Hochdurchsatz-Analyse des Bewegungsapparates Verhaltens in der Drosophila -Insel-Assay

Das übergeordnete Ziel des Island Assays ist es, das grundlegende Bewegungsverhalten von Drosophila melanogaster mittels automatischer Datenverarbeitung und objektiver Quantifizierung zu bewerten. Diese Methode kann verwendet werden, um Schlüsselregulatoren des Bewegungsverhaltens zu identifizieren, wie z. B. Gene, die an Bewegungsstörungen beteiligt sind. Es kann verwendet werden, um Medikamente zu testen, die solche Defekte rückgängig machen können.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine Hochdurchsatz-Quantifizierung des Bewegungsverhaltens von Drosophila ermöglicht, wodurch diese Technik für groß angelegte Screenings geeignet ist. Wir haben uns entschieden, diese Methodik zu entwickeln, um eine große Anzahl von Krankheitsmodellen analysieren zu können. Um dies zu ermöglichen, brauchten wir eine automatisierte Bilddatenanalyse.

visuelle Demonstration dieser Methode ist sehr hilfreich. Mehrere Schritte der Beta-Verarbeitung sind entscheidend und können für neue Benutzer schwierig sein, insbesondere für diejenigen, die mit den verwendeten Softwarepaketen nicht vertraut sind. Bereiten Sie zunächst mindestens drei Fläschchen pro Versuchsbedingung als biologische Replikate vor.

Jede Datei sollte ca. 15 Fliegen gleichen Geschlechts und ähnlichen Alters enthalten. Wichtig ist, dass die Fliegen intakte Flügel haben. Erstellen Sie die Ordner zum Speichern der Experimente.

Generieren Sie diese in einer Verzeichnisstruktur, die durch die Bedingungen und Replikate definiert ist. Wenn das Experiment z. B. zwei Genotypen mit jeweils fünf Replikationen enthält, erstellen Sie einen Hauptordner mit dem Datum des Experiments, und erstellen Sie in diesem Ordner einen Unterordner für jeden Genotyp. Erstellen Sie dann in den Genotyp-Ordnern Unterordner für jedes Replikat.

Richten Sie anschließend das Prüfgerät ein. Geben Sie kaltes Wasser mit etwas Seife auf das Badetablett und positionieren Sie die Plattform in der Mitte der Badewanne, falls nicht bereits in der Badewanne fixiert. Decken Sie das Tablett und die Plattform mit einer durchsichtigen Box ab.

Um die Plattform zu beleuchten, positionieren Sie eine kühle Lampe, z. B. gewöhnliche 12-Volt-LEDs, darüber. Positionieren Sie außerdem eine an einen Computer angeschlossene Webcam direkt über der Plattform. Öffnen Sie auf dem Computer die Bildaufzeichnungssoftware.

Wählen Sie im Menü die entsprechende Webcam als Aufnahmegerät aus. Platziere eine tote Fliege auf der Insel, um die Videoeinstellungen anzupassen. Passen Sie die Helligkeit, den Kontrast und die Farbe in der Software so an, dass die tote Fliege vor einem weißen Hintergrund schwarz erscheint.

Passen Sie als Nächstes die Einrichtung des Zeitrafferfilms an, um die Filme als AVI-Dateien zu speichern. Navigieren Sie dann zu dem Verzeichnis, in dem die Daten gespeichert werden sollen, und definieren Sie den Namen des Films. Speichern Sie diese Änderungen.

Wählen Sie für die Komprimierung der Bilddaten den Intel IYUV-Code aus. Stellen Sie die Aufnahmegeschwindigkeit auf ein Bild alle 0,1 Sekunden ein und stellen Sie die entsprechende Wiedergaberate auf 10 Bilder pro Sekunde ein. Gehen Sie abschließend zur erweiterten Einstellung und wählen Sie Für jeden aufgenommenen Frame ein bmp-Bild erstellen.

Navigieren Sie dann zu demselben Verzeichnis, das Sie zum Hosten der AVI-Dateien ausgewählt haben, und drücken Sie auf OK. Bevor du beginnst, vergewissere dich, dass die Insel leer und sauber ist. Starten Sie dann die Aufnahme in der Zeitraffer-Bildoberfläche der Bildaufzeichnungssoftware.

Nimm ein Fläschchen mit Fliegen und klopfe zwei- oder dreimal darauf, um alle Fliegen auf den Boden zu schlagen. Entfernen Sie dann schnell den Stopfen aus dem Fläschchen und klopfen Sie die Fliegen kräftig auf die Plattform. Sie sollten alle ungefähr zur gleichen Zeit auf der Plattform erscheinen.

Geben Sie den Fliegen bis zu 30 Sekunden Zeit, um die Plattform zu verlassen, und stoppen Sie dann die Aufnahme. Entfernen Sie bei Bedarf manuell alle verbleibenden Fliegen von der Plattform. Bevor Sie mit dem nächsten Experiment fortfahren, stellen Sie sicher, dass Sie das Verzeichnis neu definieren, in dem der nächste Datensatz gespeichert werden soll.

Die erste Aufgabe besteht darin, Stapel und Projektionen der gesammelten Bildserien zu erstellen. Öffnen Sie in Fidschi den Drosophila Island Assay. Geben Sie im neuen Fenster die erste Bild-Zeitreihen-ID ein.

Wählen Sie als Nächstes nur das Untermakro zum Erstellen von Stapeln und Projektion aus. Klicken Sie auf OK, und leiten Sie den Computer zu dem Ordner, der alle Unterordner mit den einzelnen Island Assay-Experimenten enthält. Nach der Verarbeitung der Daten erscheinen zwei neue Dateien in jedem einzelnen experimentellen Unterordner.

Die nächste Aufgabe besteht darin, den genauen Standort der Plattform in den Bildern zu definieren. Öffnen Sie die grafische Oberfläche und aktivieren Sie das Kontrollkästchen Plattform definieren. Wählen Sie dann das Verzeichnis aus, in dem experimentelle Unterordner gespeichert werden.

Es öffnen sich das Projektionsbild und zwei Fenster. Zeichnen Sie im ersten Bild mit dem Polygonauswahlwerkzeug ein Polygon über die Inselplattform. Schließen Sie die Grenzlinie am Parameter der Plattform nicht in diese Auswahl ein.

Fügen Sie die Auswahl zum ROI-Manager-Fenster hinzu, indem Sie im ROI-Manager-Fenster auf Hinzufügen klicken. Nachdem Sie die Auswahl zum ROI-Manager hinzugefügt haben, wird sie als Satz von Werten angezeigt. Klicken Sie dann im Fenster "Plattform definieren" auf "OK".

Die Software geht zum nächsten Projektionsbild über, das in dem Ordner gespeichert ist. Wenden Sie weiterhin denselben ROI für die Plattform auf das nächste Projektionsbild an, indem Sie den im ROI-Manager gespeicherten ROI auswählen und diesen ROI im Fenster Plattform definieren bestätigen. Bevor Sie mit dem nächsten Projektionsbild fortfahren, stellen Sie sicher, dass sich die Plattform während des Experiments nicht bewegt hat.

Wenn sich die Position der Plattform verschoben hat, klicken Sie mit der linken Maustaste in die Mitte der Auswahl und ziehen Sie sie in die gewünschte Position. Wenn das Auswahlfeld nicht mit der Plattform übereinstimmt, klicken Sie mit der linken Maustaste außerhalb der Auswahl und markieren Sie mit dem Polygonwerkzeug eine neue Auswahl für die Plattform. Fügen Sie diese neue Auswahl dem ROI-Manager hinzu.

Überprüfen Sie dann die neue Auswahl, indem Sie im Fenster "Plattform definieren" auf "OK" klicken, und setzen Sie den Vorgang fort, bis alle Bilder die Plattformen ordnungsgemäß definiert haben. Die letzte Aufgabe vor der Verarbeitung der Daten besteht darin, die Mindestgröße für eine Fliege zu definieren. Dies wird im Textprotokoll erläutert.

Um die Fliegen zu quantifizieren, die von der Plattform entkommen, legen Sie zunächst die minimale Fliegengröße fest. Geben Sie dann die größte Anzahl von Fliegen in einer Datei innerhalb der Versuchsreihe an. Starten Sie die Analysefunktion, und wählen Sie an der Eingabeaufforderung das Hauptverzeichnis für das Experiment aus.

Beachten Sie, dass nach dem Ausführen des Makros in jedem Ordner eine neue Ergebnisdatei und ein neuer Bildstapel angezeigt wurden. Öffnen Sie diese Dateien, um sicherzustellen, dass das Verfahren ordnungsgemäß funktioniert hat. Starten Sie das R- oder RStudio-Softwarepaket, und öffnen Sie das Analyseskript Island Assay, um alle Experimente gleichzeitig zu verarbeiten.

Das Skript muss ordnungsgemäß bearbeitet werden, damit die Analyse erfolgreich ist. Fügen Sie in das Skript in Zeile 16 den Pfad zum Hauptverzeichnis ein, das die zu analysierenden Experimente enthält. Fügen Sie in Zeile 19 den Pfad zu dem Ordner ein, in dem die Analyseausgabedateien gespeichert werden sollen.

Letzteres muss sich um einen anderen Speicherort als das Verzeichnis handeln, in dem sich die zu analysierenden Bilddaten befinden. Führen Sie nun das Skript über die Symbolleiste aus, und fahren Sie mit der Analyse der Ergebnisse fort. Das Skript Insel-Assay-Analyse exportiert ein Liniendiagramm für jede experimentelle Bedingung.

Das Diagramm zeigt den Prozentsatz der Fliegen, die im Laufe der Zeit für jede Wiederholung dieses Zustands auf der Plattform verbleiben. Das exportierte Liniendiagramm, escape response:all conditions, fasst den durchschnittlichen und Standardfehler der mittleren Fluchtreaktion für die ersten 12 experimentellen Bedingungen im Hauptordner zusammen. Die Fläche unter der Kurve für jedes experimentelle Replikat wird berechnet, um zu bestimmen, ob sich die Versuchsbedingungen signifikant voneinander unterscheiden.

Die Fläche unter der Kurve und der Medianwert für jede experimentelle Bedingung werden als Diagramm exportiert. Abhängig von der Anzahl der im Hauptordner vorhandenen Bedingungen führt das Skript entweder einen zweiseitigen, ungepaarten Welch-T-Test für zwei Bedingungen oder eine Anova mit einer Korrektur von zwei Schlüsseln für mehr als zwei Bedingungen durch. Alle numerischen Daten, die mit dem Skript Island Assay analysis berechnet werden, werden ebenfalls exportiert und als csv- oder txt-Dateien im Datenausgabeordner gespeichert.

Die Ataxia teleangiektasie ist eine autosomal-rezessive Bewegungsstörung, die durch Mutationen im ATM-Gen verursacht wird. Die Krankheit ist gekennzeichnet durch ein frühes Auftreten der Kleinhirnataxie. Der Effekt des ubiquitären Niederschlagens des Fliegenorthologs von ATM wurde im Island Assay untersucht und mit Kontrollen verglichen.

Insgesamt verringerte der ubiquitäre Knock-down des fliegenden ATM-Orthologs, Tefu, die motorische Leistung im Island Assay im Vergleich zu genetischen Hintergrundkontrollen signifikant. Die manuelle Analyse der aufgezeichneten Island Assay-Daten ergab das gleiche Ergebnis wie die automatisierte Analyse. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie den Insel-Assay durchführen, wie Sie das Drosophila Island Assay-Makro ausführen und wie Sie das Island Assay-Analyseskript bedienen.

Beim Versuch dieses Protokolls ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass die Qualität der Bildsegmentierung mit der Qualität der Filme korreliert. Je besser der Kontrast, desto glatter die Analyse. Nach ihrer Entwicklung ebnet diese Technik den Weg für Forscher, die Fortbewegungsfähigkeit in Drosophila im Hochdurchsatz zu erforschen.

Nach der Verwendung dieses Assays können andere Assays, z. B. solche, die negative Geotaxis testen, verwendet werden, um lokomotorische Defekte weiter zu untersuchen.