Name: Isolierung von Typ I und Typ II Perizyten aus Maus Skelettmuskeln (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: Lernen Sie die FACS-basierte Isolierung von Typ I und Typ II Perizyten aus Maus-Skelettmuskeln. Diese Methode ermöglicht die gleichzeitige Trennung beider Subpopulationen ohne spezifische Transgene und erleichtert die Untersuchung ihrer biologischen Unterschiede.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Diese Arbeit wurde teilweise von einem Fund-A-Fellow-Stipendium der Myotonic Dystrophy Foundation (MDF-FF-2014-0013) und dem Scientist Development Grant von der American Heart Association (16SDG29320001) unterstützt.

Wildtype und Nestin-GFP-transgene Mäuse wurden in der Tierfabrik an der University of Minnesota untergebracht. Alle experimentellen Verfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee an der University of Minnesota genehmigt und waren im Einklang mit dem NIH Guide für die Pflege und Verwendung von Labortieren. 1. Muskel-Dissektion und Einzelzell-Isolation <ol><li> Euthanisieren erwachsene Mäuse (6-10 Wochen, männlich und weiblich) mit Tribromethanol (250 mg / kg, ip) und sterilisieren ihre Bauchhaut mit 70% Ethanol. HINWEIS: Tribromethanol wurde hier anstelle von Ketamin für Anästhesie / Euthanasie verwendet, da Ketamin bekannt ist, mit den NMDA-Rezeptoren zu interagieren, was möglicherweise Auswirkungen auf die Studie haben könnte. </li><li> Legen Sie die Mäuse in die Rückenlage und verwenden Sie ein Skalpell, um einen horizontalen Schnitt auf der Bauchhaut zu machen. Ziehen Sie die Haut von Hand ab und ziehen Sie in entgegengesetzte Richtungen, um die Hinterbeinmuskeln auszusetzen. </li><li> CollecDie Muskeln von beiden Hinterbeinen mit Pinzette und Schere. Lagern Sie sie in steriler Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS), ergänzt mit 1% Penicillin-Streptomycin (P / S) auf Eis. </li><li> Waschen Sie die seziertes Hindlimb-Muskeln in eiskaltem PBS, das mit 1% P / S zweimal ergänzt wird, und übertragen Sie es auf eine sterile 10 cm Platte. </li><li> Sorgfältig sezieren Nerven, Blutgefäße und Bindegewebe aus den Muskeln mit Pinzette und Schere unter einem Seziermikroskop bei 2facher Vergrößerung. </li><li> Die Muskeln in kleine Stücke (1-2 mm 3 ) mit sterilen Scheren und Klingen fein hacken und zerkleinern. Wenn nötig, füge eine kleine Menge Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) hinzu, um sicherzustellen, dass die Muskeln nicht ausgetrocknet sind. </li><li> Mechanisch das Gewebe durch Pipettieren auf und ab durch eine 10 mL serologische Pipette 10 mal brechen. </li><li> Fügen Sie frisch hergestellte Verdauungslösung (DMEM, ergänzt mit 0,2% Typ 2 Kollagenase) zu der Mischung hinzu. Inkubieren bei 37 ° C für 2 h mit GentlAufregung bei 35 Umdrehungen / min. </li><li> Triturat unter Verwendung einer 18 G-Nadel, um die Mischung zu homogenisieren. Dann bei 500 xg für 5 min zentrifugieren. Den Überstand verwerfen und dann das Pellet in 0,25% Trypsin / EDTA resuspendieren. Inkubieren bei 37 ° C für 10 min. Wiederholen Sie den Zentrifugationsschritt zwei weitere Male. </li><li> Zugabe von 10 ml DMEM, ergänzt mit 20% fötalem Rinderserum (FBS) zur Lösung und zentrifugieren bei 500 xg für 5 min. Den Überstand verwerfen und das Pellet in rotem Blutzellen-Lysepuffer (155 mM NH 4 Cl, 10 mM KHCO 3 und 0,1 mM EDTA) resuspendieren. </li><li> Zentrifuge bei 500 xg für 5 min. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in Sortierpuffer (20 mM HEPES, pH 7,0, 1 mM EDTA und 1% BSA in Ca / Mg 2+ -freiem PBS, pH 7,0). Filtriere die Mischung durch einen 40 μm-Zellsieb, um eine Einzeller-Suspension zu erhalten. </li><li> Zentrifuge bei 500 xg für 5 min. Den Überstand verwerfen und das Pellet in 1 ml Sortierpuffer resuspendieren. </li><li> Zähle dieZellzahl mit einem Hämocytometer und verdünnen die Einzeller-Suspension auf 5 x 10 6 / ml in Sortierpuffer. </li></ol> 2. Zellfärbung und Sortierung <ol><li> Bereiten Sie die Kontrollen und die Probe wie in Tabelle 1 beschrieben vor. Färben Sie die Einzelzellsuspension mit den jeweiligen Antikörpern auf Eis für 30 min, wie in Tabelle 1 beschrieben. </li><li> Bei 500 xg für 5 min zentrifugieren und die Pellets zweimal mit Sortierpuffer waschen. </li><li> Fügen Sie DAPI zu den Einzelzelllösungen hinzu, wie in Tabelle 1 angegeben. Verwenden Sie für die DAPI-Einfarbenkontrolle 5 μg / ml DAPI (Endkonzentration) und 1 μg / ml DAPI für die PDGFRβ-PE-FMO-Kontrolle und die Probe. Halten Sie alle Röhren auf Eis während des Experiments. </li><li> Schalten Sie den Sortierer und die Software ein. Scannen und Einfügen eines 100 μm Sortierchips, wenn Sie dazu aufgefordert werden. </li><li> Führen Sie die automatische Einrichtung ( dh Chip-Ausrichtung, Tröpfchen-Kalibrierung, Seitenstrom-Kalibrierung und Sortierverzögerung KalibrierungOn) durch Laden der automatischen Setup-Perlen, wenn Sie dazu aufgefordert werden. </li><li> Wenn das automatische Setup abgeschlossen ist, gehen Sie auf die Registerkarte &quot;Experiment&quot;, klicken Sie auf &quot;Neu&quot; und wählen Sie die &quot;Leere Vorlage&quot; aus &quot;Öffentliche Vorlagen&quot;. </li><li> Unter &quot;Messeinstellungen&quot; geben Sie &quot;DAPI&quot; für &quot;FL1&quot;, &quot;Nestin-GFP&quot; für &quot;FL2&quot; und &quot;PDGFRβ&quot; für &quot;FL3&quot; ein. Deaktivieren Sie die Felder für &quot;FL4&quot; - &quot;FL6&quot;. </li><li> Überprüfen Sie die Kästchen, um die 405, 488 und 561 Laser zu aktivieren und klicken Sie auf &quot;Neues Experiment erstellen&quot;. </li><li> Wählen Sie den &quot;Start Compensation Wizard&quot; -Option und folgen Sie den &quot;Compensation Wizard&quot; Software-Aufforderungen, um die Kompensation einzurichten. <ol><li> Laden Sie das ungefärbte Steuerelement und klicken Sie auf &quot;Start&quot;. Klicken Sie auf &quot;Detector &amp; Threshold Settings&quot; und stellen Sie die Sensorverstärkung der FSC- und BSC-Detektoren ein, um die Population auf die Waage zu stellen. </li><li> AnzeigeNur die Verstärkungsstufen der FL1-FL3 Fluoreszenzkanäle, um die negativen Populationen auf der linken Seite der Histogramme zu platzieren. Klicken Sie auf die Schaltfläche &quot;Record&quot;, um die Daten aufzuzeichnen. </li><li> Laden Sie einfarbige Kontrollen eins nach dem anderen, wenn Sie dazu aufgefordert werden. Klicken Sie auf &quot;Start und Record&quot;, um die Daten aufzuzeichnen. Passen Sie die Tore für die positiven Populationen an den Histogrammen an. Weiter klicken.&quot; </li><li> Gehen Sie auf &quot;Matrix berechnen&quot; auf der Registerkarte &quot;Kompensation&quot; und klicken Sie im Feld &quot;Berechnungsberechnung berechnen&quot; auf &quot;Berechnen&quot;, um die Kompensation durchzuführen. Klicken Sie auf &quot;Finish&quot;, um den &quot;Compensation Wizard&quot; zu verlassen. </li></ol></li><li> Laden Sie das PDGFRβ-PE-FMO-Steuerelement und klicken Sie auf &quot;Start&quot;. Zeichnen Sie ein Polygon-Tor (Gate A) um die Zellen von Interesse unter dem &quot;All Events&quot; -Plot. </li><li> Doppelklicken Sie auf Gate A, um ein Kind zu erstellen. Ändern Sie die Y-Achse in DAPI und zeichnen Sie ein Polygon-Gate (Gate B) um lebende (DAPI- low ) Zellen. Doppelklicken Sie auf iNside Gate B, um ein Kind zu erstellen. Ändern Sie die X-Achse in FSC-H und die Y-Achse in FSC-W und ziehen Sie ein Polygon-Gate (Gate C) um die Singlets, um Dubletten zu eliminieren. </li><li> Doppelklicken Sie auf Gate C, um ein Kind zu erstellen. Ändern Sie die X-Achse zu Nestin-GFP und die Y-Achse zu PDGFRβ-PE. Klicken Sie auf die Schaltfläche &quot;Record&quot;, um die Daten aufzuzeichnen. </li><li> Laden Sie die Probe und wiederholen Sie die Schritte 2.11-2.12. Nach der Aufnahme klicken Sie auf &quot;Pause&quot;, um das Sample zu behalten. </li><li> Definieren Sie die Gating-Grenzen für PDGFRβ + und Nestin-GFP + -Zellen auf Basis der PDGFRβ-PE-FMO-Kontrolle. Zeichnen Sie Tore für die PDGFRβ + Nestin-GFP- und PDGFRβ + Nestin-GFP + Populationen. </li><li> Unter &quot;Sortiermethode&quot; wählen Sie &quot;2-Wege-Tubes&quot; und weisen &quot;PDGFRβ + Nestin-GFP-&quot; - und &quot;PDGFRβ + Nestin-GFP + &quot; Zellen den linken und rechten Sammelröhren zuGesund Montieren Sie die Sortierpuffer-gefüllten 15 ml Sammelröhrchen auf der Sammelstufe und klicken Sie auf die Schaltfläche &quot;Sammlung laden&quot;. </li><li> Klicken Sie auf die Schaltfläche &quot;Fortsetzen&quot;, um das Sample zu beenden. Klicken Sie auf &quot;Start Sort&quot;, um PDGFRβ + Nestin-GFP - (Typ I Perizyten) und PDGFRβ + Nestin-GFP + (Typ II Perizyten) Zellen zu sammeln. </li></ol> 3. Nachsortierung von Analysen <ol><li> Die sortierten Zellen bei 500 xg für 5 min zentrifugieren, das Pellet in 1 ml Pericyt- Medium resuspendieren (siehe Materialtabelle ) und die Zelldichte mit einem Hämocytometer zählen. </li><li> Samen Typ I und Typ II Perizyten auf Poly-D-Lysin (PDL) -beschichtete Deckgläser bei ~ 1 x 10 4 Zellen / cm 2 . In Perizy-Medium für 3 Tage bei 37 ° C mit 5% CO 2 wachsen. </li><li> Am Tag 3 untersuchen Sie die Perizy-Morphologie (unter Phasenkontrast) und die endogene Nestin-GFP-Expression mit einem fluoreszierenden MikroUmfang (Anregungslaser: 488 nm, Anregungsfilter: 470/40 nm und Emissionsfilter: 515/30 nm). Nehmen Sie Bilder unter einem 20X Ziel (0.45 NA). </li><li> Ersetzen Sie das Pericyt-Medium durch adipogene (Maus-MSC-basale Medium + adipogene stimulatorische Ergänzung) und myogenes (DMEM + 2% Pferdeserum) Medium, um adipogene und myogene Differenzierung zu initiieren, wie zuvor beschrieben 20 . Ändern Sie das Medium alle 2-3 Tage. </li><li> Fixieren Sie die Zellen am Tag 17 (14 Tage nach adipogener / myogener Differenzierung) in 4% Paraformaldehyd (PFA) für 20 min bei Raumtemperatur. HINWEIS: Vorsicht, PFA ist ein Karzinogen. </li><li> Führen Sie die Immunzytochemie gegen Perilipin (Adipozytenmarker) und S-Myosin (reifer Myotube / Myofaser-Marker) durch, wie in früheren Publikationen 19 , 20 beschrieben. <ol><li> Die festen Zellen 3 mal in PBS für 10 min bei Raumtemperatur waschen. </li><li> Blockierpuffer hinzufügen (PBSErgänzt mit 5% Eselserum, 3% BSA und 0,3% Triton X-100) und bei Raumtemperatur 1 h inkubieren. </li><li> Inkubieren Sie die Zellen mit Anti-Perilipin (2 &amp; mgr; g / ml) und / oder Anti-S-Myosin (2 &amp; mgr; g / ml) Antikörper bei 4 ° C über Nacht. </li><li> Die Zellen 3 mal in PBS für 10 min bei Raumtemperatur waschen. </li><li> Inkubieren Sie die Zellen mit Alexa 555 Esel Anti-Kaninchen (4 μg / ml) und / oder Alexa555 Esel Anti-Maus (4 μg / ml) Antikörper bei Raumtemperatur für 1 h. </li><li> Die Zellen 3 mal in PBS für 10 min bei Raumtemperatur waschen. </li><li> Montieren Sie die immunfärbenden Zellen mit dem DAPI enthaltenden Befestigungsmedium (siehe Tabelle der Materialien). Untersuchen Sie die Perilipin- und S-Myosin-Expression mit einem Fluoreszenzmikroskop (Anregungslaser: 543 nm, 540/45 nm Anregung und 600/50 nm Emission) und nehmen Sie Bilder unter einem 40X-Objektiv (0,60 NA) auf. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Rennert, R. C., Sorkin, M., Garg, R. K., Gurtner, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+recruitment+after+injury%3A+lessons+for+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Regenerative+medicine%22%5BJournal%5D)">Stem cell recruitment after injury: lessons for regenerative medicine.</a> Regenerative medicine. 7 (6), 833-850 (2012).</li>
<li>Sambasivan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pax7-expressing+satellite+cells+are+indispensable+for+adult+skeletal+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Pax7-expressing satellite cells are indispensable for adult skeletal muscle regeneration.</a> Development. 138 (17), 3647-3656 (2011).</li>
<li>Relaix, F., Zammit, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+cells+are+essential+for+skeletal+muscle+regeneration%3A+the+cell+on+the+edge+returns+centre+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Satellite cells are essential for skeletal muscle regeneration: the cell on the edge returns centre stage.</a> Development. 139 (16), 2845-2856 (2012).</li>
<li>von Maltzahn, J., Jones, A. E., Parks, R. J., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pax7+is+critical+for+the+normal+function+of+satellite+cells+in+adult+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Pax7 is critical for the normal function of satellite cells in adult skeletal muscle.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (41), 16474-16479 (2013).</li>
<li>Lepper, C., Partridge, T. A., Fan, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+absolute+requirement+for+Pax7-positive+satellite+cells+in+acute+injury-induced+skeletal+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">An absolute requirement for Pax7-positive satellite cells in acute injury-induced skeletal muscle regeneration.</a> Development. 138 (17), 3639-3646 (2011).</li>
<li>Kuang, S., Charge, S. B., Seale, P., Huh, M., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+roles+for+Pax7+and+Pax3+in+adult+regenerative+myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Distinct roles for Pax7 and Pax3 in adult regenerative myogenesis.</a> J Cell Biol. 172 (1), 103-113 (2006).</li>
<li>Murphy, M. M., Lawson, J. A., Mathew, S. J., Hutcheson, D. A., Kardon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+cells%2C+connective+tissue+fibroblasts+and+their+interactions+are+crucial+for+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Satellite cells, connective tissue fibroblasts and their interactions are crucial for muscle regeneration.</a> Development. 138 (17), 3625-3637 (2011).</li>
<li>Morgan, J. E., Pagel, C. N., Sherratt, T., Partridge, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+persistence+and+migration+of+myogenic+cells+injected+into+pre-irradiated+muscles+of+mdx+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurol+Sci%22%5BJournal%5D)">Long-term persistence and migration of myogenic cells injected into pre-irradiated muscles of mdx mice.</a> J Neurol Sci. 115 (2), 191-200 (1993).</li>
<li>Beauchamp, J. R., Morgan, J. E., Pagel, C. N., Partridge, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+myoblast+transplantation+reveal+a+discrete+minority+of+precursors+with+stem+cell-like+properties+as+the+myogenic+source%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamics of myoblast transplantation reveal a discrete minority of precursors with stem cell-like properties as the myogenic source.</a> J Cell Biol. 144 (6), 1113-1122 (1999).</li>
<li>Partridge, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invited+review%3A+myoblast+transfer%3A+a+possible+therapy+for+inherited+myopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Invited review: myoblast transfer: a possible therapy for inherited myopathies.</a> Muscle Nerve. 14 (3), 197-212 (1991).</li>
<li>Montarras, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+isolation+of+satellite+cells+for+skeletal+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration.</a> Science. 309 (5743), 2064-2067 (2005).</li>
<li>Asakura, A., Seale, P., Girgis-Gabardo, A., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myogenic+specification+of+side+population+cells+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Myogenic specification of side population cells in skeletal muscle.</a> J Cell Biol. 159 (1), 123-134 (2002).</li>
<li>Tamaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle-derived+CD34%2B%2F45-+and+CD34-%2F45-+stem+cells+are+situated+hierarchically+upstream+of+Pax7%2B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle-derived CD34+/45- and CD34-/45- stem cells are situated hierarchically upstream of Pax7+ cells.</a> Stem Cells Dev. 17 (4), 653-667 (2008).</li>
<li>Dellavalle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes+resident+in+postnatal+skeletal+muscle+differentiate+into+muscle+fibres+and+generate+satellite+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Pericytes resident in postnatal skeletal muscle differentiate into muscle fibres and generate satellite cells.</a> Nat Commun. 2, 499(2011).</li>
<li>Mitchell, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+a+non-satellite+cell+muscle+resident+progenitor+during+postnatal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of a non-satellite cell muscle resident progenitor during postnatal development.</a> Nat Cell Biol. 12 (3), 257-266 (2010).</li>
<li>Pannerec, A., Formicola, L., Besson, V., Marazzi, G., Sassoon, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+skeletal+muscle+resident+progenitors+and+their+cell+fate+potentials%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Defining skeletal muscle resident progenitors and their cell fate potentials.</a> Development. 140 (14), 2879-2891 (2013).</li>
<li>Dellavalle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes+of+human+skeletal+muscle+are+myogenic+precursors+distinct+from+satellite+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Pericytes of human skeletal muscle are myogenic precursors distinct from satellite cells.</a> Nat Cell Biol. 9 (3), 255-267 (2007).</li>
<li>Kostallari, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes+in+the+myovascular+niche+promote+post-natal+myofiber+growth+and+satellite+cell+quiescence%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Pericytes in the myovascular niche promote post-natal myofiber growth and satellite cell quiescence.</a> Development. 142 (7), 1242-1253 (2015).</li>
<li>Birbrair, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+pericytes+in+skeletal+muscle+regeneration+and+fat+accumulation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Role of pericytes in skeletal muscle regeneration and fat accumulation.</a> Stem Cells Dev. 22 (16), 2298-2314 (2013).</li>
<li>Yao, Y., Norris, E. H., Mason, C. E., Strickland, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminin+regulates+PDGFRbeta%28%2B%29+cell+stemness+and+muscle+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Laminin regulates PDGFRbeta(+) cell stemness and muscle development.</a> Nat Commun. 7, 11415(2016).</li>
<li>Armulik, A., Genove, G., Betsholtz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes%3A+developmental%2C+physiological%2C+and+pathological+perspectives%2C+problems%2C+and+promises%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Pericytes: developmental, physiological, and pathological perspectives, problems, and promises.</a> Dev Cell. 21 (2), 193-215 (2011).</li>
<li>Dore-Duffy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes%3A+pluripotent+cells+of+the+blood+brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Pharm+Des%22%5BJournal%5D)">Pericytes: pluripotent cells of the blood brain barrier.</a> Curr Pharm Des. 14 (16), 1581-1593 (2008).</li>
<li>Dore-Duffy, P., Katychev, A., Wang, X., Van Buren, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CNS+microvascular+pericytes+exhibit+multipotential+stem+cell+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">CNS microvascular pericytes exhibit multipotential stem cell activity.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 26 (5), 613-624 (2006).</li>
<li>Birbrair, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+pericyte+subtypes+differ+in+their+differentiation+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle pericyte subtypes differ in their differentiation potential.</a> Stem Cell Res. 10 (1), 67-84 (2013).</li>
<li>Gautam, J., Nirwane, A., Yao, Y. Laminin differentially regulates the stemness of type I and type II pericytes. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 28(2017).</li>
<li>Birbrair, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes%3A+multitasking+cells+in+the+regeneration+of+injured%2C+diseased%2C+and+aged+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Aging+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Pericytes: multitasking cells in the regeneration of injured, diseased, and aged skeletal muscle.</a> Front Aging Neurosci. 6, 245(2014).</li>
</ol>

Alle Autoren haben keinen Interessenkonflikt zur Offenlegung.

Perizythen sind multipotenten perivaskulären Zellen 22 , 23, die sich auf der abluminalen Oberfläche der Kapillaren 21 , 26 befinden . In Skelettmuskeln können Perizyten entlang der adipogenen und / oder myogenen Wege 19 , 20 , 24 differenzieren. Jüngste Studien zeigten zwei Subpopulationen von Perizyten mit unt...

Muskeldystrophie ist eine Muskel-degenerative Erkrankung, die bisher keine wirksamen Behandlungen hat. Die Entwicklung von Therapien, die die Geweberegeneration fördern, war schon immer von großem Interesse. Geweberegeneration und Reparatur nach Schädigung hängen von residenten Stammzellen / Vorläuferzellen ab 1 . Satellitenzellen sind myogene Vorläuferzellen, die zur Muskelregeneration beitragen 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 . Ihre klinische Anwendung wird jedoch durch ihre begrenzte Migration und niedrige Überlebensrate nach der Injektion sowie durch ihre verminderte Differenzierungsfähigkeit nach in vitro Verstärkung 8 , 9 , 10 , 11 behindert. Zusätzlich zu satelliTe-Zellen, Skelettmuskeln enthalten auch viele andere Zellpopulationen mit myogenem Potenzial 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , wie Plättchen-abgeleitete Wachstumsfaktor-Rezeptor-beta (PDGFRβ) -positive interstitielle Zellen. Es gibt Hinweise darauf, dass Muskel-abgeleitete PDGFRβ + -Zellen in der Lage sind, sich in myogene Zellen zu differenzieren und die Muskelpathologie und die Funktion 14 , 17 , 18 , 19 , 20 zu verbessern. PDGFRβ dominiert überwiegend Perizyten 21 , die perivaskuläre Zellen mit Pluripotenz 22 , 23 sind . Zusätzlich zu PDGFRβ werden auch viele andere Marker, darunter Neuron-Glial 2 (NG2) und CD146, verwendetZirbeln 21 Es ist jedoch zu beachten, dass keiner dieser Marker pericytspezifisch ist. Jüngste Studien zeigten zwei Subtypen von Muskelpericyten, genannt Typ I und Typ II, die unterschiedliche molekulare Marker exprimieren und unterschiedliche Funktionen ausführen 19 , 24 , 25 . Biochemisch sind Typ I Perizyten NG2 + Nestin - , während Typ II Perizyten NG2 + Nestin + 19 , 24 sind . Funktionell können Typ I Perizyten adipogene Differenzierung unterliegen, was zur Fettansammlung und / oder Fibrose beiträgt, während Typ-Periziten des Typs II entlang des myogenen Weges differenzieren können, was zur Muskelregeneration 19 , 24 , 25 beiträgt. Diese Ergebnisse zeigen, dass: (1) Typ I Perizyten kann bE in der Behandlung von fetthaltigen degenerativen Störungen / Fibrose gezielt, und (2) Typ II Perizyten haben ein großes therapeutisches Potential für die Muskeldystrophie. Eine weitere Untersuchung und Charakterisierung dieser Populationen erfordert ein Isolationsprotokoll, das die Trennung von Typ I und Typ II Perizyten auf einem hohen Reinheitsgrad ermöglicht. Derzeit besteht die Isolierung von Pericyt-Subpopulationen auf NG2-DsRed- und Nestin-GFP-Doppel-transgenen Mäusen 19 , 24 . Die Verfügbarkeit von NG2-DsRed-Mäusen und die Qualität der meisten NG2-Antikörper begrenzen die weit verbreitete Anwendung dieser Methode. Da alle NG2 + pericytes auch PDGFRβ in den Skelettmuskeln 19 , 20 , 24 exprimieren, wird vermutet, dass NG2 durch PDGFRβ zur Isolierung von Perizyten und deren Subpopulationen ersetzt werden kann. Diese Arbeit beschreibt ein FACS-basiertes Protokoll, dasVerwendet PDGFRβ-Färbung und das Nestin-GFP-Signal. Diese Methode ist weniger anspruchsvoll für die Ermittler, weil: (1) es nicht den NG2-DsRed-Hintergrund erfordert und (2) es verwendet kommerziell erhältliche PDGFRβ-Antikörper, die gut charakterisiert sind. Darüber hinaus ermöglicht es die gleichzeitige Isolierung von Typ I und Typ II Perizyten in hoher Reinheit, was eine weitere Untersuchung der biologischen und therapeutischen Potenziale dieser Pericyt-Subpopulationen ermöglicht. Nach der Reinigung können diese Zellen in Kultur gezüchtet werden, und ihre Morphologien können sichtbar gemacht werden. Diese Arbeit zeigt auch, dass Typ I und Typ II Perizyme, die nach dieser Methode isoliert wurden, wie diejenigen, die aus doppelt-transgenen Mäusen gereinigt wurden, adipogene und myogene sind.

<table><tbody><tr><td>Cell Sorter</td><td>Sony</td><td>SH800</td><td></td></tr><tr><td>Automatic Setup Beads</td><td>Sony</td><td>LE-B3001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11995</td><td></td></tr><tr><td>Avertin</td><td>Sigma</td><td>T48402</td><td></td></tr><tr><td>Perozytenwachstumsmedium</td><td>ScienCell</td><td>1201</td><td></td></tr><tr><td>MSC Basalmedium (Maus)</td><td>Stemcell Technologies</td><td>5501</td><td></td></tr><tr><td>Adipogenes stimulierendes Nahrungsergänzungsmittel (Maus)</td><td>Stemcell Technologies</td><td>5503</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Gibco</td><td>16000</td><td></td></tr><tr><td>Pferdeserum</td><td>Sigma</td><td>H1270</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase Typ 2</td><td>Worthington</td><td>LS004176</td><td></td></tr><tr><td>0,25% Trypsin/EDTA&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>25200</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>PDL</td><td>Sigma</td><td>P6407</td><td></td></tr><tr><td>PDGFR&beta;-PE Antikörper</td><td>eBioscience</td><td>12-1402</td><td></td></tr><tr><td>Perilipin Antikörper</td><td>Sigma</td><td>P1998</td><td></td></tr><tr><td>S-Myosin Antikörper</td><td>DSHB</td><td>MF-20</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 555-anti-Kaninchen Antikörper& nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-31572</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 555-Anti-Maus-Antikörper</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-31570</td><td></td></tr><tr><td>Eindeckmedium mit DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher</td><td>BP120</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A2058</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Fisher Scientific</td><td>A661</td><td></td></tr><tr><td>KHCO3</td><td>Fisher Scientific</td><td>P184</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>18 G Nadeln</td><td>BD</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Serologische Pipette</td><td>BD</td><td>357551</td><td></td></tr><tr><td>OneComp eBeads</td><td>eBioscience</td><td>01-1111</td><td></td></tr></tbody></table>

isolierung von typ i und typ ii perizyten aus maus skelettmuskeln

Isolation of Type I and Type II Pericytes from Mouse Skeletal Muscles

Pericytes sind perivaskuläre multipotenten Zellen, die Heterogenität in verschiedenen Organen oder sogar innerhalb desselben Gewebes zeigen. In Skelettmuskeln gibt es mindestens zwei pericyte Subpopulationen (genannt Typ I und Typ II), die unterschiedliche molekulare Marker exprimieren und unterschiedliche Differenzierungsfähigkeiten aufweisen. Unter Verwendung von NG2-DsRed- und Nestin-GFP-Doppel-transgenen Mäusen wurden Typ I (NG2-DsRed + Nestin-GFP-) und Typ-II (NG2-DsRed + Nestin-GFP + ) Perizyten erfolgreich isoliert. Die Verfügbarkeit dieser doppelt-transgenen Mäuse verhindert jedoch die weit verbreitete Anwendung dieser Reinigungsmethode. Diese Arbeit beschreibt ein alternatives Protokoll, das die einfache und gleichzeitige Isolierung von Typ I und Typ II Perizyten aus Skelettmuskeln ermöglicht. Dieses Protokoll nutzt die Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) -Technik und zielt auf PDGFRβ und nicht auf NG2 zusammen mit dem Nestin-GFP-Signal. Nach der Isolation geben Sie I und ty einPe II pericytes zeigen deutliche Morphologien. Darüber hinaus sind Typ I und Typ II Perizyte, die mit dieser neuen Methode isoliert wurden, wie diejenigen, die aus den doppelt-transgenen Mäusen isoliert wurden, adipogen und myogenisch. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass dieses Protokoll verwendet werden kann, um pericyte Subpopulationen aus Skelettmuskeln und möglicherweise aus anderen Geweben zu isolieren.

FACS-Parameter, einschließlich Laserintensität und Kanalkompensation, werden auf der Grundlage der Ergebnisse der ungefärbten Steuerung und der einfarbigen Steuerung korrigiert. Die PDGFRβ-PE-FMO-Kontrolle wird verwendet, um das Gating für die PDGFRβ-PE + -Population einzustellen (Abbildung 1A ). Unter den PDGFRβ-PE - Zellen sind zwei Populationen, die Nestin-GFP + und Nestin-GFP - Zellen darstellen, klar getrennt ...

Diese Arbeit beschreibt ein FACS-basiertes Protokoll, das eine einfache und gleichzeitige Isolierung von Typ I und Typ II Perizyten aus Skelettmuskeln ermöglicht.

Isolierung von Typ I und Typ II Perizyten aus Maus Skelettmuskeln

Pericytes are perivascular multipotent cells that show heterogeneity in different organs or even within the same tissue. In skeletal muscles, there are at ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Teilpopulationen von Perizyten aus Skelettmuskeln mittels FACS zu isolieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Perizytenbiologie zu beantworten, beispielsweise, welches die biologischen Unterschiede zwischen Perizyten vom Typ I und Typ II sind. Der Hauptvorteil dieses Protokolls liegt darin, dass die gleichzeitige Isolierung von Perizyten vom Typ I und Typ II ohne Verwendung des NG2 dsRED-Transgens ermöglicht wird.Die Anwendungen dieses Protokolls beschränken sich nicht auf Skelettmuskulatur. Es kann auch zur Isolierung von Perizyten aus anderen Organen, wie dem Gehirn, verwendet werden. Zunächst wird das gewünschte Gewebe von einem nestin-GFP-transgenen Maus entnommen und anschließend zweimal in eiskalter PBS-Lösung mit Antibiotika gewaschen.Überführen Sie die Proben anschließend in eine sterile 10-Zentimeter-Platte. Schneiden Sie die Muskulatur danach mit sterilen Scheren und Klingen in feine Stücke von ein bis zwei Millimetern Kubikgröße. Falls erforderlich, geben Sie eine kleine Menge DMEM hinzu, um zu verhindern, dass das Gewebe austrocknet.Pipettieren Sie das Gewebe mehrmals mit einer 10-Millimete

isolation-of-type-i-and-type-ii-pericytes-from-mouse-skeletal-muscles

Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Dieses Video zeigt eine Methode zur Isolierung von zerebralen Perizyten aus einem Mäusegehirn. Die isolierten Zellen werden in perizytenspezifischen Medien kultiviert, um die Perizytenproliferation zu fördern.

Isolierung und Kultivierung von zerebralen Perizyten der Maus

Isolierung und Kultivierung von Muskelfasern ist der...

Isolation und Kultur der einzelnen Muskelfasern und ihre Satelliten aus adulten Skelettmuskel

Die Isolierung und Kultur einer reinen Population von ruhenden Satellitenzellen, eine Muskelstammzellpopulation, ist wesentlich für das Verständnis der Muskelstammzelle Biologie und Regeneration sowie Stammzelltransplantation bei Therapien Muskeldystrophie und anderen degenerativen Erkrankungen.

Isolierung, Kultur und Transplantation von Muskel-Satelliten-Zellen

Wir haben eine neue und reproduzierbare Technik zur primären Kulturen der Lungenarterie glatten Muskelzellen (PASMC) von Mäusen, so jung wie P7 isolieren entwickelt, wodurch eine bessere Erforschung der Signalwege in neonatalen glatten Muskelzellen Kontraktion und Relaxation beteiligt.

Isolation der Lungenarterie glatten Muskelzellen aus neugeborenen Mäusen

Mikrovaskuläre Endothelzellen der Skelettmuskulatur (MMEC) prägen die Innenwand des Muskels Kapillaren und regulieren, Austausch von Flüssigkeiten/Moleküle und Migration (Immunzellen) zwischen Blut und Muskelgewebe. Isolierung der primären murinen MMEC, ermöglicht wie hier beschrieben umfassende in-vitro-Untersuchungen des Referats"Myovascular".

Isolierung der primären murinen Skelettmuskulatur mikrovaskuläre Endothelzellen

Wir haben ein Protokoll optimiert, um murine Herzpericyten für die Grundlagenforschung und die Erforschung ihres biologischen und therapeutischen Potenzials zu isolieren und zu reinigen.

Isolierung und Reinigung von murinen Herzperizyten

Wir präsentieren ein Protokoll zur Extraktion von murinen hirnebralen Pericyten. Basierend auf einer antibiotikafreien Anreicherungs-orientierten Pericyt-Extraktion ist dieses Protokoll ein wertvolles Werkzeug für In-vitro-Studien, die eine hohe Reinheit und hohe Ausbeute bieten und somit die Anzahl der verwendeten Versuchstiere verringern.

Eine High Output-Methode zum Isolieren von zerebralen Pericyten von der Maus

Hier schlagen wir eine Methode vor, um einzelne Muskelfasern in frühen postnatalen Entwicklungsstadien aus dem homozygoten Mutanten Lamin-Mausmodell, einem sehr schweren Modell für Emery-Dreifuss-Muskeldystrophie (EDMD), effizient zu erhalten.

Single Myofiber Isolation and Culture from a Murine Model of Emery-Dreifuss Muscular Dystrophy in Early Post-Natal Development

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung von Muskelstammzellen und fibro-adipogenen Vorläuferzellen aus einzelnen Skelettmuskeln bei Mäusen. Das Protokoll umfasst die Dissektion einzelner Muskeln, die Isolierung von Stammzellen durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung, die Reinheitsbewertung durch Immunfluoreszenzfärbung und die quantitative Messung des S-Phaseneintritts mittels 5-Ethinyl-2'-Desoxyuridin-Inkorporationsassay.

Isolierung ruhender Stammzellpopulationen aus einzelnen Skelettmuskeln

Um die Perizyten des Gehirnkortikats der Maus zu erhalten, die den Anforderungen von scRNA-seq entsprechen, stellen wir ein kritisch optimiertes FACS-Protokoll auf Basis der CD13/CD31⁻-Auswahl vor. Unsere wichtigsten Verfeinerungen verbessern die Zelllebensfähigkeit und die RNA-Integrität erheblich und ermöglichen eine zuverlässige transkriptomische Profilierung.

Isolierung von Perizyten aus Mauskortikalgewebe mittels FACS zur Einzelzellsequenzierung

Dieses Protokoll bietet eine standardisierte Methode zur Isolierung und Anreicherung primärer Myoblasten aus adulten und neonatalen Mausskelettmuskeln durch Gewebedissoziation, sequentielle Filtration, Präplattierung und definierte Kulturbedingungen, wodurch die Etablierung und Pflege von satellitenzellbasierten Myoblastkulturen für nachgelagerte experimentelle Anwendungen ermöglicht wird.

Isolierung von Skelettmuskel-Satellitenzellen für In-vitro-Myogenese-Studien

Lernen Sie die FACS-basierte Isolierung von Typ I und Typ II Perizyten aus Maus-Skelettmuskeln. Diese Methode ermöglicht die gleichzeitige Trennung beider Subpopulationen ohne spezifische Transgene und erleichtert die Untersuchung ihrer biologischen Unterschiede.

Isolierung von Typ I und Typ II Perizyten aus Maus Skelettmuskeln

Weitere Videos entdecken