoden ermöglichen die Analyse endogener Proteindynamiken in Säugetierzellen.

Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen in der Autophagie-Forschung

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