Zeitraffer-konfokale Bildgebung der Migration von Neuronen in der organotypischen Scheibe Kultur der embryonalen Maus Gehirn mit In Utero Elektroporation

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die direkte Beobachtung radial wandernder Neuronen in organotypischen Schnittkulturen, die aus elektroporierten embryonalen Gehirnen mittels konfokaler Zeitraffermikroskopie hergestellt wurden. Diese Methode kann helfen, Schlüsselaspekte der Entwicklung des Neokortex zu untersuchen. Es ermöglicht die Untersuchung der molekularen Mechanismen, die an der Polarisation von Neuronen und der radialen Wanderung von Neuronen zu ihrer endgültigen Position im Gehirn beteiligt sind.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die dynamischen Eigenschaften der migrierenden Neuronen analysiert werden können, einschließlich Geschwindigkeitsprofile, durchschnittliche Migrationsgeschwindigkeit sowie Änderungen der Migrationsrichtung. Beginnen Sie damit, eine ordnungsgemäß betäubte schwangere Maus in Rückenlage auf eine Warmhalteplatte zu legen. Überprüfen Sie, ob der Pedalreflex nicht vorhanden ist.

Bedecken Sie die Augen dann vorsichtig mit Vaseline, damit sie nicht austrocknen. Spreizen Sie anschließend vorsichtig die Gliedmaßen und fixieren Sie sie mit chirurgischem Klebeband auf der Warmhalteplatte. Sterilisieren Sie den Bauch, indem Sie einen Abstrich mit 70%igem Ethanol und anschließender Jodlösung machen, und legen Sie dann sterile Gaze, in die ein Schnitt für den Bauchschnitt gemacht wurde, über den Bauch.

Befeuchten Sie die Gaze mit bakteriostatischer Natriumchloridlösung. Nachdem Sie die Entwicklung der chirurgischen Anästhesie durch den Verlust des Pedalreflexes neu bewertet haben, verwenden Sie eine gezackte Mikro-Adson-Pinzette und eine abgewinkelte feine Schere, um die Haut etwa 1,5 Zentimeter entlang der Mittellinie des Bauches zu schneiden. Schneiden Sie dann den darunter liegenden Muskel entlang der Linea alba durch.

Fassen Sie das Gebärmutterhorn zwischen den Embryonen mit einer Ringzange und legen Sie es vorsichtig auf die angefeuchtete Gaze, ohne die Plazenta oder Versorgungsgefäße zu stören. Positionieren Sie dann einen Embryo vorsichtig, um einen klaren Blick auf den lateralen Ventrikel zu haben, der sich als halbmondförmiger Schatten parallel zum Sinus sagittal präsentiert. Die Injektionsstelle liegt in der Mitte einer Linie zwischen dem pigmentierten Auge und dem Zusammenfluss der Nasennebenhöhlen, wo sich die Sinus sagittal in zwei Transferhöhlen verzweigt.

Sobald dies identifiziert ist, schieben Sie die Mikroinjektionsnadel durch die Gebärmutterwand und in den Seitenventrikel. Verwenden Sie als Nächstes einen Mikroinjektor, der mit einem Fußpedal bedient wird, um ein bis zwei Mikroliter DNA-Lösung mit fünf bis 10 Impulsen zu injizieren. Die erfolgreiche Injektion kann durch die farbige DNA-Lösung überwacht werden, die das ventrikuläre System füllen sollte.

Platzieren Sie dann Pinzettenelektroden so, dass sich der positive Anschluss auf der gleichen Seite wie der injizierte Ventrikel und der negative Anschluss auf der gegenüberliegenden Seite des injizierten Ventrikels unterhalb des Ohrs des Embryos befindet. Befeuchten Sie die Elektroporationsstelle mit einigen Tropfen bakteriostatischer Natriumchloridlösung und legen Sie fünf elektrische Stromimpulse mit einer Dauer von 50 Millisekunden im Abstand von 950 Millisekunden an. Blasen an der Minuselektrode zeigen elektrischen Strom an.

60 bis 90 Milliampere sind in der Regel ausreichend für eine erfolgreiche Elektroporation. Niedrigere Ströme transfizieren Neuronen nicht effizient, während höhere Ströme zum Tod des Embryos führen können. Nachdem Sie den Vorgang für jeden Embryo des ersten Gebärmutterhorns wiederholt haben, setzen Sie es vorsichtig wieder in die Bauchhöhle ein.

Nach dem Nähen der Muskelschicht und der Haut vorsichtig mit Jodlösung desinfizieren und die Vaseline mit Zellulosetupfern vorsichtig von den Augen entfernen. Halten Sie die Maus unter eine Infrarotlampe, bis sie aufwacht. Nachdem Sie die schwangere Frau mit einer zugelassenen Methode eingeschläfert haben, entfernen Sie die Gebärmutter mit den Embryonen und legen Sie sie in eine 10 Zentimeter große Petrischale mit eiskaltem vollständigem HBSS.

Halten Sie von diesem Zeitpunkt an alle Lösungen, Embryonen und Gehirne auf Eis. Verwenden Sie bei der Arbeit unter einem Stereomikroskop eine Pinzette mit feiner Spitze und eine Federschere von Vannas Tübingen, um jeden Embryo von der Gebärmutter zu trennen. Übertragen Sie die Embryonen in eine andere Petrischale, die eiskaltes vollständiges HBSS enthält.

Machen Sie einen Schnitt auf Höhe des Hirnstamms und schneiden Sie entlang der sagittalen Mittellinie. Schälen Sie die Haut und den Knorpel ab, die das Gehirn bedecken. Schneiden Sie dann den Hirnstamm direkt hinter den Halbkugeln ab und entfernen Sie das Gehirn aus dem Schädel.

Übertragen Sie das Gehirn mit einem Mikrolöffelspatel auf eine 12-Well-Platte mit eiskaltem, vollständigem HBSS. Sammle alle Gehirne aus dem Wurf in der 12-Well-Platte. Verwenden Sie dann ein Fluoreszenz-Stereomikroskop, um das Gehirn in der 12-Well-Platte auf die Helligkeit der Fluoreszenz sowie die Größe der elektroporierten Region zu untersuchen.

Wählen Sie zwei bis vier Gehirne mit hellen Fluoreszenzsignalen und dem mutmaßlichen somatosensorischen Kortex für die weitere Verarbeitung aus. Gießen Sie dann geschmolzene 3%ige Agaroselösung mit niedrigem Schmelzpunkt in eine abziehbare Einweg-Einbettungsform. Verwenden Sie einen Mikrolöffelspatel, um das Gehirn von der 12-Well-Platte zu entfernen, und lassen Sie überschüssiges vollständiges HBSS vorsichtig mit feinem Seidenpapier aus dem Gehirn abtropfen.

Legen Sie das Gehirn vorsichtig in die Agaroselösung. Schiebe sie dann mit einer 20-Gauge-Nadel an den Boden der Form und passe ihre Position vorsichtig an. Richten Sie bei koronalen Schnitten das Gehirn so aus, dass die Riechkolben nach oben zeigen.

Halten Sie die Form auf Eis, bis die Agaroselösung verfestigt ist, und fahren Sie dann mit der Sektion des Gehirns fort. Verwenden Sie eine saubere Rasierklinge, um überschüssige Agarose um das Gehirn herum abzuschneiden, wobei auf allen Seiten etwa ein Millimeter Agarose übrig bleibt, mit Ausnahme der Riechkolben, wo zwei bis drei Millimeter Agarose übrig bleiben sollten. Nachdem Sie eine kleine Menge Cyanacrylatkleber auf eine Probe aufgetragen haben, fixieren Sie den abgeschnittenen Agaroseblock mit den Riechkolben nach unten.

Übertragen Sie den Probentisch in die Schneidekammer eines vibrierenden Klingenmikrotoms, das eiskaltes vollständiges HBSS enthält, und positionieren Sie das Gehirn mit seiner dorsalen Seite in Richtung der Klinge. Schneiden Sie 250 Mikrometer dicke Hirnschnitte, die den elektroporierten Bereich mit einer niedrigen bis mittleren Amplitude und einer sehr langsamen Schnittgeschwindigkeit enthalten. In der Regel werden von jedem erfolgreich elektroporierten Gehirn vier bis sechs Schichten mit hellem Fluoreszenzsignal erhalten.

Fassen Sie den Agaroserand eines Abschnitts mit einer feinen Pinzette und ziehen Sie die Scheibe auf einen gebogenen Mikrolöffelspatel. Übertragen Sie auf diese Weise die Gehirnscheiben vorsichtig auf eine Sechs-Well-Platte, die eiskaltes vollständiges HBSS enthält. Befeuchten Sie lamininbeschichtete Membraneinlagen mit 100 Mikrolitern vollständigem HBSS.

Übertragen Sie dann die Scheiben vorsichtig mit dem gebogenen Mikrolöffelspatel und der Pinzette auf die Membranen. Schieben Sie die Scheibe vorsichtig vom Spatel auf die Membran und positionieren Sie sie dann mit einer Pinzette. Fahren Sie mit dem Übertragen der restlichen Scheiben fort.

Bis zu fünf Scheiben können auf einen Membraneinsatz gelegt werden. Entfernen Sie überschüssiges vollständiges HBSS mit einer Pipette. Anschließend werden die Membraneinsätze mit Hilfe einer Pinzette vorsichtig in eine Sechs-Well-Platte mit 1,8 Millilitern geschnittenem Nährmedium gelegt

Wählen Sie einen Gehirnschnitt für die Bildgebung aus, indem Sie die Schnitte durch ein inverses Mikroskop betrachten. Wählen Sie eine Schicht mit hellen einzelnen Neuronen in der oberen SVZ, die radial zur Floroberfläche der Schicht wandern. Das Vorhandensein feiner fluoreszierender Prozesse radialer Gliazellen, die sich über die gesamte Konjugatplatte erstrecken, deutet auf ein intaktes radiales Gliagerüst hin, das von migrierenden konjugierten Neuronen verwendet wird.

Übertragen Sie den Membraneinsatz mit einer ausgewählten Scheibe in eine Glasbodenschale mit einem Durchmesser von 50 Millimetern, die zwei Milliliter Scheibenkulturmedium enthält. Stellen Sie die Schale in die Klimakammer des Konfokalmikroskops. Stellen Sie die Auflösung auf 512 x 512 Pixel ein.

Erhöhen Sie die Scangeschwindigkeit von 400 Hertz auf 700 Hertz, um die Bildrate von etwa 1,4 auf etwa 2,5 Bilder pro Sekunde zu erhöhen. Verwenden Sie nicht mehr als die zweifache Mittelwertbildung. Definieren Sie einen Z-Stapel durch den elektroporierten Bereich mit einer Schrittweite von 1,5 Mikrometern.

Starten Sie die Zeitrafferserie, indem Sie alle 30 Minuten einen Z-Stapel erstellen. Die beschriebenen Einstellungen ermöglichen eine ausreichende Auflösung und Helligkeit des Bildes und halten gleichzeitig den Fotoschaden während der Aufnahme gering. Dieser Film zeigt, wie kortikale Neuronen von E16.5 von den ventrikulären subventrikalen Zonen zur kortikalen Platte wandern.

Im Bcl11a floxierten bedingt transgenen nach Elektroporation des IRES-GFP-Kontrollplasmids am embryonalen Tag 14.5. Der Film besteht aus 108 Bildern mit einer Rate von fünf Bildern pro Sekunde. Der Maßstabsbalken stellt 100 Mikrometer dar.

Die Elektroporation eines DNA-Plasmidvektors, der Cre-IRES-GFP enthält, beeinflusste die kortikale Neuronenmigration in bedingten Bcl11a-gefloxten Gehirnen. Wie hier zu sehen, bewegen sich nur sehr wenige Neuronen über die Zwischenzone hinaus, um die kortikale Platte zu erreichen. Dieser Film zeigt die Polarisation von kortikalen Neuronen von einer GFP-markierten Kontrolle auf der linken Seite im Vergleich zu Neuronen von einer Bcl11a-Mutante auf der rechten Seite.

Diese animierten Spuren der repräsentativen Kontrolle in Bcl11a-mutierten Neuronen wurden aus Zeitrafferserien von E16.5-Schnittkulturen mit einer Auflösung von einer Stunde gewonnen. Auch hier sind links die Daten des Kontrollgehirns und rechts die Daten des cre-IRES-GFP elektroporierten Gehirns zu sehen. Wie aus dieser Sammlung repräsentativer Spuren aus Kontroll- und Bcl11a-Mutantenschnittkulturen hervorgeht, durchlaufen die Bcl11a-mutierten Neuronen häufig repetitive Phasen mit reduzierter Migrationsgeschwindigkeit und zufällig veränderter Orientierung, wie durch die roten Pfeilspitzen markiert.

Geschwindigkeitsprofile können aus Spuren wandernder Neuronen berechnet werden. Wie hier zu sehen ist, hat ein größerer Anteil der Bcl11a-mutierten Neuronen im Vergleich zu Kontrollen eine langsamere Migrationsgeschwindigkeit. Der Abweichungswinkel kann aus den Leiterbahndaten berechnet werden.

Wie aus diesem Histogramm ersichtlich ist, weisen die Bcl11a-mutierten Neuronen, die durch die schwarzen Balken dargestellt werden, im Vergleich zu Kontrollen größere Abweichungswinkel auf. Einmal gemeistert, kann diese Technik in jeweils weniger als zwei Stunden für die In-utero-Elektroporation und die Vorbereitung von organotypischen Hirnschnittkulturen durchgeführt werden. Dieses Verfahren kann leicht angepasst werden, um eine fraktionierte Analyse von Genen durchzuführen, die in radial wandernden kortikalen Neuronen durch Funktionsgewinn und -verlust sowie durch vaskuläre Experimente von Interesse sind.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man radial wandernde Neuronen in organotypischen Schnittkulturen, die aus elektroporierten embryonalen Gehirnen durch konfokale Zeitraffermikroskopie hergestellt wurden, direkt beobachten kann.