Isolierung von menschlichen Myoblasten, Beurteilung der myogenen Differenzierung und speicherbetriebenen Kalziumeintrittsmessung

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine reine Population menschlicher Myoblasten aus der erwachsenen Skelettmuskulatur zu gewinnen. Diese Zellen werden für funktionelle Studien verwendet, wie z. B. die Beurteilung der myogenen Differenzierung und die Messung des speicherbetriebenen Kalziumeintrags. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine schnelle, einfache und reproduzierbare Isolierung von primären Myoblasten des Menschen ermöglicht.

Diese Myoblasten sind die neuen ex-vivo-Myoblasten, um die Kalzium-Signalübertragung während der Muskelregeneration zu untersuchen. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Muskelbereich zu beantworten, wie z. B. die Identifizierung der Ionenkanäle und der Transkriptionsfaktoren, die an der Muskeldifferenzierung beteiligt sind. Denn diese Methode kann Einblicke in die Genfunktionen während der myogenen Differenzierung des Menschen geben.

Es kann auch auf andere Studien angewendet werden, z. B. auf das Potenzial für die Verwendung myogener Stammzellen zur Behandlung von Muskeldystrophien. Übertragen Sie die Muskelprobe in eine sterile sechs Zentimeter große Platte, waschen Sie die Probe zweimal mit PBS. Entfernen Sie das restliche Fettgewebe und wiegen Sie die Probe.

Als nächstes fügst du Trypsin hinzu und zerkleinerst den Muskel in Stücke, die kleiner als zwei Millimeter sind. Nach dem Zerkleinern das Gewebe mit einer 10-Milliliter-Pipette in eine 200-Milliliter-Dissoziationsflasche mit einem Rührstab umfüllen, dann das gehackte Gewebe in Trypsinlösung weiter sammeln, bis die Dissoziationsflasche auf 90 Milliliter gefüllt ist. Inkubieren Sie das Gewebe nun in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius für 60 Minuten unter leichtem Rühren.

Nach einer Stunde fügen Sie 10 Milliliter FCS hinzu, um die Reaktion zu stoppen, und homogenisieren Sie das Gemisch durch Verreibung. Laden Sie nun 70-Mikron-Siebe auf zwei 50-Milliliter-Röhrchen und leiten Sie die Hälfte der Zellsuspension durch jedes Sieb, indem Sie die Suspension in die Filter pipettieren. Als nächstes machen Sie eine Suspension der Zellen in Wachstumsmedium und plättieren Sie 200.000 Zellen auf sechs Zentimeter große Platten mit vier Millilitern Medium.

Inkubieren Sie die Platten und wechseln Sie das Medium jeden dritten Tag. Nach fünf bis sieben Tagen sollten die Zellen zu 70 % bis 80 % konfluent sein, dann färben Sie sie. Spülen Sie zunächst die Platte mit konfluenten Zellen mit PBS.

Fügen Sie dann einen Milliliter Trypsinlösung hinzu und lassen Sie das Enzym drei Minuten lang einwirken. Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie zwei Milliliter Medium hinzufügen und die Zellen in einem 15-Milliliter-Röhrchen sammeln. Schleudern Sie dann die Zellen herunter und suspendieren Sie sie wieder in einem Milliliter Medium.

Nehmen Sie als Nächstes eine Zellzählung vor, während Sie die Zellen auf Eis lagern. Für die Faktenanalyse laden Sie sieben Röhrchen mit je 100.000 Zellen. Laden Sie die restlichen Zellen zum Sortieren in ein achtes Rohr.

Waschen Sie die Zellen mit einem Milliliter kaltem Faxpuffer, zentrifugieren Sie dann die Röhrchen und aspirieren und entsorgen Sie den Überstand. Fügen Sie 200 Mikroliter Faxpuffer mit den entsprechenden Antikörpern hinzu und lassen Sie die Zellen 30 Minuten lang auf Eis inkubieren. Waschen Sie die Zellen nach 30 Minuten erneut und suspendieren Sie sie erneut in 500 Mikrolitern Faxpuffer, dann sortieren Sie die Zellen mit einem Durchflusszytometer.

Nach dem Ausschluss der CD45-positiven hämatopoetischen Zellen trennen Sie die CD45-negativen Zellen basierend auf der CD56-Expression. Gatet dann die CD56-positive Population für CD34, CD144 und CD146. Analysieren Sie einen Bruchteil der sortierten Grundgesamtheit erneut, um die Reinheit zu überprüfen.

Ziehen Sie nun die menschlichen Myoblasten und waschen Sie sie mit fünf Millilitern Medium. Suspendieren Sie sie dann wieder in einem Milliliter Medium. Übertragen Sie die Suspension auf eine sechs Zentimeter große Platte mit vier Millilitern Medium und inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius mit 7 % Kohlendioxid.

Für dieses Verfahren werden Myoblasten kultiviert und frisches Transvektionsmedium hergestellt. Inkubieren Sie das Medium 15 bis 20 Minuten bei Raumtemperatur. Bereiten Sie während der mittleren Inkubation die Myoblasten vor.

Spülen Sie sie zuerst einmal mit PBS aus. Anschließend trypsinisieren Sie die adhärenten Zellen. Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie zwei Milliliter Medium hinzufügen.

Sammeln Sie dann die Zellen in einem 50-Milliliter-Röhrchen. Schleudern Sie sie herunter und suspendieren Sie sie wieder in einem Milliliter Medium. Bereiten Sie für jede Transvektion 500.000 Zellen in 200 Mikrolitern Medium vor.

Zu je 500 Mikrolitern Transvektionsmedium wird ein Aliquot von 200 Mikrolitern Zellen gegeben und dann mit nur zwei Hüben der Pipettenpistole gemischt. Lassen Sie die Reaktionen dann fünf Minuten lang bei Raumtemperatur ablaufen. Nach fünf Minuten werden die Reaktionen auf 3,5 Zentimeter große Kulturschalen übertragen, die jeweils einen gläsernen Deckglas enthalten.

Fügen Sie dann 1,3 Milliliter Medium hinzu, um ein Endvolumen von zwei Millilitern zu erhalten, und inkubieren Sie die Schalen. Nach 48 Stunden Differenzierung können die Zellen immungefärbt oder mittels Calcium-Imaging analysiert werden. Waschen Sie die Zellen bei beiden Optionen zunächst zweimal vorsichtig mit einem Milliliter PBS bei Raumtemperatur zum Waschen.

Versuchen Sie, ein Ablösen der Myotuben zu vermeiden. Für eine Calcium-Bildgebung bedecken Sie die gewaschenen Zellen mit zwei mikromolaren Fura-2 AM plus einer mikromolaren Threonsäure in calciumhaltigem Medium. Lassen Sie sie dann etwa 30 Minuten inkubieren, bevor Sie sie mischen.

Waschen Sie die Zellen anschließend zweimal mit unmodifiziertem kalziumhaltigem Medium und inkubieren Sie sie dann 10 bis 15 Minuten lang für die Veresterung. Entfernen Sie nun das Deckglas von einer Kulturplatte und setzen Sie es in die Experimentierkammer ein. Beladen Sie die Kammer mit kalziumhaltigem Medium, legen Sie es unter ein Mikroskop und starten Sie dann die Datenaufzeichnung.

Fura-2 wird abwechselnd bei 340 und 380 Nanometern angeregt. Das Emissionslicht wird bei 510 Nanometern gesammelt. Tauchen Sie die 340 Nanometer Nanometer Bilder durch die 380 Bilder, liefert die Bildverhältnisse, da die Schwankungen und die Kalziumkonzentration relativ gering sind, erfassen Sie alle zwei Sekunden ein Bildverhältnis.

Ersetzen Sie nach zwei oder drei Minuten das Medium durch ein kalziumfreies Medium. Überwachen Sie dann für ein bis zwei Minuten die Aktivität des im Speicher betriebenen Kalziums in den Zellen. Als nächstes fügen Sie den Zellen ein mikromolares Thapsigargin hinzu, um ihre internen Kalziumspeicher zu erschöpfen.

Warten Sie acht bis 10 Minuten, ersetzen Sie dann schnell das Medium durch das kalziumhaltige Medium und zeichnen Sie fünf Minuten lang auf, während Kalzium über die Suzessionskanäle in die Zellen gelangt. Analysieren Sie nach dem Beenden des Experiments die Bilder. Wählen Sie einen Bereich aus, in dem sich keine Zellen für Region eins befinden, der den Hintergrund definiert, und wählen Sie dann einen Bereich im Zytoplasma für Region zwei aus.

Die beiden Regionen können auf jedem der Bilder in der Serie gezeichnet werden. Gehen Sie als Nächstes auf die Registerkarte Experimente ausführen und wählen Sie Referenzbilder für die Kanäle 340 und 380 aus, wählen Sie Region eins aus und klicken Sie dann auf Hintergrund subtrahieren. Führen Sie nun das gesamte Experiment aus, um den Hintergrund aus allen Bildern zu entfernen.

Wenn Sie fertig sind, klicken Sie auf die Option Daten protokollieren, um eine Tabelle zu öffnen, in der die Zeit- und Verhältnisdaten protokolliert werden. Muskelzellen wurden gezüchtet, vermehrt und per Fax sortiert. Myoblasten machten mehr als 60% der analysierten Population aus.

Die primären humanen Myoblasten wurden dann in Differenzierungsmedium kultiviert und immungefärbt gegen den Transkriptionsfaktor von MEF2 und Myosin-Schwerkettenproteinen. Ein Großteil der Zellen exprimierte eine schwere Myosinkette und bildete Myotuben mit Fusionsindexwerten von etwa 60 %, die anderen 40 % der Zellen blieben undifferenzierte einkernige Zellen, auch Reservezellen genannt. Das beschriebene Experiment zum Calciumeintrag im Speicher wurde erfolgreich an den differenzierten Zellen durchgeführt.

Die Durchführung des gleichen Experiments an Zellen, die mit kleiner interferierender RNA transvektiert wurden, die gegen calciumpermeable Kanäle der TRPC-Familie gerichtet ist, zeigt, dass der Knockdown einen messbaren Einfluss auf den speicherbetriebenen Calciumeintritt hatte. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man menschliche Myoblasten aus der Skelettmuskulatur eines Erwachsenen isoliert. Wir verwenden diese Zellen, um die aufeinanderfolgenden Schritte der Muskeldifferenzierung und insbesondere die Deaktivierung der Transkriptionsfaktoren und Kalziumkanäle zu untersuchen.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in weniger als drei Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Es handelt sich um eine schnelle, einfache und reproduzierbare Methode, mit der die Ausbeute an menschlichen Myoblasten erreicht wird. Bei diesem Verfahren ist es wichtig zu verhindern, dass die Myoblastenkulturen ihr volles Vertrauen erreichen, da es sonst zu einer unerwünschten spontanen Differenzierung kommt.