Identifizierung und Charakterisierung von metastasierendem Faktoren durch Gentransfer in die neuartige RIP-Tag; RIP-tva Mausmodell

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, metastasierende Faktoren durch Gentransfer in den Novel RIP-Tag zu identifizieren und zu charakterisieren; RIP-tva Mausmodell. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Krebsmetastasierung zu beantworten, wie z. B. die Identifizierung der Treiber und der neuartigen therapeutischen Ziele. Der Hauptvorteil dieses Mausmodells für Krebs besteht darin, metastasierende Faktoren durch somatischen Gentransfer in Betazell-Vorläuferlegionen der Bauchspeicheldrüse zu identifizieren.

Beginnen Sie mit der Ernte einer 15 Zentimeter großen Schale mit Viren, die DF1-Zellen produzieren, pro Maus, die infiziert werden soll. Sammeln Sie zunächst das Medium aus den zusammenfließenden 15-Zentimeter-Schalen. Entfernen Sie dann Zellreste durch Zentrifugation mit niedriger Geschwindigkeit in einer vorgekühlten Zentrifuge für 10 Minuten bei 1650 mal G und vier Grad Celsius.

Übertragen Sie anschließend den Virusüberstand in Polyallomer-Ultrazentrifugenröhrchen. In einer Ultrazentrifuge 1,5 Stunden bei 9540 G und vier Grad Celsius drehen. Entfernen Sie so viel Überstand wie möglich aus den Ultrazentrifugenröhrchen.

Geben Sie dann PBS in das Ultrazentrifugenröhrchen, um die endgültige 100-Mikroliter-Virussuspension pro 15-Zentimeter-Schale herzustellen. Decken Sie die Röhrchen mit Laborfolie ab und suspendieren Sie das unsichtbare Viruspellet wieder, indem Sie es zwei Minuten lang bei mittlerer Geschwindigkeit vortexen. Wiegen Sie dann die Ultrazentrifugenröhrchen bei vier Grad Celsius für eine Stunde oder über Nacht.

Nach der Inkubation wird die Virussuspension in ein Mikrozentrifugenröhrchen überführt und das Virus titeriert. Beginnen Sie das Titerverfahren, indem Sie sicherstellen, dass die DF1-Zellen, die in 12-Well-Gewebekulturplatten sitzen, eine Konfluenz von 30 % erreicht haben. Für jede Bestimmung des Virustiters wird eine Zwölf-Well-Platte benötigt.

Beginnen Sie eine zehnfache serielle Verdünnung der Virusüberstände, indem Sie zuerst fünf Mikroliter Virusüberstand mit 495 Mikrolitern Wachstumsmedium in einem Mikrozentrifugenröhrchen mischen, um eine Verdünnung von zehn bis zur zweiten zu erreichen. Wirbeln Sie kurz für ein paar Sekunden. Dann überführen Sie 40 Mikroliter der zehn zur zweiten Verdünnung auf 360 Mikroliter Wachstumsmedium in einem Mikrozentrifugenröhrchen für die zehnte bis dritte Verdünnung.

Wirbeln Sie kurz für ein paar Sekunden. Diesen Vorgang fortsetzen, bis er auf zehn bis zum vierten und zehn auf den fünften verdünnt ist. Als nächstes aliquotieren Sie 2,25 Milliliter Wachstumsmedium in jedes von fünf Sechs-Milliliter-Polystyrolröhrchen.

Und beschriften sie jeweils mit zehn bis zur sechsten, zehn mit der siebenten, zehn mit der achten, zehn mit der neunten und zehn mit der zehnten. Mischen Sie 0,25 Milliliter der zehnten bis fünften Verdünnung mit 2,25 Millilitern Wachstumsmedium in der sechs Milliliter Polystyroltube für die zehnte bis sechste Verdünnung. Wirbeln Sie kurz für ein paar Sekunden.

Wiederholen Sie den Vorgang für die Verdünnungen zehn bis zur siebenten, zehn bis zur achten, zehn bis zur neunten und zehn bis zur zehnten Verdünnung. Entfernen Sie anschließend das ursprüngliche Kulturmedium von den DF1-Zellen auf den 12-Well-Platten. Und geben Sie einen Milliliter verdünntes Virus in doppelter Ausführung in jede Vertiefung.

Lassen Sie die Zellen mindestens sieben Tage lang bei 37 Grad Celsius und 5 CO2 wachsen. Beginnen Sie die Infektion, indem Sie zunächst eine sieben Wochen alte RIP-Tag RIP-tva Maus betäuben. Tragen Sie Augenschmiermittel auf beide Augen auf, um ein Austrocknen der Hornhaut zu verhindern.

Rasieren Sie die Haare aus der Brusthöhle der RIP-Tag RIP-tva Maus, positionieren Sie die Maus auf dem Rücken mit der Brust nach oben auf einem saugfähigen Labortischpapier auf einem kuschelsicheren Stövchen. Führen Sie eine Zehenkneifung durch, um das Tier auf Nichtansprechbarkeit zu untersuchen und die vollständige Anästhesiewirkung zu bestätigen. Strecken Sie die vorderen Gliedmaßen aus und sichern Sie sie mit Klebeband.

Markieren Sie die Brust der Maus für die Injektion. Markieren Sie die Stelle in der Mitte zwischen der sternalen Kerbe und der Oberseite des Xiphoidfortsatzes und etwas links anatomisch des Brustbeins. Schrubben Sie dann die vordere Brustwand entweder mit einem Povidon-Jod-Peeling oder einem Chlorhexidin-Peeling, gefolgt von einem mit 70 % Isopropylalkohol oder 70 % Ethanol getränkten Mullschwamm.

Saugen Sie 50 Mikroliter Luft in eine sterile 28,5-Gauge-Insulinspritze, um zwischen dem Kolben und dem Meniskus einer 500-Mikroliter-Spritze Platz zu schaffen. Ziehen Sie 100 Mikroliter Virus auf. Der Luftraum ohne jegliche Flüssigkeit an der Wand ist entscheidend für das Sehen des Herzpulses.

Halten Sie die Nadel aufrecht, halten Sie die Haut der Maus mit einer Hand straff und führen Sie die Nadel an die markierte Stelle ein. Wenn ein hellroter Blutimpuls in der Spritze erscheint, hören Sie auf, die Nadel vorzuschieben, und fixieren Sie die Tiefe der Nadel in der Maus mit einer Hand. Drücken Sie mit der anderen Hand vorsichtig und langsam auf den Kolben, um die Virussuspension über einen Zeitraum von etwa 60 Sekunden abzugeben.

Geben Sie 10-20 Mikroliter ab, wenn ein hellroter Blutimpuls in der Spritze erscheint. Das kontinuierliche Eindringen von rotem, sauerstoffreichem Blut in die transparente Nadelnabe zeigt die korrekte Positionierung der Nadel in den linken Ventrikel an. Nach dem letzten Stoß der Beute, um die Virussuspension zu verabreichen, und bevor Sie den nächsten roten Blutimpuls sehen, ziehen Sie die Nadel schnell aus der Brusthöhle zurück.

Üben Sie mindestens eine Minute lang sanften Druck auf die Injektionsstelle aus, um die Blutung zu reduzieren. Bewegen Sie die Maus dann vorsichtig auf ein Heizkissen oder unter eine Wärmelampe, bis sie bei vollem Bewusstsein ist. RIP-Tag RIP-tva Mäuse wurden im Alter von sieben Wochen mit dem angegebenen RCASBP-Bcl-xL-Retrovirus infiziert und im Alter von 16 Wochen euthanasiert.

Dieses Foto zeigt eine repräsentative Synaptophysin-Färbung von metastasierten neuroendokrinen Pankreastumoren in Pankreaslymphknoten. Hier wurden die RIP-Tag RIP-tva Mäuse mit dem angegebenen RCASBP-RHAM B infiziert. Dieses Foto zeigt die repräsentative Synaptophysin-Färbung von metastasierten pankreatischen neuroendokrinen Tumoren in Pankreaslymphknoten. Hier ist die Synaptophysin-Färbung in der Leber nach Injektion des RCASBP-RHAMM B-Virus zu sehen.

Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, dass der Titel von mehr als zehn bis acht infektiösen Einheiten pro Milliliter für die In-vivo-Infektion von proliferierenden TVA-Zellen in RIP-Tag-RIP-tva-Mäusen erforderlich ist, und RCASBP retrovirale Rektoren können CDNA bis zu 2,5 Kilobasen liefern. Nach der Entwicklung dieses Mausmodells ebnete es den Weg zu einer paradigmenverändernden Erkenntnis, dass BCL-xL tatsächlich die Metastasierung von Krebs fördert, unabhängig von seiner antiapoptotischen Funktion.