Protokoll für HER2 Fischen mit nicht-Cross-linking, Formalin-freies Gewebe Fixiermittel, Vorteile der Kryokonservierung und Formalin Fixierung zu kombinieren

Die personalisierte Medizin erfordert die verschiedenen Arten der Analyse von der klassischen Histologie bis zur molekularen Analyse, und es werden verschiedene in-situ-Techniken an einem Tumor durchgeführt, um die beste Therapie auszuwählen. Die Untersuchungstechniken ermöglichen verschiedene analytische Technologien aus einer einzigen Probe. Wir zeigen hier, dass Sie durch die Verwendung eines nicht vernetzenden Fixiermittels im einfachen Formalin-Postfixierungsschritt Protokolle verwenden können, die ursprünglich für formales und fixiertes Paraffin-eingebettetes Material entwickelt und validiert wurden, das aus der Zellprobe verwendet werden kann, was zu einer guten Morphologie, einer guten RNA-Qualität und guten Ergebnissen für eine In-situ-Hybridisierung mit vollständigerem Sinn führt.

Die typischen Hybridisierungsbedingungen sind für formalinfreies fixiertes Gewebe nicht geeignet, um FISH-Ergebnisse zu erzielen. Wir zeigten, dass nicht die Penetration, sondern die chemische Korrekturzeit entscheidend ist, um vergleichbare FISH-Ergebnisse aus pektinfixiertem Gewebe zu erzielen. Nur der Abschnitt, der für FISH verwendet wird, ist formell und postfixiert.

Das verbleibende formalinfreie fixierte Gewebe ermöglicht eine überlegene molekulare Analyse im Vergleich zu FFP-Gewebe, wie die RTPCR zeigt. Das Verfahren, das wir von Daniela Pabst, der Technikerin aus meinem Labor, demonstriert haben. Schneiden Sie die Brustkrebs-Gewebeproben zunächst mit einem sterilen Skalpell in zwei Hälften von jeweils vier Millimetern Dicke, um eine ausreichende Gewebemenge zu gewährleisten.

Verwenden Sie eine maximale Größe von 4 x 15 x 15 Millimitern für die Fixierung durch gepufferte Standard-Formalinlösung oder durch alternative nicht vernetzende, formalinfreie Gewebefixierung. Legen Sie die Hälfte der Tumorprobe in eine Standard-Gewebekassette und tauchen Sie sie in SBFS. Legen Sie die andere Hälfte der Tumorprobe für 24 Stunden in die alternative Fixierlösung mit einem Volumen-pro-Volumen-Verhältnis von vier Teilen Fixiermittel und einem Teil Gewebe.

Übertragen Sie dann die alternativ fixierten Proben für zwei bis 72 Stunden in die Stabilisatorlösung, indem Sie den Behälter öffnen, die Gewebekassette um 180 Grad drehen und eintauchen. Legen Sie anschließend die Gewebekassetten mit den SBFS-fixierten Proben für 30 Minuten bei Raumtemperatur in einen mit 70 %igem Ethanol gefüllten Behälter, um SBFS-Reste zu entfernen. Nach der Gewebeverarbeitung und -einbettung, wie im Textprotokoll beschrieben, verwenden Sie ein Mikrotom, um drei Mikrometerabschnitte von FFPE- und NCFPE-Blöcken zu schneiden.

Lege etwas von jeder Art von Abschnitt in ein kaltes Wasserbad. Nehmen Sie die schwebende Sektion mit einem feinen Pinsel auf einen feinen Objektträger und geben Sie sie in ein warmes Wasserbad. Nehmen Sie die gedehnten Abschnitte wieder mit dem Pinsel auf den Objektträger auf, ohne dass es zu Falten kommt.

Bereiten Sie sich auch auf die RNA-Isolierung vor, um eine reverse Transkriptions-PCR an derselben Probe durchzuführen, indem Sie einige von jedem Schnitttyp in ein Reaktionsfläschchen geben. Zur Entparaffinisierung von Gewebeschnitten hydratisieren wir die Schnitte schrittweise bei Raumtemperatur in den Färbegläsern mit 250 Millilitern verschiedener Reagenzien. Legen Sie die Abschnitte zuerst zweimal für 15 Minuten in 100%Xylol, dann übertragen Sie die Abschnitte zweimal für 15 Minuten auf 96%Ethanol.

Bewegen Sie als Nächstes die Abschnitte durch schrittweise niedrigere Ethanolanteile und inkubieren Sie jede Lösung zwei Minuten lang. Zum Schluss werden die Abschnitte zweimal für 10 Minuten destilliert. Führen Sie eine Nachfixierung der NCFPE-Objektträger durch, indem Sie sie 24 Stunden lang bei Raumtemperatur in ein neues Färbeglas geben, das mit SBFS gefüllt ist.

Lassen Sie das Glas während des 24-Stunden-Schritts nach der Fixierung im Abzug. Überraschenderweise führten alle Nachfixierungszeiten von mehr als 18 Stunden zu ähnlichen Ergebnissen wie bei formalem und fixiertem Paraffinmaterial. Entfernen Sie den überschüssigen Lichtschutzfaktor von den Objektträgern, indem Sie sie dreimal 10 Minuten lang in phosphatgepufferter Kochsalzlösung waschen.

Anschließend die zweite Wäsche in destilliertem Wasser zweimal 10 Minuten lang durchführen. Stellen Sie anschließend das Färbeglas mit 250 Millilitern Hitzevorbehandlungslösung zitronig in ein 98 Grad Celsius heißes Wasserbad. Geben Sie das hydratisierte FFPE in nachträglich fixierte NCFPE-Objektträger in das Glas und inkubieren Sie es 15 Minuten lang.

Waschen Sie die Objektträger dann drei Minuten lang in destilliertem Wasser bei Raumtemperatur in einem neuen Färbeglas. Für die Proteolyse werden die Objektträger in eine temperaturkontrollierte Hybridisierung bei 37 Grad Celsius gebracht. Tragen Sie die gebrauchsfertige Pepsinlösung sofort tropfenweise auf die Gewebeschnitte auf, bis diese vollständig bedeckt sind.

Inkubieren Sie dann neun Minuten lang bei 37 Grad Celsius im Hybridisierungssystem. Geben Sie dann die Objektträger in ein Glas mit SSC-Waschpuffer und inkubieren Sie sie fünf Minuten lang. Legen Sie die Objektträger eine Minute lang bei Raumtemperatur in destilliertes Wasser.

Führen Sie die Dehydrierung der Schnitte in einer Reihe von abgestuften Alkoholen durch, jeweils eine Minute lang. Im Anschluss an die Trocknungsserie trocknen Sie die Abschnitte an der Luft. Für die Hybridisierung pipettieren Sie 10 Mikroliter der kombinierten HER2- und Sun 17-Sonde auf die getrockneten Gewebeschnitte, decken jede Probe mit einem Deckglas ab und versiegeln sie mit Gummizement.

Denaturieren Sie die Sonde und die DNA der Probe im Hybridisierungssystem 10 Minuten lang bei 75 Grad Celsius. Das Hybridisierungssystem sinkt automatisch auf 37 Grad Celsius ab, und die Hybridisierung läuft über Nacht. Am nächsten Tag entfernen Sie vorsichtig den Gummizement und die Deckgleiter sowie die Deckgleiter mit einer Pinzette zur Posthybridisierung und zum Schutz.

Inkubieren Sie die Größen fünf Minuten lang in einem Färbeglas mit 37 Grad Celsius vorgewärmtem 1X-Puffer A. Waschen Sie anschließend die Objektträger mit vorgewärmtem 1X-Waschpuffer zweimal fünf Minuten lang bei 27 Grad Celsius. Dehydrieren Sie dann die Objektträger in 70 %, 90 % und 100 % Ethanol alle eine Minute für jede Konzentration.

Trocknen Sie die Proben an der Luft und schützen Sie sie vor Licht. Tragen Sie zum Färben 30 Mikroliter DAPI-Lösung auf den hybridisierten Bereich auf, um Blasen zu vermeiden. Decken Sie die Abschnitte mit einem Deckglas ab, bevor Sie die Abschnitte 15 Minuten lang lichtgeschützt inkubieren.

Entfernen Sie vorsichtig überschüssige DAPI-Lösung, indem Sie den Objektträger vorsichtig zwischen das Filterpapier drücken. Lagern Sie die Objektträger bis zu zwei Wochen bis zur Auswertung durch konfokale Mikroskopie bei zwei Grad Celsius im Dunkeln. Erfassen Sie die Bilder mit Filtern für Grün- und Orangekanäle.

Fahren Sie mit der Dateninterpretation und der Bewertung der RNA-Qualität fort, wie im Textprotokoll beschrieben. Hier ist der direkte Vergleich des Ergebnisses aus der formalen und fixierten Probe und der nicht vernetzenden fixierten Probe, die nachfixiert wurde, dargestellt. Die Signale sind von ähnlicher Intensität, und auch der Hintergrund ist ähnlich.

In normalen Interphase-Zellen gibt es eine gleiche Anzahl von roten und grünen Signalen, die dem HER2-Locus und dem sen 17-Referenzlocus entsprechen, was zeigt, dass es keine Amplifikation am HER2-Gen gibt. Hier ist das Ergebnis eines anderen Falles, in dem das HER2-Gen amplifiziert ist und es ein viel stärkeres und breiteres Signal für den HER2-Locus gibt als für das Referenzgen. Dieses Phänomen zeigt sich im formalen und fixierten und im nicht vernetzenden fixierten Gewebe.

Diese Grafik zeigt die Amplifikationswirksamkeit für die verschiedenen Amplikonlängen der GAPDH-mRNA. Für Formalin sind etwa 23 Zyklen erforderlich, und für nicht vernetzendes festes Material verringert sich diese Zahl auf 20 Zyklen. Der Unterschied wird bei längeren Amplikons deutlicher, was darauf hindeutet, dass sowohl die Fragmentierung als auch die chemische Modifikation durch die Verwendung von nicht vernetzenden Fixiermitteln deutlich reduziert werden.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man einen von der FDA zugelassenen Schlüssel für FFPN-Material auf nicht vernetzendem fixiertem Material verwenden kann, indem man einen einfachen Schritt nach der Fixierung in das präanalytische Verfahren einfügt. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass nur der Abschnitt, der für die Full-Sense-In-situ-Hybridisierung verwendet wird, für die Postfixierung mit Formalin verwendet wird, während der verbleibende Block im unvernetzten Fixiermittel fixiert ist und daher für ein breites Spektrum der molekularen Analyse verwendet werden kann. Dieses Protokoll ist besonders nützlich im Kontext der modernen personalisierten Medizin, wenn mehrere Analysen von relativ kleinen Tumoren durchgeführt werden müssen und die Verarbeitung von Gewebeproben für verschiedene Protokolle nicht möglich ist.

Darüber hinaus hat die Verwendung eines nicht vernetzenden Fixiermittels den Vorteil, dass die Gewebeeigenschaften wie bei der Kryokonservierung erhalten bleiben. Dadurch wird das Einfrieren von flüssigem Stickstoff vermieden und die Aufrechterhaltung einer Kühlkette in einem chemischen Kontext vermieden. Diese Unterschiede in der RNA-Qualität sind nicht offensichtlich, so dass bei der Verwendung klassischer RNA-Qualitätskontrollassays, wie z. B. RNA-Integritätszahlen, da diese Assays in der RNA-Qualität, die aus fixiertem und paraffineingebettetem Material isoliert wurden, nicht vollständig aussagekräftig sind.