Name: Induktion und Diagnose von Tumoren in Drosophila Imaginal Disc Epithelia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie mit dem GAL4-UAS-System tumorigene Mosaikklone in Drosophila-Imaginalscheiben induzieren und die Tumorentwicklung in verschiedene Stadien klassifizieren. Diese Methode ermöglicht zuverlässige Krebsmodellierung.

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Wir danken J. Vaughen für kritisches Lesen des Manuskripts. Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse von JSPS KAKENHI Grant Numbers 26891025, 15H01500 und The Takeda Science Foundation Research Grant zu YT

1. Fliegen Sie Kreuze und Klon Induktion <ol><li> Entfernen Sie alle Fliegen in der Durchstechflasche 12 h, bevor Sie Jungfliegen sammeln. </li><li> Anästhesieren Sie die Fliegen in der Durchstechflasche, indem Sie CO 2 -Gas injizieren und Fliegen auf ein CO 2 -Flugpad legen. </li><li> Übertragen Sie 10 - 20 Jungfrauen und 10 Männer aus dem CO 2 Fliegenkissen in eine frische Ampulle und inkubieren für 1 Tag bei 25 ° C. </li><li> Übertragen Sie diese Fliegen in eine frische Ampulle und inkubieren für 12 h bei 25 ° C. HINWEIS: Verwerfe die erste Durchstechflasche als Jungfrau Weibchen legen nicht genug Eier am ersten Tag. </li><li> Für Enhancer-GAL4-Linien entfernen Sie die erwachsenen Fliegen und inkubieren die Durchstechflasche bei 25 ° C bis zur Dissektion. </li><li> Zur Induktion von Mosaikklonen durch Flip-out-GAL4, entfernen Sie die erwachsenen Fliegen und inkubieren Sie die Durchstechflasche für 2 - 4 Tage bei 25 ° C. Die Inkubationszeit vor Hitzeschock ist abhängig vom experimentellen Zweck. Ein Hitzeschock 2 Tage nach Eiablagerung (AED) erzeugt Mosaikklone in unreifer SekundeImagin imaginale epithelien Ein Hitzeschock nach 3 oder 4 Tagen AED erzeugt Mosaikklone im differenzierten frühen bis mittleren Drittel der imaginären Epithelien. HINWEIS: Es ist wichtig, die Wirkung eines veränderten Hitzeschock-Timings auf tumorigene Phänotypen zu untersuchen. </li><li> Zur Induktion von Mosaikklonen durch Flip-out-GAL4 wird die Durchstechflasche durch Eintauchen in ein 37 ° C-Wasserbad für 10 - 45 min erhitzt, gefolgt von einer Inkubation für 2 - 3 Tage bei 25 ° C. HINWEIS: Die Informationen über die Hitzeschockzeit, das Timing und die Inkubationszeit in jedem Experiment sind in den Figuren der Legenden dargestellt. </li></ol> 2. Dissektion von Larven <ol><li> Sammeln Sie wandernde dritte Larven mit einem Holzstab oder einer stumpfen Pinzette, indem Sie sie durch geeignete fluoreszierende Marker ( z. B. EGFP) unter einem fluoreszierenden stereoskopischen Mikroskop herotypisieren und in eine Dissektion mit PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung) geben. </li><li> Die Larven in PBS durch Pipettieren mit 2 ml Plastikübertragungspipetten waschen. </li><li>Klemmen Sie die Mitte der Larve mit einer Pinzette und reißen den Körper in der Hälfte mit der anderen Pinzette. </li><li> Klemmen Sie den Mundhaken der vorderen Hälfte mit einer Pinzette und schieben Sie den Mund in Richtung des Körpers mit der anderen Pinzette, um den Körper von innen nach außen zu drehen. </li><li> Entfernen Sie unnötige Materialien wie Speicheldrüsen oder Fettkörper mit Pinzette. </li></ol> 3. Fixierung und Antikörperfärbung <ol><li> Übertragen Sie die seziertes vordere Hälfte des Larvenkörpers (einschließlich der imaginären Flügelscheiben) auf ein 1,5 ml Plastikrohr und fixieren Sie in 1 ml Fixlösung (4% Formaldehyd in PBS) für 10 min bei Raumtemperatur im Dunkeln unter leichter Rotation. ACHTUNG: Formaldehyd ist giftig und hat krebserzeugendes Potential. Tragen Sie Schutzhandschuhe und Kleidung, um den Hautkontakt zu vermeiden. ANMERKUNG: In diesem Teil finden alle Schritte auf einem Nutator bei Raumtemperatur im Dunkeln statt, wenn nicht anders angegeben. </li><li> Entfernen Sie die Fix-Lösung und entsorgen Sie sie. Waschen Sie das Gewebe mit 1 ml PBT (0,3% TritAuf X-100 in PBS) dreimal für jeweils 15 min. </li><li> Entfernen Sie die PBT und fügen Sie 1 ml PBTG (0,2% Rinderserumalbumin und 5% normales Ziegenserum in PBT) zum Blockieren und Nähren von 1 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° C hinzu. </li><li> Entfernen Sie PBTG und fügen Sie eine primäre Antikörperlösung hinzu, die in geeigneter Weise mit PBTG verdünnt ist (siehe Materialtabelle ) und über Nacht bei 4 ° C nähren. </li><li> Entfernen Sie die primäre Antikörperlösung und waschen Sie das Gewebe mit 1 ml PBT dreimal für jeweils 15 min. </li><li> PBT entfernen und sekundäre Antikörperlösung entsprechend mit PBTG (1: 400) verdünnen lassen. Für 2 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° C inkubieren. </li><li> Sekundäre Antikörperlösung entfernen und das Gewebe mit je 1 mL PBT zweimal für jeweils 15 min waschen. </li><li> Um F-Aktin zu färben, PBT zu entfernen und Phalloidin-Lösung zuzugeben, die in PBS (1:40) in geeigneter Weise verdünnt ist. Dann für 20 min nähren. Entfernen Sie die Phalloidin-Lösung und waschen Sie das Gewebe mit 1 ml PBT zweimal für jeweils 15 min. </li><li> Um Nuklear-DNA zu bekämpfen, PBT zu entfernen und DAPI (4 &#39;, 6-Diamidino-2-phenylindol) -Lösung (0,5 μg / ml DAPI in PBS) zuzugeben. Dann 10 min nähren. ACHTUNG: DAPI hat krebserzeugendes Potential. Tragen Sie Schutzhandschuhe und Kleidung, um den Hautkontakt zu vermeiden. </li><li> DAPI-Lösung entfernen und das Gewebe mit je 1 mL PBT zweimal für jeweils 15 min waschen. </li><li> Spülen Sie einmal in 1 ml PBS für 10 min bei Raumtemperatur. </li><li> Entfernen Sie PBS und fügen Sie 500 μl 100% Glycerin als Vormontagemedium hinzu. </li></ol> 4. Montage auf Mikroskop-Objektträger <ol><li> Legen Sie die gefärbten Gewebe auf eine Objektträger mit einer 2 ml Plastik-Transferpipette. </li><li> Übertragen Sie das Gewebe auf Tropfen des Montagemediums auf einem anderen Mikroskop-Objektträger mit Pinzette. </li><li> Halten Sie das Ende des zerlegten Gewebes mit einer Pinzette und ziehen Sie Gehirn und Augen Antenne Scheiben mit der anderen Pinzette. HINWEIS: Halten Sie die zerlegten Gehirne, um sie in der Nähe der Flügel imaginären Discs zu platzieren. Die Gehirne fungieren als Plattform, die verhindert, dass das Deckglas die Flügel-Imagialscheiben zermalmt. </li><li> Um die Flügel-imaginären Scheiben zu isolieren, halten Sie das Ende des zerlegten Gewebes mit einer Pinzette fest und kratzen sanft die Körperwand und reißen die Scheiben mit der anderen Pinzette ab. HINWEIS: Wenn es schwierig ist, Flügel imaginäre Scheiben zu finden, schälen Sie die Trachea von der hinteren zur vorderen Seite. Flügel-imaginäre Scheiben bleiben an der Trachea. </li><li> Die imaginären Scheiben vorsichtig mit einem Deckglas und einer Dichtung mit Nagellack bedecken; Bei 4 ° C aufbewahren. </li></ol> 5. Konfokale Mikroskopie <ol><li> Um konfokale Bilder unter Verwendung eines konfokalen Mikroskopsatz-Bilderfassungsparameters einschließlich des Bereichs der Emissionswellenlänge, der Laserintensität, des Verstärkungsfaktors, des Versatzes, der Abtastgeschwindigkeit und der Bildgröße 24 zu erhalten, HINWEIS: Detaillierte Vorgehensweise bei der Einstellung der Bildaufnahme finden Sie in der Bedienungsanleitung des jeweiligen Mikroskopherstellers. </li><li> Um einzelne co zu erfassenNfocal Abschnitte einer ganzen Flügel imaginären Scheibe, verwenden Sie ein 20X Objektiv Objektiv. </li><li> Erfassen Sie dreidimensionale Bilder durch z-Stapel-Scannen bei Schrittgröße von 0,5 - 1,0 μm mit 40X- oder 60X-Linsen. HINWEIS: Um zelluläre Phänotypen in hoher Auflösung zu analysieren, sollte eine Bildgröße größer als 512 x 512 Pixel sein. </li></ol> 6. Bildanalyse mit ImageJ <ol><li> Verwenden Sie Fidschi, eine Open-Source-ImageJ-Software, die sich auf die biologische Bildanalyse (https://fiji.sc/) 25 konzentriert , um konfokale z-Stack-Bilder zu erfassen und zu analysieren. </li><li> Um vertikale Abschnitte zu erwerben, öffnen Sie die Z-Stack-Bilder in ImageJ und wählen den Menüpunkt &quot;Image / Stacks / Reslice&quot;. HINWEIS: Im Menü Reslice sind entweder die XZ-Achse oder die YZ-Achse wählbar. Der vertikale Abschnitt kann auch in einer beliebigen Richtung erhalten werden, indem eine gerade Linie oder ein Rechteck auf das z-Stapelbild gezeichnet wird. </li></ol> 7. Diagnose von neoplastischen Phänotypen <ol><li> Öffnen Sie die Vertikale(XZ- oder YZ-Achse), die aus einem Satz von Z-Stack-Bildern erhalten wurden und morphologische Phänotypen und Antikörper-Färbung analysieren. </li><li> Für die Diagnose von Tumor-Phänotypen konzentrieren sich vor allem auf die folgenden drei Punkte: (1) Wenn eine Zellmasse, einschließlich Knockdown-Klone, von der Hauptepithelschicht abweicht, (2) wenn die subzelluläre Lokalisation von junctionalen Proteinen in dieser Zellmasse verändert wird , Und (3) wenn der Durchmesser dieser Zellmasse größer als 4 Zellen ist. </li><li> Kategorisieren Sie Tumor-Phänotypen gemäß dem in Abbildung 1 beschriebenen Flussdiagramm. </li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Das GAL4-UAS-System ist eines der leistungsstärksten genetischen Werkzeuge für die gezielte Genexpression in Drosophila 26 und erleichtert die Injektion und Analyse von Tumorzellen in vivo 4 . Dieses System ermöglicht die Erzeugung von Klonen, die den Knockdown von Tumorsuppressorgenen oder die Überexpression von Onkogenen im Wildtyp-Epithelgewebe tragen, eine Situation, die den Anfangsstadien des menschlichen Krebses sehr ähnlich ist, wo transformierte P...

Epithelgewebe sind hoch organisierte Systeme, die die bemerkenswerte homöostatische Fähigkeit haben, ihre Organisation durch Entwicklung und Zellumsatz zu erhalten. Dieses robuste Selbstorganisationssystem wird jedoch während der Tumorentwicklung zunehmend unterbrochen. Zu Beginn der Tumorentwicklung treten einzelne Mutantenzellen aus der Onkogenaktivierung oder der Tumor-Suppressor-Gen-Inaktivierung innerhalb einer Epithelschicht auf. Wenn diese transformierte &quot;Pro-Tumor-Zelle&quot; einer unterdrückenden Umgebung entzieht, die Epithelorganisation stört und unkontrollierte Proliferation beginnt, tritt die Tumorentstehung auf 1 . In den vergangenen Jahrzehnten haben herausragende technologische Fortschritte in der Genetik und Molekularbiologie bemerkenswerte Fortschritte bei der Krebsforschung gemacht. Insbesondere wurden neuere Studien unter Verwendung der genetischen Mosaikanalyse-Werkzeuge in Drosophila melanogaster , wie FLP-FRT (Flippase-Rekombinase / Flippase-Rekombinase-Target) mitotisches RekombinatAtion 2 und Flip-out-GAL4-UAS (Upstream-Aktivierungssequenz) -Systeme 3 haben wesentlich dazu beigetragen, die genetischen Mechanismen der Bildung und Metastasierung der Tumore 4 , 5 , 6 besser zu verstehen. Untersuchungen einer Gruppe konservierter Drosophila- Tumor-Suppressor-Gene, tödlicher Riesen-Larven ( lgl ), Scheiben groß ( dlg ) und Scribble ( Scrib ), unterstrichen die kritische Beziehung zwischen dem Verlust der Epithelorganisation und der Tumorentwicklung, da diese Gene eine Schlüsselrolle spielen In Regulation der apikalen Basalzellpolarität und Zellproliferation in Epithelgeweben 7 . Während Drosophila- Imagialscheiben normalerweise monolayered Epithelien sind, verursachen homozygote Mutationen in einem dieser drei Gene Zellen zu verlieren Struktur und Polarität, nicht zu unterscheidenVermietung, überproliferieren und letztlich mehrschichtige amorphe Massen bilden, die mit angrenzenden Geweben verschmelzen 7 . Ebenso ist die Störung dieser Gene bei Säugetieren an der Entwicklung von bösartigen Tumoren beteiligt 8 , 9 . Die neoplastischen Phänotypen, die von den mutierten Geweben gezeigt wurden, führten zur Klassifizierung dieser drei Gene als konservierte, neoplastische Tumorsuppressorgene (nTSGs) 7 , 8 . Wenn jedoch homozygote nTSG-Mutantenzellen sporadisch bei der Entwicklung von Wildtyp-Imagialscheiben unter Verwendung von FLP-FRT-vermittelter mitotischer Rekombination erzeugt werden, werden mutierte Zellen aus dem Gewebe durch c-Jun-N-terminale Kinase (JNK) -abhängige Apoptose 10 , 11 eliminiert , 12 , 13 , 14 , Extrusion 15 </suP&gt; , 16 oder Engagierung und Phagozytose durch Nachbarn 17 . In diesen genetisch mosaischen Epithelien wird die Apoptose meist in nTSG-Mutantenzellen, die sich an der Klongrenze befinden, nachgewiesen, was darauf hindeutet, dass benachbarte normale Zellen die Apoptose der nTSG-Mutantenzellen 10 , 11 , 12 , 18 auslösen. Jüngste Studien in Säugetierzellen haben bestätigt, dass diese zellwettbewerbsabhängige Eliminierung von Pro-Tumor-Zellen ein evolutionär konservierter epithelialer Selbstverteidigungsmechanismus gegen Krebs ist. 19 , 20 , 21 , 22 , 23 . Eine neuere Studie in Drosophila- Imagialscheiben zeigte jedoch, dass Mosaik-NTSG-Knockdown-Klone neoplastische Tumore induzierenIc Bereiche von Flügel imaginären Scheiben 16 . Die anfängliche Tumorbildung fand sich immer in der peripheren &quot;Scharnierregion&quot; und wurde niemals im zentralen &quot;Beutel&quot; -Bereich des Flügelscheibenepithels beobachtet, was darauf hindeutet, dass das tumorigene Potential der nTSG-Knockdown-Zellen von der lokalen Umgebung abhängt. Der zentrale Beutelbereich fungiert als &quot;Tumor-Kaltfleck&quot;, wo Pro-Tumor-Zellen keine dysplastische Überwucherung zeigen, während sich die periphere Scharnierregion wie ein &quot;Tumor-Hotspot&quot; 16 verhält. In &quot;Kaltfleck&quot; Beutelregionen delaminieren nTSG-Knockdown-Zellen von der Basalseite und unterziehen sich der Apoptose. Im Gegensatz dazu, als &quot;Hotspot&quot; Scharnierzellen besitzen ein Netzwerk von robusten zytoskeletalen Strukturen auf ihren basalen Seiten, nTSG-Knockdown-Zellen delaminieren von der apikalen Seite des Epithels und initiieren tumorigene Überwucherung 16 . Daher erfordert die Analyse von Tumor-Phänotypen in imaginären Scheiben sorgfältige consiVerringerung der regionsspezifischen Anfälligkeit für tumorigene Reize. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Induktion der neoplastischen Tumorbildung in den Drosophila- Flügel-Imaginalscheiben unter Verwendung des GAL4-UAS- RNAi- Systems, durch das nTSG-Knockdown-Zellen in normalen Flügelscheibenepithelien erzeugt werden. Obwohl diese experimentellen Systeme nützlich sind, um die frühen Stadien von Krebs zu untersuchen, wurde eine eindeutige Klassifizierungsmethode zur Bewertung der Stadien der Tumorprogression in imaginären Scheibenepithelien bisher nicht klar beschrieben. Daher schlagen wir auch eine Diagnosemethode vor, um pro-Tumor-Klon-Phänotypen, die in den Flügelscheibenepithelien induziert werden, in drei Kategorien zu klassifizieren: Hyperplasie (Akkumulation einer übermäßigen Anzahl von normal erscheinenden Zellen mit erhöhter Proliferation), Dysplasie (prämalignes Gewebe, das aus ungewöhnlich erscheinendem zusammengesetzt ist Zellen) und Neoplasien (gutartiger oder bösartiger Tumor aus Zellen mit abnormalem Aussehen und abnormalem Proliferationsmuster).

<table><tbody><tr><td><stark>Reagenzien</stark></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Wako</td><td>162-19321</td><td></td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Wako</td><td>168-11805</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd</td><td>Wako</td><td>064-00406</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>normales Ziegenserum</td><td>Sigma</td><td>G6767</td><td></td></tr><tr><td>Eindeckmedium, Vectashield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Maus-Anti-Dlg 4F3</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>4F3 Anti-Discs groß, RRID:AB_528203</td><td>in PBTG verdünnt, 1:40</td></tr><tr><td>Maus-anti-MMP1</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>3A6B4, RRID:AB_579780</td><td>3 gemischt 1:1:1 und verdünnt in PBTG, 1:40</td></tr><tr><td>mouse-anti-MMP1</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>3B8D12, RRID:AB_579781</td><td>3 gemischt 1:1:1 und verdünnt in PBTG, 1:40</td></tr><tr><td>mouse-anti-MMP1</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>5H7B11, RRID:AB_579779</td><td>3 gemischt 1:1:1 und verdünnt in PBTG, 1:40</td></tr><tr><td>mouse-anti-atubulin</td><td>Developmental Studien Hybridoma Bank</td><td>AA4.3, RRID:AB_579793</td><td>in PBTG verdünnt, 1:100</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 546 Phalloidin</td><td>Molekularsonden</td><td>A22283</td><td>verdünnt in PBS, 1:40</td></tr><tr><td>Ziegen-Anti-Maus-IgG-Antikörper, Alexa Fluor 546</td><td>Molekularsonden</td><td>A11030</td><td>in PBTG verdünnt, 1:400</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalognummer</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Fly strains</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>sd-Gal4Bloomington</td> <td>Drosophila Stock Center</td><td>#8609</td><td>rekombiniert mit UAS-EGFP</em</td></tr><tr><td>>upd-Gal4Bloomington</td> <td>Drosophila Stock Center</td><td>#26796</td><td>rekombiniert mit UAS-EGFP</td></tr><tr><td>UAS-lgl-RNAi</td><td>Vienna Drosophila RNAi center</td><td>#51247</td><td></td></tr><tr><td>UAS-scrib-RNAi</td><td>Vienna Drosophila RNAi center</td><td>#105412</td><td></td></tr><tr><td>UAS-RasV12</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>#64196</td><td></td></tr><tr><td>UAS-Yki3SA</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>#28817</td><td></td></tr><tr><td>hsFLP</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>#6</td><td></td></tr><tr><td>Act>CD2>GAL4 (ausklappbar GAL4)</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>#4780</td><td>rekombiniert mit UAS-EGFP</td></tr><tr><td>UAS-EGFP</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>#5428</td><td>X-Chromosom</td></tr><tr><td>UAS-EGFP</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>#6658</td><td>drittes Chromosom</td></tr><tr><td>UAS-Dicer2</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>#24650</td><td>zweites Chromosom</td></tr><tr><td>UAS-Dicer2</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>#24651</td><td>drittes Chromosom</td></tr><tr><td>vkg-GFPMorin</td> <td>et al. 2001</td><td></td><td>GFP-Proteinfalle</td></tr></tbody></table>

induktion und diagnose von tumoren in<em&gt; drosophila</em&gt; imaginal disc epithelia

Induction and Diagnosis of Tumors in Drosophila Imaginal Disc Epithelia

In den frühen Stadien des Krebses zeigen transformierte mutierte Zellen zytologische Anomalien, beginnen unkontrollierte Überwucherung und zerstören die Gewebeorganisation schrittweise. Drosophila melanogaster hat sich als ein populäres experimentelles Modellsystem in der Krebsbiologie entwickelt, um die genetischen und zellulären Mechanismen der Tumorentstehung zu untersuchen. Insbesondere genetische Werkzeuge für Drosophila- Imagialscheiben (Entwicklung von Epithelien in Larven) ermöglichen die Entstehung von transformierten Pro-Tumor-Zellen innerhalb eines normalen Epithelgewebes, eine Situation ähnlich der Anfangsphase des menschlichen Krebses. Eine neuere Studie der Tumorentstehung in Drosophila- Flügel-Imaginalscheiben zeigte jedoch, dass die Tumorinitiierung von der gewebe-intrinsischen Cytoarchitektur und der lokalen Mikroumgebung abhängt, was darauf hindeutet, dass es wichtig ist, die regionsspezifische Anfälligkeit für tumorigene Reize bei der Bewertung von Tumor-Phänotypen im imaginären Bereich zu berücksichtigen Scheiben Zur Erleichterung der phänotypischen Analyse von Tumor progressiIn imaginären Scheiben beschreiben wir hier ein Protokoll für genetische Experimente mit dem GAL4-UAS-System, um neoplastische Tumore in Flügel-imaginären Scheiben zu induzieren. Wir stellen ferner eine Diagnosemethode vor, um die Phänotypen von in imaginären Epithelien induzierten klonalen Läsionen zu klassifizieren, da eine klare Klassifizierungsmethode zur Unterscheidung verschiedener Stadien der Tumorprogression (wie Hyperplasie, Dysplasie oder Neoplasie) bisher nicht beschrieben wurde. Diese Methoden können weitgehend auf die Klonanalyse von Tumor-Phänotypen in verschiedenen Organen in Drosophila anwendbar sein.

Um die neoplastische Tumorbildung, die experimentell durch RNAi- vermittelte NTSG-Knockdown in Drosophila- Flügel-Imagialscheiben induziert wurde, zu demonstrieren, wurden drei verschiedene GAL4-Treiber verwendet, um UAS-RNAi für lgl oder scrib auszudrücken : (1) sd-GAL4, das eine starke UAS-Expression in der Flügelbeutel und milde Expression in den Scharnierbereichen ( Fig. 2 und Fig...

Mosaik Klonanalyse in Drosophila imaginären Scheibenepithelien ist ein leistungsfähiges Modellsystem, um die genetischen und zellulären Mechanismen der Tumorentstehung zu studieren. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Induktion von Tumoren in Drosophila Flügel imaginären Scheiben mit dem GAL4-UAS-System, und führen Sie eine Diagnose-Methode, um die Tumor-Phänotypen zu klassifizieren.

Induktion und Diagnose von Tumoren in<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal Disc Epithelia

In the early stages of cancer, transformed mutant cells show cytological abnormalities, begin uncontrolled overgrowth, and progressively disrupt tissue ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, tumorogene mosaikeartige Klone in sich entwickelnden Drosophila-Imaginalanlagen zu erzeugen und anschließend die klonalen Läsionen in verschiedene Stadien der Tumorentwicklung einzuteilen. Diese Methode kann helfen, eine zentrale Frage im Bereich der Krebsmodellierung zu beantworten, beispielsweise, wie Tumore konsistent induziert und der Fortschritt in einzelne Entwicklungsstadien eingeteilt werden können.Die Hauptvorteile dieser Technik bestehen darin, dass die Tumorinjektion in die Imaginalanlagen der Drosophila-Flügel mithilfe einfacher Fliegengenetik durchgeführt wird und dass die Klassifizierung der Tumentwicklungsstadien eine einfache Diagnose darstellt. Gemeinsam mit Kenta Morimoto, der das Verfahren demonstriert, wird Kimiko Morimoto, eine Technikerin aus meinem Labor, teilnehmen. Beginnen Sie mit dem Aufbau des genetischen Kreuzes.12 Stunden vor dem Sammeln der Jungtiere für den Kreuzungsversuch alle erwachsenen Fliegen aus Röhrchen mit ausgereiften Puppen entfernen. Am folgenden Tag einen Kreuzungsversuch zur Erzeugung genetisch mosaikartiger Nachkommen aufbauen. 12 bis 20 Jungtiere und 10 Männchen in ein frisches Röhrchen überführen und einen Tag lang bei 25 Grad Celsius inkubieren.Nach 24 Stunden überführen Sie die Fliegen in ein frisches Gefäß und entsorgen das erste Gefäß, das sie besiedelt haben. Nach weiteren 12 Stunden werden Eier erstmals verfügbar sein. Überführen Sie die Tiere im Abstand von 12 Stunden in neue Gefäße und verwenden Sie die Nachkommen für das Experiment.Nach der Inkubation der Ei-Röhrchen für zwei bis vier Tage bei 25 Grad Celsius erfolgt eine Hitzeschockbehandlung der Larven für zehn bis 45 Minuten in einem Wasserbad mit 37 Grad Celsius, um mosaikartige Klone durch Flip-out-GAL4 zu induzieren. Ein Hitzeschock am zweiten Entwicklungstag erzeugt Klone in unreifen Discs. Ein Hitzeschock am dritten oder vierten Entwicklungstag erzeugt Klone in fortgeschritteneren Discs.Nach der Hitzeschockbehandlung die Röhrchen zurück in den 25-Grad-Celsius-Inkubator stellen, bis Drittinstar-Larven verfügbar sind. Zum Beginn mithilfe eines Holzstäbchens oder stumpfer Pinzette wandernde Drittinstar-Larven in eine Petrischale mit PBS übertragen. Anschließend die Larven unter fluoreszierendem Licht genotypisieren, um die geeigneten fluoreszierenden Marker für mosaische Larven zu identifizieren.Bevor Sie fortfahren, waschen Sie die Larven mit PBS. Verwenden Sie dann unter einem Stereomikroskop zwei Pinzettenpaare, um die Mitte der Larve einzuklemmen und den Körper in zwei Hälften zu zerreißen. Klemmen Sie anschließend die Mundhaken ein, während Sie den Mund in Richtung Körper drücken, um den Körper nach außen zu stülpen.Entfernen Sie anschließend überflüssige Materialien wie die Speicheldrüsen und Fettkörper. Die Larven sind nun bereit für die Fixierung und die Antikörperfärbung, die im Textprotokoll beschrieben ist. Überführen Sie die gefärbten Gewebepräparationen mit einer zwei Milliliter fassenden Plastik-Transferpipette auf einen Objektträger.Bringen Sie dann mithilfe einer Pinzette einzelne Larven in Tropfen des Einbettungsmediums auf einem Objektträger unter. Isolieren Sie nun mit der Pinzette die Imaginalanlagen. Halten Sie zunächst das Ende des präparierten Gewebes fest und ziehen Sie mit der anderen Pinzette das Gehirn sowie die Augen-Antennen-Anlagen weg.Bewahren Sie die Gehirne zur weiteren Verwendung auf. Suchen Sie nun die Flügel-Imaginalanlagen. Die Flügel-Imaginalanlagen haften an der Seitenfläche des präparierten Gewebes.Befestigen Sie das Gewebe anschließend mit einer Pinzette und kratzen Sie vorsichtig die Flügeldisken ab. Platzieren Sie danach die Gehirne in der Nähe der Flügeldisken, um sie vor dem Zerquetschen durch die Deckglasplatte zu schützen. Bedecken Sie die Strukturen nun vorsichtig mit einer Deckglasplatte und verschließen Sie diese mit Nagellack.Bewahren Sie den Objektträger bei vier Grad Celsius auf. Öffnen Sie nach der Aufnahme der konfokalen Z-Stapel-Bilder mit einem konfokalen Mikroskop diese in ImageJ, und verwenden Sie den Befehl „Reslice“, um virtuelle Schnitte zu erstellen. Diese können entlang der X-Z-Achse, der Y-Z-Achse oder in einer benutzerdefinierten Ebene angefertigt werden.Um die benutzerdefinierte Ebene zu erstellen, zeichnen Sie eine gerade Linie oder ein Rechteck auf das Z-Stack-Bild und folgen Sie den Anweisungen, damit der Computer den entsprechenden Schnitt generiert. Verwenden Sie solche Schnitte, um das Gewebe auf Tumorphänotypen zu untersuchen. Identifizieren Sie zunächst Zellverbände, die von der Hauptepithelschicht abweichen oder ein Überwachsen aufweisen.Anschließend für jede Masse bestimmen, ob die subzelluläre Lokalisation der Kontaktproteine normal erscheint. Weitere Aspekte sind die Größe der Masse sowie Hinweise auf eine erhöhte Zellproliferation innerhalb der Masse. So wird der Tumortyp identifiziert.In diesem Beispiel wurden vier Klone anhand vertikaler Schnitte, die von der Bildgebungssoftware erstellt wurden, klassifiziert. Zwei wurden als Dysplasie eingestuft, da das markierte DLG-Protein fehllokalisiert war. Der Klon B umfasst weniger als vier Zellen, und der Klon C weicht nicht vom Epithel ab.Daher wurden weder B noch C als Neoplasie klassifiziert. Die beiden anderen Klone zeigten ebenfalls eine Fehllokalisation von DLG und bildeten tumoröse Zellverbände außerhalb des Epithels. Da der Durchmesser dieser verlagerten tumorösen Klone mehr als vier Zellen betrug, wurden diese Klone als neoplastisch eingestuft.Mithilfe der beschriebenen Methoden wurde das Gen LGL in der Flügelanlage und den Gelenkregionen mittels sd-GAL4-gesteuerter RNAi herunterreguliert. Bei Kontrollen ohne das RNAi-Transgen wurden keine morphologischen Veränderungen in den Flügelscheiben des dritten Larvenstadiums beobachtet. Bei den Herunterregulierungen waren epitheliale Deformationen und tumorartige Überwucherungen in bestimmten Bereichen des Gelenks deutlich sichtbar.Jedoch wurde im Bereich des Flügelanlagen eine dysplastische Überwucherung nicht beobachtet. Dies korrelierte umgekehrt mit der MMP1-Expression in diesen Regionen: einem Protein, das metastatische Fähigkeit verleiht. Um das Fortschreiten des Tumorwachstums nach Absenkung von LGL zu überwachen, wurden sporadische Klone, die LGL-RNAi exprimieren, in Flügelscheiben wie beschrieben erzeugt.Zwei Tage nach der Hitzeschockbehandlung von Larven im zweiten Instar zeigten einige Knock-down-Klone im Scharnierbereich eine Abweichung von der apikalen Seite der Epithelschicht. Vier Tage nach der Hitzeschockinduktion wurden dysplastische Läsionen im Scharnierbereich deutlich sichtbar, was darauf hindeutet, dass LGL-Knock-down-Klone, die von der apikalen Seite verdrängt wurden, im Lumen proliferieren. Sieben Tage nach der Hitzeschockinduktion dominierten tumorartige Überwucherungen die Scharnierbereiche.Bei der Verwendung von Flip-out-GAL4-Systemen ist es wichtig, den Einfluss einer veränderten Hitzeschock-Zeitplanung auf die klonalen Phänotypen zu untersuchen, da die tumorogene Potenz von Imaginalplatten-Zellen möglicherweise von der Entwicklungsstufe, endogenen Signalereignissen oder der zellulären Differenzierung abhängt.

induction-diagnosis-tumors-drosophila-imaginal-disc

Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

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