Name: Analyse der Histon-Antikörper-Spezifität mit Peptid-Microarrays (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Erfahren Sie, wie Peptid-Microarrays zur Profilierung der Spezifität von Histon-Antikörpern in der Chromatin-Biochemie eingesetzt werden. Diese Methode ermöglicht präzise Qualitätskontrolle für epigenetische Forschung.

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Diese Arbeit wurde zum Teil vom Van Andel Research Institute und einem Forschungsstipendium der National Institutes of Health (CA181343) an SBR unterstützt

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die Zuverlässigkeit der Antikörper in biomedizinischen Forschungsanwendungen liegt im Mittelpunkt 46 , 47 . Dies trifft besonders für die Chromatin-Biochemie zu, da die Position von Antikörpern als Schlüsselinstrumente für die Mehrheit der Techniken zur Charakterisierung der Häufigkeit und Verteilung von Histon-PTMs entwickelt wurde. Das hier vorgestellte Protokoll beschreibt eine optimierte Pipeline für die Konstruktion, Herstellung und Verwendung von Peptid-Mi...

Genomische DNA ist elegant im eukaryotischen Zellkern mit Histonproteinen verpackt, um Chromatin zu bilden. Die sich wiederholende Untereinheit von Chromatin ist das Nukleosom, das aus 147 Basenpaaren von DNA besteht, die um einen oktameren Kern von Histonproteinen - H2A, H2B, H3 und H4 1 gewickelt sind. Chromatin ist weitgehend in lose gepackten Euchromatin und fest verpackten Heterochromatin-Domänen organisiert. Der Grad der Chromatin-Verdichtung regelt das Ausmaß, in dem Protein-Maschineries auf die zugrunde liegende DNA zugreifen können, um fundamentale DNA-templated Prozesse wie Replikation, Transkription und Reparatur durchzuführen. Schlüsselregulatoren der Genomzugänglichkeit im Rahmen von Chromatin sind PTMs auf dem unstrukturierten Schwanz und Kerndomänen der Histonproteine 2 , 3 . Histone-PTMs funktionieren direkt durch die Beeinflussung der Struktur von Chromatin 4 und indirekt durchH die Rekrutierung von Leserproteinen und deren assoziierten makromolekularen Komplexen, die Chromatin-Remodeling-, Enzym- und Gerüstaktivitäten haben 5 . Studien der Histon-PTM-Funktion in den vergangenen zwei Jahrzehnten überwiegend vorschlagen, dass diese Markierungen spielen Schlüsselrollen bei der Regulierung der Zelle Schicksal, organismen Entwicklung und Krankheit Einleitung / Progression. Angetrieben durch Fortschritte in der Massenspektrometrie-basierten Proteomtechnologie wurden mehr als 20 einzigartige Histon-PTMs auf mehr als 80 verschiedenen Histonresten entdeckt 6 . Bemerkenswert ist, dass diese Modifikationen häufig in Kombinationen auftreten und im Einklang mit der &quot;Histon-Code&quot; -Hypothese sind, zeigen zahlreiche Studien, dass Leserproteine ​​auf diskrete Bereiche des Chromatins durch Erkennung spezifischer Kombinationen von Histon-PTMs 7 , 8 , 9 gerichtet sind . Eine zentrale Herausforderung, die vorwärts geht, wird es sein, dem grEine Liste von Histon-PTMs und zu bestimmen, wie spezifische Kombinationen von Histon-PTMs die mit Chromatin verbundenen dynamischen Funktionen orchestrieren. Antikörper sind die Lynchpin-Reagenzien für den Nachweis von Histon-PTMs. Als solche wurden mehr als 1.000 Histon-PTM-spezifische Antikörper kommerziell für den Einsatz in der Chromatin-Biochemie-Forschung entwickelt. Mit der rasanten Entwicklung der DNA-Sequenzierungstechnologie mit hohem Durchsatz werden diese Reagenzien ausgiebig von einzelnen Forschern und großflächigen epigenomischen &quot;Roadmap&quot; -Initiativen ( zB ENCODE und BLUEPRINT) in ChIP-seq (Chromatin-Immunpräzipitation gepaart mit Sequenzierung der nächsten Generation) eingesetzt ) Pipelines zur Erzeugung hochauflösender räumlicher Karten der Histon-PTM-Verteilung genomweit 10 , 11 . Allerdings haben jüngste Studien gezeigt, dass die Spezifität von Histon-PTM-Antikörpern sehr variabel sein kann und dass diese Reagenzien unf<html> Austretende Eigenschaften wie z. B. Off-Target-Epitop-Erkennung, starker positiver und negativer Einfluss durch benachbarte PTMs und Schwierigkeiten, die Modifikationsreihenfolge an einem bestimmten Rest ( z. B. Mono-, Di- oder Tri-Methyllysin) 12 , 13 , 14 , 15 zu unterscheiden , 16 , 17 , 18 Daher ist eine rigorose Qualitätskontrolle von Histon-PTM-spezifischen Antikörperreagenzien notwendig, um die mit diesen wertvollen Reagenzien erzeugten Daten genau zu interpretieren. Die Microarray-Technologie ermöglicht die gleichzeitige Abfrage von Tausenden von makromolekularen Wechselwirkungen in einem hochdurchsatz-, reproduzierbaren und miniaturisierten Format. Aus diesem Grund wurde eine Vielzahl von Microarray-Plattformen geschaffen, um die Protein-DNA 19 zu analysieren ,„&gt; 20, Protein-Protein - 21 und Protein-Peptid - Wechselwirkungen 22. In der Tat, Histon - Peptidchips haben als informative Plattform zur Entdeckung für Chromatin - Biochemie Forschung entstanden, Hochdurchsatz - Profilierung der Autoren, Radiergummis ermöglicht, und die Leser von Histon PTM 15 , 23 , 24 und auch für die Analyse der Histon-Antikörper-Spezifität 17 , 25. Über ihre Anwendung in der Chromatin- und Epigenetikforschung hinaus haben Histon-Peptid-Arrays potentielle Nutzen als diagnostischer / prognostischer Test für systemischen Lupus erythematodes und andere Autoimmunkrankheiten, bei denen Anti- Chromatin-Autoantikörper werden erzeugt 26 , 27 . Hier beschreiben wir eine integrierte Pipeline, die wir für die Konstruktion, Fertigung und Ausführung entwickelt habenRindende Histon-Peptid-Mikroarrays zur Erzeugung von Spezifitätsprofilen für Antikörper, die Histone und ihre PTMs erkennen. Die Pipeline wird von ArrayNinja erleichtert, ein Open-Source, interaktive Software - Anwendung , die wir vor kurzem entwickelt, die die Design- und Analysestufen Microarray - Experimente 28 integriert. ArrayNinja funktioniert am besten in Google Chrome. Kurz gesagt wird ein Roboter-Kontakt-Mikroarray-Drucker verwendet, um eine Bibliothek von Biotin-konjugierten Histon-Peptiden an definierten Positionen auf Streptavidin-beschichteten Glasmikroskop-Objektträgern abzuscheiden. Arrays können dann in einem kompetitiven und parallelen Assayformat verwendet werden, um Antikörper-Epitop-Wechselwirkungen abzufragen ( Abbildung 1 ). Die Peptidbibliothek besteht aus Hunderten von einzigartigen synthetischen Peptiden, die PTMs (Lysinacetylierung, Lysin / Arginin-Methylierung und Serin / Threonin-Phosphorylierung) allein und in relevanten Kombinationen, die weitgehend von Proteomik-Datensätzen abgeleitet sind, beherbergen. Methoden zur Peptidsynthese und Validierung<html> Sind an anderer Stelle bekannt 23 . Daten, die aus unseren laufenden Histon-PTM-Antikörper-Screening-Bemühungen unter Verwendung dieser Array-Plattform generiert werden, werden auf einer öffentlichen Webressource, der Histone Antibody Specificity Database (www.histoneantibodies.com) archiviert. Bemerkenswerterweise wurden auch Histon-Peptid-Mikroarrays, die mit Variationen dieses Protokolls hergestellt wurden, ausgiebig verwendet, um die Aktivität der Histon-PTM-Leserdomänen 8 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 zu charakterisieren und in jüngerer Zeit Histon zu profilieren PTM-Schriftsteller und Radiergummi-Aktivitäten 24 . /files/ftp_upload/55912/55912fig1.jpg &quot;/&gt; Abbildung 1: Karikatur Darstellung der schrittweisen Vorgehensweise zur Antikörper-Screening auf einem Histon-Peptid-Mikroarray. Biotinylierte Histon-Peptide, die definierte posttranslationale Modifikationen (rote und blaue Kreise) beherbergen, werden mit Biotin-Fluorescein auf Streptavidin-beschichtetem Glas co-gedruckt. Positive Wechselwirkungen werden als rote Fluoreszenz visualisiert. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55912/55912fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

<table><tbody><tr><td>Druckpuffer</td><td>ArrayIt</td><td>PPB</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Omnipure</td><td>2390</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin-beschichtete Glasobjektträger</td><td>Greiner Bio-one</td><td>439003-25</td><td></td></tr><tr><td>Polypropylen 384 Well-Platte</td><td>Greiner Bio-one</td><td>784201</td><td></td></tr><tr><td>Biotin-fluorescein</td><td>Sigma</td><td>53608</td><td></td></tr><tr><td>Kontakt Microarray Drucker</td><td>Aushon</td><td>2470</td><td>Aushon 2470 Microarray-Drucker</td></tr><tr><td>Kontakt-Microarray-Drucker</td><td>Genmaschinen</td><td>OmniGrid 100</td><td>OmniGrid Microarray-Drucker</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>Blocking Buffer</td><td>ArrayIt</td><td>SBB</td><td></td></tr><tr><td>Hydrophober Wachsstift</td><td>Vector Labs</td><td>H-4000</td><td>ImmEdge Hydrophober Barriere-PAP-Stift</td></tr><tr><td>Silikon Dichtung</td><td>Grace Bio-labs</td><td>622511</td><td></td></tr><tr><td>Hybridisierungsgefäß</td><td>Thermo Scientific</td><td>267061</td><td>oder ähnliches Gefäß</td></tr><tr><td>Fluoreszenzfarbstoff-konjugierter Sekundärantikörper</td><td>Life Technologies</td><td>A-21244</td><td>Alexa Fluor 647 (Anti-Kaninchen)</td></tr><tr><td>Fluoreszenzfarbstoff-konjugierter Sekundärantikörper</td><td>Life Technologies</td><td>A-21235</td><td>Alexa Fluor 647 (Anti-Maus)</td></tr><tr><td>Wachs Imprinter</td><td>ArrayIt</td><td>MSI48</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Omnipure</td><td>9490</td><td></td></tr><tr><td>Microarray Scanner</td><td>Innopsys</td><td>InnoScan 1100AL</td><td>oder gleichwertiger Microarray Scanner</td></tr><tr><td>EipTitan Histon Peptid Microarray</td><td>Epicypher</td><td>112001</td><td></td></tr><tr><td>AbSurance Pro Histon Peptid Microarray</td><td>Millipore</td><td>16668</td><td></td></tr><tr><td>MODified Histone Peptide Array</td><td>Active Motif</td><td>13001</td><td></td></tr><tr><td>Histon-Code-Peptid-Microarrays</td><td>JPT</td><td>His_MA_01</td><td></td></tr><tr><td>Wax</td><td>Royal Oak</td><td>GulfWax</td><td>für Wachsimprinter</td></tr><tr><td>Befeuchtete Microarray-Objektträger-Hybridisierungskammer</td><td>VWR</td><td>97000-284</td><td></td></tr><tr><td>Hochdurchsatz-Mikroskop für Objektträgerwaschkammer</td><td>ArrayIt</td><td>HTW</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Objektträgerzentrifuge</td><td>VWR</td><td>93000-204</td><td></td></tr><tr><td>Antikörper 1</td><td>Abcam</td><td>8898</td><td></td></tr><tr><td>Antikörper 2</td><td>Millipore</td><td>07-473</td><td></td></tr><tr><td>Biotinyliertes Histonpeptid</td><td>EpiCypher</td><td>12-0001</td><td>Beispielpeptid. Ähnliche Peptide mit verschiedenen Modifikationen sind aus verschiedenen kommerziellen Quellen erhältlich.</td></tr><tr><td>ImageMagick</td><td></td><td></td><td>https://www.imagemagick.org/script/index.php</td></tr><tr><td>ArrayNinja</td><td></td><td></td><td>https://rothbartlab.vai.org/tools/</td></tr></tbody></table>

analyse der histon-antikörper-spezifität mit peptid-microarrays

Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays

Posttranslationale Modifikationen (PTMs) auf Histonproteinen sind weitgehend untersucht für ihre Rollen bei der Regulierung der Chromatinstruktur und der Genexpression. Die Massenproduktion und -verteilung von Antikörpern, die spezifisch für Histon-PTMs sind, hat die Forschung auf diesen Markierungen stark erleichtert. Als Histon-PTM-Antikörper sind Schlüsselreagenzien für viele Chromatin-Biochemie-Anwendungen, eine rigorose Analyse der Antikörperspezifität ist notwendig für eine genaue Dateninterpretation und fortgesetzte Fortschritte auf dem Gebiet. Dieses Protokoll beschreibt eine integrierte Pipeline für die Konstruktion, Herstellung und Verwendung von Peptid-Mikroarrays zur Profilierung der Spezifität von Histon-Antikörpern. Die Design- und Analyseaspekte dieses Verfahrens werden durch ArrayNinja, ein Open-Source- und interaktives Softwarepaket, das wir vor kurzem entwickelt haben, um die Anpassung von Microarray-Druckformaten zu optimieren, erleichtert. Diese Pipeline wurde verwendet, um eine große Anzahl von kommerziell verfügbaren und weit verbreiteten Histon-PTM-Antibiotika zu screenenS und Daten aus diesen Experimenten sind frei verfügbar durch eine Online-und erweiterte Histone Antibody Specificity Database. Jenseits von Histonen kann die hier beschriebene allgemeine Methodik weitgehend auf die Analyse von PTM-spezifischen Antikörpern angewendet werden.

Dieses Protokoll wurde verwendet, um eine Peptid-Mikroarray-Plattform für die Analyse der Histon-PTM-Antikörperspezifität zu entwerfen und herzustellen. Das Array fragt eine Bibliothek von mehr als 300 einzigartigen Peptidmerkmalen (20 - 40 Reste in der Länge) ab, die viele der bekannten Kombinationen von PTMs darstellen, die auf Kern- und Variantenhistonproteinen gefunden wurden 38 . Diese Pipeline war ein Arbeitspferd für das Screening von vielen weit verbreitet...

Dieses Manuskript beschreibt Methoden zur Anwendung der Peptid-Microarray-Technologie auf die Spezifitätsprofilierung von Antikörpern, die Histone und ihre posttranslationalen Modifikationen erkennen.

Analyse der Histon-Antikörper-Spezifität mit Peptid-Microarrays

Post-translational modifications (PTMs) on histone proteins are widely studied for their roles in regulating chromatin structure and gene expression. The ...

Das Ziel dieses Videos ist es, eine integrierte Pipeline zur Konstruktion, Herstellung und Anwendung von Peptid-Mikroarrays zur Profilierung der Spezifitäten von Histon-Antikörpern zu beschreiben. Antikörper, die Histone und deren vielfältige posttranslationale Modifikationen erkennen, sind entscheidende Reagenzien in der Chromatin-Biochemieforschung. Wir setzen auf diese Werkzeuge, um unser Verständnis der Funktionen von Histonmodifikationen zu vertiefen.Aktuelle Studien zeigen Inkonsistenzen im Verhalten von Antikörpern gegen Histone auf. Da die Wahl des Antikörpers das entscheidende Element in Experimenten zur Epigenetik darstellt, sind umfassende und strenge Qualitätskontrollmaßnahmen für diese Reagenzien erforderlich. Hier stellen wir eine integrierte Pipeline vor, die wir zur Entwicklung, Herstellung und Analyse von Peptid-Mikroarrays entwickelt haben, um Spezifitätsprofile für Antikörper zu generieren, die Histone und deren posttranslationale Modifikationen erkennen.Die Pipeline wird durch Array Ninja unterstützt, eine Open-Source-Interaktive Softwareanwendung, die wir entwickelt haben und die die Design- und Analysephasen von Microarray-Experimenten integriert. Um mit dem Design der Array-Platte zu beginnen, wählen Sie unter der Überschrift „Planen eines Plattenlayouts“ den Microarray-Drucker aus, der verwendet werden soll. Geben Sie anschließend im Feld „Platte laden“ den Begriff empty ein und drücken Sie die Eingabetaste.Stellen Sie den Fleckdurchmesser auf 275 Mikrometer und den Fleckabstand auf 100 Mikrometer ein. Füllen Sie die übrigen Parameter entsprechend dem Experiment angemessen aus, wobei sichergestellt sein muss, dass das Layout ausreichend viele Wiederholungen ermöglicht. Bewegen Sie im sich ergebenden Layout-Vorschaubild die Maus über jedes eindeutige Peptid-Merkmal auf dem Objektträger und geben Sie eine Merkmalskennung in das Popup-Textfeld ein.Nachdem jedes eindeutige Merkmal gekennzeichnet wurde, klicken Sie auf „Populate“. Benennen Sie das Folienlayout und klicken Sie auf „Commit your plate“, um das Layout zu speichern und eine Karte mit den physischen Positionen jedes Merkmals auf den Quellplatten zu generieren. Gestützt durch die Karte der Quellplatte pipettieren Sie ein bis zwei Mikroliter jedes Peptidmerkmals in die vorgesehenen Vertiefungen einer oder mehrerer 384-Well-Kleinvolumentiterplatten, verdünnen jedes Merkmal 10-fach mit 1x Protein-Mikroarray-Druckpuffer, der mit 1 % Rinderserumalbumin und fünf Mikrogramm pro Mikroliter Fluorescein-markiertem Biotin ergänzt ist.Anschließend die Platten bei Raumtemperatur zwei Minuten lang mit 500 x G zentrifugieren. Danach den Abfallbehälter des Mikroarrayschreibers entleeren. Die befeuchteten Behälter mit steriler destillierter Wasser auffüllen.Geben Sie die Array-Objektträger-Parameter in der Mikroarray-Druckersoftware ein. Stellen Sie das Waschverfahren auf eine Sekunde Waschdauer mit einfacher Immersion ein, den Post-Wash auf ein erneutes Eintauchen der Pins fünfmal und die Luftfeuchtigkeit auf 60 %. Danach setzen Sie beschichtete Objektträger in die Substrat-Platinen ein. Laden Sie die Platinen in den Platinen-Elevator.Setzen Sie die Quellplatten in die Plattenhalter ein und laden Sie die Halter in den Quellplatten-Elevator. Führen Sie den Druckvorgang durch und nehmen Sie anschließend die Substratplatinen aus dem Gerät heraus. Blockieren Sie die bedruckten Objektträger 30 Minuten lang unter Schütteln mit 1x Protein-Mikroarray-Blockierpuffer.Anschließend die Objektträger 10 Minuten lang mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), pH 7,6, bei Raumtemperatur waschen. Den Waschschritt mit einer frischen PBS-Lösung wiederholen. Die Objektträger durch Zentrifugation 30 Sekunden bei Raumtemperatur trocknen.Als Nächstes einen Mikroarray-Wachsaufdrucker 30 Minuten lang auf 85 Grad Celsius vorheizen oder bis das Wachs geschmolzen ist. Danach einen Objektträger mit der bedruckten Seite nach unten in den Halter einsetzen und den Halter mit der Druckform des Aufdruckers ausrichten. Die Form mit dem Objektträger in Kontakt bringen und zwei Sekunden lang halten, anschließend den Objektträger schnell aus dem Halter entfernen und die Wachsränder überprüfen, um sicherzustellen, dass die Arrays ordnungsgemäß eingeschlossen sind.Bewahren Sie die unterteilten Objektträger bei vier Grad Celsius an einem trockenen, dunklen Ort auf. Um die Hybridisierung zu beginnen, legen Sie einen unterteilten Array-Objektträger in eine Plastikschale und bedecken Sie den Objektträger mit Hybridisierungspuffer. Puffern Sie den Objektträger 30 Minuten bei vier Grad Celsius unter leichtem Schütteln aus.Trocknen Sie den Objektträger, indem Sie ihn bei Raumtemperatur in einer Mikroarray-Zentrifuge zentrifugieren. Geben Sie anschließend je fünf Mikroliter jeder Histon-PTM-Antikörperlösung in mindestens zwei Vertiefungen des Arrays und inkubieren Sie eine Stunde bei vier Grad Celsius. Nach der Inkubation entfernen Sie die Antikörperlösung und waschen das Array dreimal mit kalter PBS, jeweils fünf Minuten lang, bei vier Grad Celsius. Als Nächstes inkubieren Sie das Array in einer Lösung mit fluoreszierend markiertem sekundärem Antikörper für 30 Minuten bei vier Grad Celsius, im Dunkeln. Waschen Sie den Objektträger dreimal wie zuvor mit kaltem PBS.Legen Sie das Array in 0,1x PBS bei Raumtemperatur, um überschüssiges Salz zu entfernen, und trocknen Sie den Objektträger durch kurze Zentrifugation bei Raumtemperatur. Bildgebungsanalyse des Objektträgers mit einem Microarray-Scanner mit einer Auflösung von mindestens 25 Mikrometern. Verwenden Sie zur Analysestart Bildverarbeitungssoftware, um die Einzelkanal-Dateien des Microarray-Scanners zusammenzuführen.Öffnen Sie anschließend Array Ninja und wählen Sie den entsprechenden Mikroarray-Drucker unter dem Header Bilder quantifizieren aus. Geben Sie den Namen des gleichen Objektträger-Layouts im Dialogfeld Platte laden ein und drücken Sie die Eingabetaste. Laden Sie die zusammengeführte Bilddatei und passen Sie Kontrast, Helligkeit und Mittelpunkt nach Belieben an.Geben Sie die Auflösung des Array-Scanners ein, passen Sie die oberen und seitlichen Ränder an, um das Folien-Layout-Raster mit dem Bild auszurichten. Um eine Reihe von Vertiefungen als Replikate zu analysieren oder eine andere selektive Analyse durchzuführen, geben Sie die Koordinaten der Vertiefungen in die Felder iPin, jPin und subA ein und drücken Sie die Eingabetaste. Klicken Sie, um die Zoomfunktion umzuschalten und ein vergrößertes Bild des Bereichs unter dem Cursor anzuzeigen.Klicken Sie anschließend auf „Spot-Suche“ und warten Sie, bis der Vorgang abgeschlossen ist. Wiederholen Sie die Suchfunktion nach Bedarf, um die Gitterkreise mittig auf den Array-Spots auszurichten. Referenzspots können durch Drücken der R-Taste ausgewählt werden, und Spots, die Schmutzpartikel aufweisen oder eine stark abweichende Morphologie zeigen, können durch Drücken der A-Taste deaktiviert werden, während der Mauszeiger über dem Spot positioniert ist.Nachdem die Hintergrund-Referenzpunkte ausgewählt und die Punkte mit Poren-Morphologie oder Kontamination deaktiviert wurden, klicken Sie auf „Populate“ und anschließend auf „Submit“, um die Quantifizierung durchzuführen. Ein Balkendiagramm und eine Tabelle werden auf einer neuen Seite angezeigt. Die Bindungsspezifitäten zweier Antikörper gegen histonische PTMs wurden mit dieser Methode evaluiert.Ein auf trimethyliertes Lysin 9 auf dem Histon H3 ausgerichtetes Antik&ouml;rper gegen eine histonische PTM erwies sich auch als bindungsf&auml;hig f&uuml;r drei andere trimethylierte Lysin-Gruppen. Eine Silylierung benachbarter Lysin-Reste beeinflusste die gezielte Bindung an Lysin 9 auf H3 positiv. Ein Antik&ouml;rper gegen eine histonische PTM, der auf trimethyliertes Lysin 4 auf dem Histon H3 abzielt, zeigte ebenfalls Wechselwirkungen mit einfach methyliertem und dimethyliertem Lysin 4 auf H3. Die Phosphorylierung der benachbarten Serinreste an Position sechs beeintr&auml;chtigte die Bindung an Lysin vier in diesem Assay negativ.Diese Pipeline wurde bereits verwendet, um viele der am häufigsten verwendeten, im Handel erhältlichen Antikörper gegen Histone zu testen, und die aus diesen Experimenten gewonnenen Daten sind über die Datenbank zur Spezifität von Antikörpern gegen Histone frei zugänglich. Abwandlungen dieser Pipeline wurden zuvor zur Analyse von Histon-Lesern, -Schreibern und -Löschern beschrieben, wodurch diese Plattform leicht für jeden beliebigen druckbaren Bibliothekstyp über die epigenetische Forschung hinaus nutzbar gemacht werden könnte. Für Nutzer, die nicht über den Zugang zu spezieller Ausrüstung verfügen, die zur Synthese von Peptiden und Herstellung von Arrays erforderlich ist, sind mehrere Plattformen für Histon-Peptid-Mikroarrays im Handel erhältlich.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

In dieser Studie beschreiben wir ein verbessertes Protokoll für eine Multiplex-Hochdurchsatz-Antikörper Mikroarray mit Lektin Detektionsverfahren, das in der Glykosylierung Profilierung spezifischer Proteine ​​verwendet werden können. Dieses Protokoll bietet zuverlässige neue Reagenzien und reduziert den Zeitaufwand, Kosten und Laborgeräte Anforderungen an das vorherige Verfahren verglichen.

Chemisch-Antikörper blockiert Microarray für Multiplex-High-Throughput-Profiling von spezifischen Protein-Glykosylierung bei Complex Samples

Dieses Video demonstriert eine Technik, die die Peptid-Microarray-Technologie anwendet, um die Spezifität von Antikörpern zu profilieren, die posttranslationale Modifikationen (PTMs) auf Histonpeptiden erkennen. Ein Microarray-Objektträger, der immobilisierte Fluorophor-konjugierte Histonpeptide mit bekannten PTM-Kombinationen enthält, wird mit Ziel-PTM-spezifischen Antikörpern behandelt. Dieser Prozess hilft dabei, die Spezifität des Antikörpers für das Ziel und seine potenzielle...

Eine Peptid-Microarray-Technologie zur Erstellung von Spezifitätsprofilen von Antikörpern

Durch die Kombination von nativen und Vernetzungs Chromatinimmunpräzipitation mit hochauflösender Massenspektrometrie ermöglicht ChroP Ansatz, um die Verbund Proteom-Architektur der Histon-Modifikationen, Varianten und Nicht-Histon-Proteine ​​synergizing bei funktionell unterschiedlichen Chromatindomänen sezieren.

Der Ansatz kombiniert ChroP ChIP und Massenspektrometrie zu sezieren Locus-spezifische Proteomik Landschaften des Chromatin

Biochemischen Assays mit rekombinanten menschlichen MHC-II-Moleküle können schnelle, quantitative Einsichten in immunogenes Epitop Identifizierung, Deletion oder Design zu schaffen. Hier wird ein Peptid-MHC-II-Bindungsassay auf 384-Well-Platten skaliert wird beschrieben. Diese kostengünstige Format ist auf den Gebieten der Protein-und Impfstoff Deimmunisierung Design und Entwicklung beweisen.

Ein hoher Durchsatz MHC II-Bindungsassay für die quantitative Analyse von Peptid-Epitope

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Ermittlung von Protein-Protein-Interaktionsstellen unter Verwendung von Peptid-Arrays

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Automatisierung von ChIP-seq Experimente Epigenetische Profile auf 10.000 HeLa-Zellen zu generieren

Peptid-Arrays, die mit der SPOT-Methode synthetisiert werden, können verwendet werden, um die Substratspezifität von Protein-Lysin-Methyltransferasen (PKMTs) zu analysieren und das Substratspektrum von PKMTs zu definieren, um ihre biologische Rolle zu verstehen. Dieses Protokoll beschreibt, wie Peptidarrays synthetisiert, mit PKMTs methyliert und die Ergebnisse analysiert werden.

Spezifitätsanalyse von Protein Lysin Methyltransferasen Mit SPOT Peptidarrays

Hier präsentieren die Autoren ein einfaches und effizientes Protokoll zur Definition eines linearen antigenen Epitops unter Verwendung eines gereinigten monoklonalen Antikörpers und Peptid-Scans durch Dot-Blot-Hybridisierung. Das identifizierte Epitop kann dann in therapeutischen und diagnostischen Anwendungen eingesetzt werden.

Peptid-Scanning-gestützte Identifizierung eines monoklonalen Antikörpers anerkannte Linear B-Zell-Epitop

Fehlanpassungen in human Leukocyte Antigen (HLA) Sequenzen zwischen Organspender und Empfänger-Paare sind die Hauptursache der Antikörper-vermittelten Ablehnung im Organ-Transplantation. Hier präsentieren wir Ihnen die Verwendung von benutzerdefinierten Antigen-Arrays, die auf einzelnen Spendern HLA Sequenzen, Anti-Spender HLA Alloantibodies in Organempfängern Sonde basieren.

Personalisierte Peptidarrays für die Erkennung von HLA Alloantibodies in Organtransplantation

Hier stellen wir ein Protokoll zur Aufreinigung von MHC-Klasse-I- und Klasse-II-Peptidkomplexen aus Maus- und humanen Zelllinien vor, das qualitativ hochwertige Immunopeptidomik-Daten liefert. Das Protokoll konzentriert sich auf die Probenvorbereitung unter Verwendung kommerziell erhältlicher Antikörper.

Immunpeptidomik: Isolierung von Maus- und humanen MHC-Klasse-I- und II-assoziierten Peptiden für die Massenspektrometrie-Analyse

Genetische Varianten im menschlichen Spindlin-Familienmitglied 4 (SPIN4) wurden kürzlich bei Patienten mit Knochenüberwucherung identifiziert, einer neuartigen Entwicklungsstörung. Ein Protokoll und neue Ergebnisse zur Beschreibung der biochemischen Identifikation modifizierter Histone im Kontext von Nukleosomen als SPIN4-bindende Substrate werden präsentiert.

Identifikation modifizierter Histone als bindende Substrate des menschlichen Spindlin-Familienmitglieds 4 (SPIN4) mittels Peptidarrays und natives Nukleosomen-Pulldowns

Erfahren Sie, wie Peptid-Microarrays zur Profilierung der Spezifität von Histon-Antikörpern in der Chromatin-Biochemie eingesetzt werden. Diese Methode ermöglicht präzise Qualitätskontrolle für epigenetische Forschung.

Analyse der Histon-Antikörper-Spezifität mit Peptid-Microarrays

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