Name: Lokalisierung von Odorant-Rezeptor-Genen in Locust-Antennen durch RNA In Situ Hybridisierung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Erfahren Sie die RNA-In-Situ-Hybridisierung zur Lokalisierung von Odorant-Rezeptor-Genen in Heuschrecken-Antennen. Diese Methode ermöglicht die hochsensitive Detektion schwach exprimierter Gene mit DIG- oder Biotin-markierten Sonden.

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Diese Arbeit wird durch einen Stipendium der Nationalen Naturwissenschaftlichen Stiftung von China (Nr.31472037) unterstützt. Die Erwähnung von Handelsnamen oder kommerziellen Produkten in diesem Artikel dient ausschließlich der Bereitstellung spezifischer Informationen und bedeutet keine Empfehlung.

HINWEIS: Zur Begrenzung des RNA-Abbaus werden Lösungen mit nass-autoklaviertem destilliertem Wasser (bei 121 ° C für 60 min) und auch Nass-Autoklaven-Materialien hergestellt. 1. Herstellung von RNA ISH Antisense und Sense Sonden <ol><li> Ziel-Gen-Amplifikation und -Reinigung <ol><li> Zuerst ein 387 bp doppelsträngiges Fragment von L. migratoria OR1 ( LmigOR1 , GenBank: JQ766965) aus dem Plasmid, das die Volllängen -cDNA von LmigOR1 enthält, mit einer Taq- DNA-Polymerase, die Adenine zu beiden Enden der Fragmente hinzufügt, produzieren. <ol><li> Verwenden Sie ein 100 μl Endreaktionsvolumen, das 50 μl 2x Reaktionsmischung enthält, jeweils 4 μl Sense- und Antisense-Primer ( Tabelle 1 ), 1 μl Plasmid-Matrize und 41 μl RNase-freies H 2 O. Verwenden Sie die folgende PCR Protokoll: 94 ° C für 5 min, gefolgt von 30 Zyklen von 94 ° C für 30 s, 55 ° C für 30 s und 72 ° C für 1 min, Gefolgt von 72 ° C für 10 min. </li><li> Wiederholen Sie diese Schritte, um das 1,303 bp doppelsträngige Fragment von LmigOR2 (GenBank: JQ766966) und 1,251 bp doppelsträngiges Fragment von LmigORco (GenBank: JN989549) zu produzieren. Die in diesen Experimenten verwendeten Primer sind in Tabelle 1 dargestellt . </li><li> Führen Sie PCR-Produkte auf 1,2% Agarosegele in 1x Tris-Acetat-EDTA-Puffer und visualisieren Sie mit Ethidiumbromid-Färbung. </li></ol></li><li> Extrahieren Sie diese PCR-Produkte mit einem Gel-Extraktions-Kit. <ol><li> Nach der Elektrophorese verbannen Sie die DNA-Banden aus dem Gel und legen die Gelscheiben in ein 1,5-ml-Röhrchen. Dann werden 100 μl Bindungspuffer (Puffer PN) pro 0,1 g Gelscheibe zugegeben. Vortex und inkubieren bei 50 ° C, bis die Gelscheibe vollständig aufgelöst ist. </li><li> Setzen Sie eine CA2-Adsorptionskolonne in das Sammelröhrchen ein und fügen Sie 500 μl Restpuffer (Puffer BL) hinzu. Dies verbessert die Absorptionsfähigkeit und Stabilität der Silicamembran. CentriFuge bei 12.400 xg für 1 min. </li><li> Das gelierte Gelgemisch wird in die Adsorptionskolonnenanordnung überführt und bei Raumtemperatur für 2 min inkubiert. Dann werden die Zentrifugenröhrchen bei 12.400 xg für 1 min zentrifugiert. Verwerfen Sie den Durchfluss und setzen Sie die Adsorptionskolonne wieder in das Sammelrohr ein. </li><li> Füge 600 μl Waschlösung (Ethanol zugesetzt, Puffer PW) zweimal hinzu. Zentrifuge bei 12.400 xg für 1 min. Verwerfen Sie den Durchfluss und setzen Sie die Adsorptionskolonne wieder in das Sammelrohr ein. </li><li> Das Sammelröhrchen entleeren und die Säulenanordnung bei 12.400 xg für 2 min zentrifugieren, um ein Verdampfen von restlichem Ethanol zu ermöglichen. </li><li> Die Adsorptionskolonne sorgfältig auf ein sauberes 1,5 mL Zentrifugenröhrchen überführen. Das Pellet für 5-10 min trocknen und die DNA in einem geeigneten Volumen ( z. B. 30 &amp; mgr; l) nukleasefreies Wasser auflösen. </li><li> Inkubieren bei RT für 2 min. Zentrifuge bei 12.400 xg für 2 min. Die Adsorptionskolonne entsorgen und die DNA bei 4 ° C oder -20 ° C aufbewahren. </li></ol></li></ol></li><li> Konstruieren Sie die rekombinanten Plasmide <ol><li> Individuell das 387 bp-Fragment von LmigOR1 , 1,303 bp Fragment von LmigOR2 und 1,251 bp Fragment von LmigORco in einen T-Vektor ligieren , der Promotoren für T7 (Upstream) und SP6 (stromabwärts) RNA-Polymerasen neben der insertierten DNA unter Verwendung von T4-DNA-Ligase enthält. Bereiten Sie die folgende 10 &amp; mgr; l-Reaktion vor: 5 &amp; mgr; l 2x Ligationspuffer, 1 &amp; mgr; l T-Vektor, 3 &amp; mgr; l (~ 100 ng) der DNA des insertierten Gens und 1 &amp; mgr; l T4-DNA-Ligase und inkubieren O / N bei 4 ° C. </li><li> Füge 5 μl jedes rekombinanten Plasmids hinzu, das das 387 bp-Fragment von LmigOR1 , 1,303 bp Fragment von LmigOR2 und 1,251 bp Fragment von LmigORco getrennt in 50 μl kompetente Escherichia coli DH5α Zellen in sterilen 1,5 mL Röhrchen enthält. <ol><li> Mischen Sie sanft und legen Sie die Röhrchen für 30 Minuten in Eis und dann inkubieren sie für 90 s bei 42° C Übertragen Sie sie für 3 min in Eis zurück. </li><li> Füge 450 &amp; mgr; l Luria-Bertani (LB) flüssiges Medium ohne Ampicillin zu jedem Röhrchen hinzu und inkubiere sie in einem Schüttler bei 150 U / min für 1 h bei 37 ° C, um das E. coli DH5 &amp; agr; wiederherzustellen. </li><li> Nehmen Sie ein 100 &amp; mgr; l Aliquot jeder Transformante und verwenden Sie sie, um LB-feste Substratplatten, die 50 &amp; mgr; g / ml Ampicillin, 24 &amp; mgr; g / ml Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) und 40 &amp; mgr; g / ml 5-Brom-4 enthalten, zu inokulieren -chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid (X-gal). </li><li> Diese Platten in einem konstanten Inkubator bei 37 ° C für 18 h inkubieren. Screening der Ziel-rekombinanten Plasmide unter Verwendung der blau-weißen Screening-Methode. Sequenzieren Sie die Ziel-rekombinanten Plasmide unter Verwendung von Sanger-Sequenzierung und identifizieren die Insertionsrichtungen der drei ODER-Gene. </li></ol></li></ol></li><li> Wählen Sie Restriktionsendonukleasen, um rekombinante Plasmide zu linearisieren <ol><li> Verwenden Sie Restriktionsendonukleasen tHabe nicht nur in der multiplen Klonierungsstelle des Vektors verdauen, sondern auch die Insert-DNA nicht schneiden. In diesem Experiment werden alle 3 Gene in den T-Vektor in der Richtung eingefügt, die der des Vektors entspricht. </li><li> Verwenden Sie die NcoI- Restriktionsendonuklease, um die rekombinanten Plasmide, die das 387 bp-Fragment von LmigOR1 , 1,303 bp-Fragment von LmigOR2 und 1,251 bp-Fragment von LmigORco enthalten, zu linearisieren , um die Antisense-Sonden zu erzeugen. Verwenden Sie Sp e I Restriktionsendonuklease, um die Sense-Sonden zu erzeugen. HINWEIS: Wenn die Insertionsrichtung dem des Vektors entspricht, wird eine eindeutige Restriktionsstelle vom Ende von T7 ausgewählt, um das rekombinante Plasmid zu linearisieren, und die SP6-RNA-Polymerase wird zur Herstellung der Antisense-Sonde verwendet. Eine einzigartige Restriktionsstelle vom Ende von SP6 wird ausgewählt, um das rekombinante Plasmid zu linearisieren, und die T7-RNA-Polymerase wird verwendet, um die Sense-Sonde herzustellen. Ansonsten, wenn die Einsteckrichtung nicht mit t übereinstimmtDie Richtung des Vektors, dann wird eine einzigartige Restriktionsstelle vom Ende von SP6 ausgewählt, um das rekombinante Plasmid zu linearisieren, und die T7-RNA-Polymerase wird zur Herstellung der Antisense-Sonde verwendet. Die einzigartige Restriktionsstelle vom Ende von T7 wird ausgewählt, um das rekombinante Plasmid zu linearisieren, und die SP6-RNA-Polymerase wird verwendet, um die Sense-Sonde herzustellen. </li></ol></li><li> Reinigen der linearisierten rekombinanten Plasmide <ol><li> 20 μg jedes der drei rekombinanten Plasmide, die das 387 bp-Fragment von LmigOR1 , 1,303 bp-Fragment von LmigOR2 und 1,251 bp-Fragment von LmigORco enthalten, unter Verwendung der NcoI- Restriktionsendonuklease in einer 100 &amp; mgr; l-Reaktion, die 10 &amp; mgr; l 10 × Puffer, 40 &amp; mgr; l enthält, 0,5 μg / μl Plasmid, 3 μl Nco I und 47 μl RNase-freies H 2 O, gefolgt von einer 3- stündigen Inkubation bei 37 ° C. </li><li> In ähnlicher Weise werden 20 &amp; mgr; g von jedem dieser drei rekombinanten Plasmide uSinge die Spe I-Restriktionsendonuklease. </li><li> Diese verdauten Plasmide werden unter Verwendung eines Gel-Extraktionskits, wie in 1.1.2 beschrieben, gereinigt. Bestimmen Sie die Konzentrationen dieser extrahierten linearisierten rekombinanten Plasmide durch Spektrophotometrie und stellen Sie sie auf 0,5 μg / μL ein. </li></ol></li><li> Antisense und Sense Sonden vorbereiten <ol><li> Verwenden Sie das T7 / SP6-RNA-Transkriptionssystem, um Antisense- und Sense-Sonden zu erzeugen. SP6-RNA-Polymerase wird verwendet, um doppelsträngige RNA für DIG- und Biotin-markierte Antisense-Sonden für diese drei ODER-Gene unter Verwendung linearisierter rekombinanter Plasmide als Matrizen in vitro zu transkribieren. Die T7-RNA-Polymerase wird zur Herstellung von Messsonden verwendet. Die Reaktion in einem 20 &amp; mgr; l Endvolumen, enthaltend 2 &amp; mgr; l 10 × NTP-Mischung, 2 &amp; mgr; l 10X Transkriptionspuffer, 1 &amp; mgr; l RNase-Inhibitor, 2 &amp; mgr; l T7 oder SP6-RNA-Polymerase, 4 &amp; mgr; l 0,5 &amp; mgr; g / &amp; mgr; l linearisiertes Plasmid und 9 &amp; mgr; l RNase-freies H 2 O, gefolgt vonDurch eine 3-stündige Inkubation bei 37 ° C. </li><li> Inkubieren Sie die DIG- und Biotin-markierten Antisense- und Sense-Sonden für 30 min mit 1 μl DNase bei 37 ° C. Zugabe von 2,5 μl 5 M LiCl und 75 μl absolutem Ethanol, dann inkubieren die Reaktionen für 30 min bei -70 ° C. </li><li> Zentrifugieren bei 15.000 xg für 30 min bei 4 ° C. Den Überstand sorgfältig dekantieren. Füge 150 μl 70% iges Ethanol hinzu, um das Fällungsmittel zu waschen. Das 70% ige Ethanol (1 l) wird durch Zugabe von 95% Ethanol (736,8 ml) zu sterilem destilliertem Wasser (263,2 ml) hergestellt. </li><li> Bei 15.000 xg für 30 min bei 4 ° C erneut zentrifugieren und das Pellet für 5-10 min bei RT lufttrocknen. Füge 25 μl RNase-freies H 2 O hinzu, um die RNA-Antisense- und Sense-Sonden aufzulösen. </li><li> Wenn die Länge des eingefügten Gens länger als 1 kb ist, dann Fragment RNA antisense und Sense-Sonden auf eine durchschnittliche Länge von ~ 300 bp durch Inkubation in einer Bicarbonat-Carbonat-Puffer-Lösungen. Die Reaktion in einem 50 μl Endvolumen durchführen, cWobei 25 &amp; mgr; l der RNA-Sonde und 25 &amp; mgr; l der Bicarbonat-Carbonat-Pufferlösung (80 mM NaHCO 3 , 120 mM Na 2 CO 3 , pH 10,2) bei 60 ° C erhalten wurden. Die erforderliche Hydrolysezeit wird durch eine zuvor veröffentlichte Formel 17 gegeben . </li><li> Füge 5 μl 10% ige Essigsäure hinzu, um die Reaktion zu stoppen. In diesem Experiment, Fragment der LmigOR2 und LmigORco Antisense und Sense Sonden für 24 und 23 min, respectively. T = (L o -L f ) / kXL o XL f L o = die Anfangsfragmentlängen in kb L f = die endgültigen Fragmentlängen in kb K = die Geschwindigkeitskonstante für die Hydrolyse, etwa 0,11 kb -1 min -1 T = die Hydrolysezeit in min </li><li> Schließlich werden 250 μl Hybridisierungspuffer zugegeben und bei -80 ° C aufbewahrt. </li></ol></li></ol> 2. Vorbereitung der Kryostatabschnitte <ol><li> Precool die FreeziNg Mikrotom auf -24 ° C. </li><li> Wählen Sie neue, heutzutage erwachsene Heuschrecken, die aktiv sind und intakte Antennen haben. Schneiden Sie die Antennen in 2-3 mm Stücke mit sterilen Rasiermesser. </li><li> Setzen Sie OCT-Verbindung auf einen gefrierenden Mikrotom-Halter und legen Sie ein oder zwei Proben auf die Verbindung horizontal. Dann den Halter in das Gefriermikrotom bei -24 ° C überführen, um zu äquilibrieren, bis die Verbindung gefriert. Nehmen Sie den Halter heraus und bedecken Sie die Proben mit einer kleinen Verbindung. Übertragen Sie den Halter in das Gefriermikrotom bei -24 ° C für mindestens 10 min ( Abbildung 1 ). HINWEIS: Vermeiden Sie es, Blasen in der Verbindung zu bekommen. </li><li> Fixieren Sie den Halter mit den Proben in das Gefriermikrotom, und schneiden Sie dann die gefrorenen Proben in 12 μm dicke Scheiben bei -24 ° C. </li><li> Tauen Sie die Scheiben eins nach dem anderen auf die Rutschen (25 x 75 mm, nukleasefrei) und die Luft trocknen für 10 min. </li></ol> 3. Befestigung Sektionen <ol><li> Nach der Vorbereitung Kryostat(~ 100 x 40 x 80 mm) und fixieren die Gewebe durch Inkubieren der Objektträger in 4% Paraformaldehydlösung (PFA) für 30 min bei 4 ° C. </li><li> Waschen Sie die Objektträger in 1X Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) für 1 min. </li><li> Um die alkalischen Proteine ​​zu eliminieren, werden die Objektträger für 10 min auf 0,2 M HCl übertragen. </li><li> Um das Oberflächenprotein von Nukleinsäure zu eliminieren, transferieren Sie die Objektträger auf 1XPBS mit 1% Triton X-100 für 2 min. </li><li> Waschen Sie die Folien zweimal für 30 s in 1x PBS. </li><li> Schließlich spülen Sie die Objektträger in Formamidlösung für 10 min bei 4 ° C ab. </li></ol> 4. Hybridisierung <ol><li> Bereiten Sie die Antisense- und Sense-Sonden vor <ol><li> Verwenden Sie Hybridisierungspuffer, um RNA-Antisense- oder Sense-Sonden in den 1,5 mL-Nuklease-freien Röhrchen zu verdünnen. In diesem Experiment fügen Sie für alle Antisense- und Sense-Sonden ( LmigOR1, LmigOR2 und LmigOrco ) 1 μl Sonde auf 99 μ hinzuL Hybridisierungspuffer pro Folie. Im Allgemeinen erzeugt die Verwendung von 1: 100 Verdünnungen von Antisense-Sonden signifikante positive Signale und niedrige Hintergründe unter Verwendung dieses Protokolls. </li><li> Für den chromogenen Nachweis die DIG-markierten Sonden einzeln verdünnen. </li><li> Für die TSA-Detektion verdünnen Sie DIG-markiertes LmigOR1 mit Biotin-markierten LmigOrco- Sonden oder DIG-markiertem LmigOR2 mit Biotin-markierten LmigOR1- Sonden zusammen im Hybridisierungspuffer. </li><li> Die Verdünnungen 10 min bei 65 ° C erhitzen und mindestens 5 min auf Eis geben. </li></ol></li><li> Hybridisierung <ol><li> Die Folien abtropfen lassen und 100 μl verdünnte Antisense- und Sense-Sonden (Schritt 4.1) zu den Gewebeschnitten hinzufügen. Dann legen Sie Deckellippen (24 mm x 50 mm, nukleasefrei) auf die Gewebeabschnitte. </li><li> Legen Sie die bedeckten Schieber horizontal in eine feuchte Schachtel (~ 300 x 180 x 50 mm 3 , Abbildung 2 ) und inkubieren Sie eineT 55 ° C für 22 h. Füge Formamidlösung oder 1X PBS zum Boden der Schachtel hinzu, um die Umgebung feucht zu halten, aber nicht die Schläuche in die Flüssigkeit eintauchen. </li></ol></li><li> Waschen und Sperren. <ol><li> Nach der Hybridisierung die Deckgläser sorgfältig entfernen. Die Folien zweimal für 30 min in 0,1 × Salzlösung Natriumcitrat (SSC) bei 60 ° C waschen. HINWEIS: Waschen bedeutet, dass die Objektträger in einen Schiebehalter gelegt werden, der dann in einen Plastikbehälter gelegt wird und sanft auf einer Wippe aufgerührt wird (~ 50 U / min, Abbildung 2 ). </li><li> Spülen Sie die Folien in 1x Tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBS) für 30 s. </li><li> Füge 1 ml 1% Blockierungsreagenz in TBS hinzu, ergänzt mit 0,03% Triton X-100 auf jedem Objektträger und inkubieren für 30 min. Verwerfen Sie dann die Sperrlösung. </li></ol></li><li> Immunhistochemie <ol><li> Für den chromogenen Nachweis verwenden Sie das Blockierungsreagens in TBS, um 750 Einheiten (U) / ml Anti-Digoxigenin-AP-konjugiertes Antibiotikum zu verdünnenDy bis 1,5 U / ml AP-Lösung. 100 μl AP-Lösung pro abgedeckter (24 mm x 50 mm) Folie zugeben. </li><li> Für die TSA-Detektion verwenden Sie das Blockierungsreagens in TBS, um 750 U / ml Anti-Digoxigenin-AP-konjugierter Antikörper und Anti-Biotin-Streptavidin-HRP-konjugierter Antikörper gegen die AP / HRP-Lösung zu verdünnen. 100 μl AP / HRP-Lösung pro abgedeckter (24 mm x 50 mm) Folie zugeben. </li><li> Inkubieren Sie die Objektträger in einem feuchten Kasten ( Abbildung 2 ) für 60 min bei 37 ° C. Verwenden Sie die Formamidlösung oder 1X PBS, um die Kiste feucht zu halten, aber nicht matschig. </li></ol></li></ol> 5. Färbung <ol><li> Entfernen Sie die Deckgläser sorgfältig. Waschen Sie die Dias dreimal für 5 min in 1x TBS, ergänzt mit 0,05% Tween-20. Spülen Sie die Folien im DAP-Puffer (chromogener Nachweis: pH 9,5, TSA-Nachweis: pH 8,0) für 5 min. </li><li> Färbung (chromogener Nachweis) <ol><li> 100 &amp; mgr; l NBT (375 &amp; mgr; g / ml) / BCIP (188 &amp; mgr; g / ml) Substratlösung (verdünnt in DAP;PH 9,5) auf jede Folie. Setzen Sie die Deckgläser (24 x 50 mm) sorgfältig auf die Folien auf. </li><li> Inkubieren Sie die Objektträger in einem feuchten Kasten mit Substratlösung für 10 min - O / N bei 37 ° C. HINWEIS: Überprüfen Sie die Entwicklung, indem Sie die Folien von Zeit zu Zeit unter dem Mikroskop betrachten. </li><li> Wenn die Entwicklung fertig ist, stoppen Sie die Reaktion, indem Sie die Objektträger in Wasser übertragen. </li></ol></li><li> Färbung (TSA-Erkennung) <ol><li> Verwenden Sie eine Spritze, um das HNPP (100 μg / ml) / Fast Red (250 μg / mL) Substrat aus dem Spritzenfilter (0,22 μm, Abbildung 2 ) zu bewegen. </li><li> Fügen Sie 100 μl HNPP / Fast Red Substrat pro Folie mit einem Deckglas (24 x 50 mm). Inkubieren Sie die Objektträger für 30 min mit HNPP / Fast Red Substrat bei RT. </li><li> Entfernen Sie die Deckgläser sorgfältig und waschen Sie die Folien dreimal für 5 min in 1X TBS, ergänzt mit 0,05% Tween-20. </li><li> 100 μl TSA-Substrat / überzogen (24 x 50 mm 2 ) rutschen Inkubieren Sie die Objektträger mit TSA-Substrat für 10 min bei RT. </li><li> Entfernen Sie die Deckgläser sorgfältig und waschen Sie die Folien dreimal für 5 min in 1x TBS, ergänzt mit 0,05% Tween-20. </li></ol></li><li> Die Folien in PBS / Glycerin (1: 3) einbetten. HINWEIS: Nach Beendigung dieser Vorgänge sollten die Folien so schnell wie möglich beobachtet werden, da das Fluoreszenzsignal schnell abschreckt. </li></ol> 6. Beobachtung <ol><li> Chromogener Nachweis <ol><li> Gewebeabschnitte mit einem optischen Mikroskop beachten. Wählen Sie die 10X, 20X und 40X Objektiv, um die Ergebnisse der chromogenen Erkennung zu beobachten. </li><li> Verwenden Sie DP-BSW Software, um die Ergebnisse zu analysieren und die Bilder zu erfassen. </li></ol></li><li> TSA-Erkennung <ol><li> Gewebeabschnitte mit einem konfokalen Mikroskop beobachten. DIG-markierte Gene sollten unter 543 nm Licht beobachtet werden, die eine rote Farbe aufweisen und Biotin-markierte Gene sein solltenBeobachtet unter 488 nm Licht, präsentiert eine grüne Farbe. Wenn sie auftauchen, präsentieren sie eine gelbe Farbe. </li><li> Wählen Sie die 20X- und 40X-Objektivlinsen, um die Ergebnisse der TSA-Erkennung zu beobachten. </li><li> Verwenden Sie FV1000 Software, um die Ergebnisse zu analysieren und die Bilder zu erfassen. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren oder andere Interessenkonflikte.

Es ist schwer, RNA ISH zu lokalisieren, um ODER-Gene in Insektenantennen zu lokalisieren, da die Expressionsniveaus von ODER-Genen, außer ORco , sehr niedrig sind und die Histologie von Insektenantennen bewahrt wird, ist sehr schwierig. Darüber hinaus ist TSA-Erkennung auch sehr schwierig. Um diese Probleme zu lösen, sollten folgende Maßnahmen ergriffen werden. Die Antennen werden aus neu gemahlenen erwachsenen Heuschrecken ausgewählt, die dünne und weiche, natürliche Nagelhaut haben, die ihre Morphologie auf d...

Insektenantennen, die die bedeutendsten chemosensorischen Organe sind, sind mit vielen haarähnlichen Strukturen - Sensilla - bedeckt, die von Olfactory Receptor Neurons (ORNs) innerviert werden. Auf der Membran von Insekten-ORNs werden Odorant-Rezeptoren (ODER), eine Art von Protein, das sieben Transmembran-Domänen enthält, mit einem Corezeptor (ORco) exprimiert, um ein Heteromer zu bilden, das als ein geruchshemmender Ionenkanal 1 , 2 , 3 fungiert . Verschiedene ODER reagieren auf verschiedene Kombinationen der chemischen Verbindungen 4 , 5 , 6 . Heuschrecken ( Locusta migratoria ) beruhen vor allem auf olfaktorischen Cues, um wichtige Verhaltensweisen auszulösen 7 . Heuschrecken-ODER sind Schlüsselfaktoren für das Verständnis molekularer olfaktorischer Mechanismen. Lokalisierung eines spezifischen Heuschrecken-ODER-Gens an das Neuron von aMorphologisch spezifischer Sensillum-Typ durch RNA In situ Hybridisierung (RNA ISH) ist der erste Schritt bei der Erforschung der ODER-Funktion. RNA ISH verwendet eine markierte komplementäre RNA-Sonde zur Messung und Lokalisierung einer spezifischen RNA-Sequenz im Abschnitt von Gewebe, Zellen oder ganzen Mounts in situ und liefert Einblicke in physiologische Prozesse und Krankheitspathogenese. Digoxigenin-markierte (DIG-markierte) und Biotin-markierte RNA-Sonden wurden in der RNA-Hybridisierung weit verbreitet verwendet. Die RNA-Markierung mit Digoxigenin-11-UTP oder Biotin-16-UTP kann durch in vitro- Transkription mit SP6- und T7-RNA-Polymerasen hergestellt werden. DIG- und Biotin-markierte RNA-Sonden haben folgende Vorteile: nicht radioaktiv; Safe; stabil; hochsensibel; Hochspezifisch; Und leicht zu produzieren mit PCR und in vitro Transkription. DIG- und Biotin-markierte RNA-Sonden können chromogen und fluoreszenz nachgewiesen werden. DIG-markierte RNA-Sonden können mit Anti-Digoxigenin-Alkali nachgewiesen werdenNe Phosphatase (AP) -konjugierte Antikörper, die entweder mit den hochempfindlichen chemilumineszierenden Substraten Nitroblau Tetrazoliumchlorid / 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-phosphat-toluidinsalz (NBT / BCIP) unter Verwendung eines optischen Mikroskops oder mit 2 sichtbar gemacht werden können -Hydroxy-3-naphtoesäure-2&#39;-phenylanilidphosphat (HNPP), gekoppelt mit 4-Chlor-2-methylbenzendiazonium-hemi-Zinkchloridsalz (Fast Red) unter Verwendung eines konfokalen Mikroskops. Biotin-markierte RNA-Sonden können mit Anti-Biotin-Streptavidin-Pferd-Rettich-Peroxidase (HRP) -konjugierten Antikörpern nachgewiesen werden, die mit Fluorescein-Tyramiden unter Verwendung eines konfokalen Mikroskops sichtbar gemacht werden können. Somit kann eine zweifarbige fluoreszierende in situ- Hybridisierung durchgeführt werden, um zwei Zielgene in einer Scheibe unter Verwendung von DIG- und Biotin-markierten RNA-Sonden zu detektieren. RNA ISH mit DIG- und / oder Biotin-markierten Sonden wurde erfolgreich verwendet, um olfaktorisch verwandte Gene zu lokalisieren, wie OR , ionotroper Rezeptor, geruchsbindendes ProteinUnd sensorisches Neuronenmembranprotein, in Insektenantennen von, aber nicht beschränkt auf Drosophila melanogaster , Anopheles gambiae , L. migratoria und die Wüstenheuschrecke Schistocera gregaria 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 . Allerdings gibt es zwei wesentliche Herausforderungen bei der Durchführung von RNA ISH für Insekten-ODER: (1) ODER-Gene (außer ORco ) werden auf niedrigem Niveau und nur in wenigen Zellen exprimiert, was die Signaldetektion sehr schwierig macht und (2) das Insektengewebe konserviert Histologie, so dass die Morphologie erhalten bleibt und das Hintergrundgeräusch ist niedrig, kann eine Herausforderung sein. In diesem Papier ein detailliertes und effektives Protokoll beschreibt RNA ISH für die Lokalisierung von ODER-Genen in InsektAntennen präsentiert werden, einschließlich sowohl chromogene und Tyramide Signal Amplification (TSA) Erkennung.

<table><tbody><tr><td><stark>Materialien</stark></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2&fach; TSINGKETM Master Mix</td><td>TSINGKE, China</td><td>TSE004</td><td></td></tr><tr><td>RNase-frei H2O</td><td>TIANGEN, China</td><td>RT121-02</td><td></td></tr><tr><td>REGULAR AGAROSE G-10</td><td>BIOWEST, SPANIEN</td><td>91622</td><td></td></tr><tr><td>Bindungspuffer</td><td>TIANgel Midi Aufreinigungskit, TIANGEN, China</td><td>DP209-02</td><td></td></tr><tr><td>Balance Puffer</td><td>TIANgel Midi Aufreinigungskit, TIANGEN, China</td><td>DP209-02</td><td></td></tr><tr><td>Waschlösung</td><td>TIANgel Midi Aufreinigungskit, TIANGEN, China</td><td>DP209-02</td><td></td></tr><tr><td>T Vektor</td><td>Promega, USA</td><td>A362A</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>Promega, USA</td><td>M180A</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli DH5&alpha;</td><td>TIANGEN, China</td><td>CB101</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma, USA</td><td>A-6140</td><td></td></tr><tr><td>Isopropyl &beta; -D-1-thiogalactopyranosid</td><td>Inalco, USA</td><td>1758-1400</td><td></td></tr><tr><td>5-Brom-4-chlor-3-indolyl-&beta; -D-Galactopyranosid</td><td>SBS Genetech, China</td><td>GX1-500<</td><td></td></tr><tr><td>em>Nco I</td><td>BioLabs, Neuengland</td><td>R0193S</td><td></td></tr><tr><td>Spe I</td><td>BioLabs, New England</td><td>R0133M</td><td></td></tr><tr><td>DIG RNA Markierungskit</td><td>Roche, Schweiz</td><td>11175025910</td><td></td></tr><tr><td>Biotin RNA Markierungskit</td><td>Roche, Schweiz</td><td>11685597910</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>DIG RNA Markierungskit, Roche, Schweiz</td><td>11175025910</td><td></td></tr><tr><td>LiCl</td><td>Sinopharm, China</td><td>10012718</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sinopharm, China</td><td>10009257</td><td></td></tr><tr><td>Essigsäure</td><td>BEIJING CHEMICAL REGENTS COMPANY, China</td><td>10000292</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. Compound</td><td>Sakura Finetek Europe, Zoeterwoude, Niederlande</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Objektträger</td><td>TINA JIN HAO YANG BIOLOGCAL MANUFACTURE CO., LTE, China</td><td>FISH0010</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sinopharm, China</td><td>80070591</td><td></td></tr><tr><td>Millex</td><td>Millipore, USA</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>AMRESCO, USA</td><td>0777-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Nitroblau-Tetrazoliumchlorid / 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat toluidinsalz</td><td>Roche, Schweiz</td><td>11175041910</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sinopharm, China</td><td>10010618</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Unternehmen</td><td>Katalognummer</td><td>Kommentare</td></tr><tr><td>Solutions</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1&times; Tris-Acetat-EDTA</td><td>Sigma, USA</td><td>V900483-1KG</td><td>0,04 mol/L Tris-Base</td></tr><tr><td>1&fach; Trisacetat-EDTA</td><td>BEIJING CHEMICAL REGENTS COMPANY, China</td><td>10000292</td><td>0,12% Essigsäure</td></tr><tr><td>1&mal; Tris-Acetat-EDTA</td><td>Sigma, USA</td><td>03677</td><td>Ethylendiamintetraessigsäure Dinatriumsalz (EDTA)</td></tr><tr><td>Luria-Bertani (LB) Flüssigmedium</td><td>Sinopharm, China</td><td>10019392</td><td>10 g/L NaCl</td></tr><tr><td>Luria-Bertani (LB) Flüssigmedium</td><td>MERCK, Deutschland</td><td>VM335231</td><td>10 g/L Pepton aus Kasein (Trypton)</td></tr><tr><td>Luria-Bertani (LB) Flüssigmedium</td><td>MERCK, Deutschland</td><td>VM361526</td><td>5 g/L Hefeextrakt</td></tr><tr><td>LB Festsubstratplatte</td><td>Sinopharm, China</td><td>10019392</td><td>10 g/L NaCl</td></tr><tr><td>LB Festsubstratplatte</td><td>MERCK, Deutschland</td><td>VM335231</td><td>10 g/L Pepton aus Kasein (Trypton)</td></tr><tr><td>LB Festsubstratplatte</td><td>MERCK, Deutschland</td><td>VM361526</td><td>5 g/L Hefeextrakt</td></tr><tr><td>LB Festsubstratplatte</td><td>WISENT ING, Kanada</td><td>800-010-CG</td><td>15 g/L Agar Bakteriologische Qualität</td></tr><tr><td>10 mal; Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS, pH 7,1)</td><td>Sinopharm, China</td><td>10019392</td><td>8,5 % NaCl</td></tr><tr><td>10-fach; Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS, pH 7,1)</td><td>Sigma, USA</td><td>V900041-500G</td><td>14 mM KH2PO4</td></tr><tr><td>10&fach; Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS, pH 7,1)</td><td>Sigma, USA</td><td>V900268-500G</td><td>80 mM Na2HPO4</td></tr><tr><td>10&fach; Tris-gepufferte Kochsalzlösung (TBS, pH 7,5)</td><td>Sigma, USA</td><td>V900483-1KG</td><td>1 M Tris-Base</td></tr><tr><td>10-fach; Tris-gepufferte Kochsalzlösung (TBS, pH 7,5)</td><td>Sinopharm, China</td><td>10019392</td><td>1,5 M NaCl-Nachweispuffer</td></tr><tr><td>(DAP) &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; chromogener Nachweis pH 9,5&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; TSA-Detektion pH 8,0</td><td>Sigma, USA</td><td>V900483-1KG</td><td>100 mM Tris-Base-Detektionspuffer</td></tr><tr><td>(DAP) &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; chromogener Nachweis pH 9,5&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; TSA-Nachweis pH 8,0</td><td>Sinopharm, China</td><td>10019392</td><td>100 mM NaCl-Nachweispuffer</td></tr><tr><td>(DAP) &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; chromogener Nachweis pH 9,5&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; TSA-Nachweis pH 8,0</td><td>Sigma, USA</td><td>V900020-500G</td><td>50 mM MgCl2&middot; 6H2Ø</td></tr><tr><td>20&fach; Kochsalz-Natriumcitrat (pH 7,0)</td><td>Sinopharm, China</td><td>10019392</td><td>3 M NaCl</td></tr><tr><td>20-fach; Kochsalz-Natriumcitrat (pH 7,0)</td><td>Sigma, USA</td><td>V900095-500G</td><td>0,3 M Na-Citrat</td></tr><tr><td>4%ige Paraformaldehyd-Lösung (PFA, pH 9,5)</td><td>Sigma, USA</td><td>V900894-100G</td><td>4% Paraformaldehyd</td></tr><tr><td>Natriumcarbonat-Puffer</td><td>Sigma, USA</td><td>V900182-500G</td><td>0,1 M NaHCO3</td></tr><tr><td>Natriumcarbonat-Puffer (pH 10,2)</td><td>Sigma, USA</td><td>V900182-500G</td><td>80 mM NaHCO3</td></tr><tr><td>Natriumcarbonat-Puffer (pH 10,2)</td><td>Sigma, USA</td><td>S7795-500G</td><td>120 mM Na2CO3</td></tr><tr><td>Formamid-Lösung (pH 10,2)</td><td>MPBIO, USA</td><td>FORMD002</td><td>50% deionisierte</td>Formamid-Formamid-Lösung</tr><tr><td>(pH 10,2)</td><td></td><td></td><td>5&fach; Kochsalz-Natriumcitrat-Blockierungspuffer</td></tr><tr><td>bei TBS</td><td>Roche, Schweiz</td><td>11175041910</td><td>1% Blot-Blockierungspuffer</td></tr><tr><td>bei TBS</td><td>AMRESCO, USA</td><td>0694-500ML</td><td>0,03% Triton X-100</td></tr><tr><td>Blockierungspuffer bei TBS</td><td></td><td></td><td>1&mal; Tris gepufferte Kochsalzlösung</td></tr><tr><td>Alkalische Phosphatase-Lösung</td><td>Roche, Schweiz</td><td>11175041910</td><td>1,5 U/ml Anti-Digoxigenin-Alkali-Phosphatase konjugierter Antikörper</td></tr><tr><td>Alkalische Phosphatase-Lösung</td><td></td><td></td><td>Blockierungspuffer bei TBS</td></tr><tr><td>Alkalische Phosphatase/Meerrettich-Peroxidase-Lösung</td><td>Roche, Schweiz</td><td>11175041910</td><td>1,5 U/ml Anti-Digoxigenin-Alkali-Phosphatase konjugiert Antikörper</td></tr><tr><td>Alkalische Phosphatase / Meerrettich-Peroxidase-Lösung</td><td>TSA-Kit, Perkin Elmer, USA</td><td>NEL701A001KT</td><td>1 % Anti-Biotin Streptavidin Meerrettichperoxidase - konjugierter Antikörper</td></tr><tr><td>Alkalische Phosphatase / Meerrettich-Peroxidase-Lösung</td><td></td><td></td><td>Blockierungspuffer in TBS-Hybridisierungspuffer</td></tr><tr><td></td><td>MPBIO, USA</td><td>FORMD002</td><td>50 % deionisierte Formamid-Hybridisierung</td></tr><tr><td> Puffer</td><td></td><td></td><td>2&mal; Kochsalz-Natriumcitrat</td></tr><tr><td>Hybridisierungspuffer</td><td>Sigma, USA</td><td>D8906-50G</td><td>10% Dextransulfat</td></tr><tr><td>Hybridisierungspuffer</td><td>Invitrogen, USA</td><td>AM7119</td><td>20 &micro; g/ml Hefe-t-RNA-Hybridisierungspuffer</td></tr><tr><td></td><td>Sigma, USA</td><td>D3159-10G</td><td>0,2 mg/ml Heringsspermien DNA</td></tr><tr><td>2-Hydroxy-3-naphtosäure-2'-phenylanilidphosphat/ 4-Chlor-2-methylbenzoldiazonium Hemi-Zinkchlorid-Salzsubstrat</td><td>Roche, Schweiz</td><td>11758888001</td><td>1% 2-Hydroxy-3-naphtosäure-2'-phenylanilidphosphat (10 mg/ml)</td></tr><tr><td>2-Hydroxy-3-naphtosäure-2'-phenylanilidphosphat/ 4-chlor-2-methylbenzoldiazonium-halb-Zinkchlorid-Salzsubstrat</td><td>Roche, Schweiz</td><td>11758888001</td><td>1% 4-Chlor-2-methylbenzoldiazonium-halb-Zinkchloridsalz (25 mg/ml)</td></tr><tr><td>2-hydroxy-3-naphtosäure-2'-phenylanilidphosphat/ 4-Chlor-2-methylbenzoldiazoniumhemi-Zinkchlorid-Salzsubstrat</td><td></td><td></td><td>Nachweispuffer</td></tr><tr><td>Tyramidsignal Amplifikationssubstrat</td><td>TSA-Kit, Perkin Elmer, USA</td><td>NEL701A001KT</td><td>2% Fluorescein-Tyramide</td></tr><tr><td>Tyramid Signalamplifikationssubstrat</td><td>TSA-Kit, Perkin Elmer, USA</td><td>NEL701A001KT</td><td>Amplification Diluent</td></tr><tr><td>Name</td><td><>Firma</td><td>Katalognummer</td><td>Kommentare</td></tr><tr><td>Instrument</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gefriermikrotom</td><td>Leica, Nussloch, Deutschland</td><td>Jung CM300 Kryostat</td><td></td></tr><tr><td>Spektralphotometer</td><td>Thermo SCIENTIFIC, USA</td><td>NANODROP 2000</td><td></td></tr><tr><td>Optisches Mikroskop</td><td>Olympus, Tokio, Japan</td><td>Olympus IX71Mikroskop</td><td></td></tr><tr><td>Konfokales Mikroskop</td><td>Olympus, Tokio, Japan</td><td>Olympus BX45 Konfokales Mikroskop</td><td></td></tr></tbody></table>

lokalisierung von odorant-rezeptor-genen in locust-antennen durch rna<em&gt; in situ</em&gt; hybridisierung

Localization of Odorant Receptor Genes in Locust Antennae by RNA In Situ Hybridization

Insekten haben anspruchsvolle olfaktorische Empfangssysteme entwickelt, um exogene chemische Signale zu erfassen. Diese chemischen Signale werden von Olfactory Receptor Neurons (ORNs), die in haarähnlichen Strukturen, genannt Chemosensilla, der Antennen untergebracht sind, transduziert. Auf den ORNs-Membranen wird angenommen, dass Odorant-Rezeptoren (ORs) an Geruchscodierung beteiligt sind. So ist es möglich, die auf die ORNs lokalisierten Gene zu identifizieren, um OR-Gene zu erkennen und stellt eine fundamentale Grundlage für weitere funktionelle in situ- Studien dar. Die RNA-Expressionsniveaus von spezifischen ODER- S in Insektenantennen sind sehr niedrig und die Erhaltung von Insektengewebe für die Histologie ist eine Herausforderung. Somit ist es schwierig, ein ODER zu einem bestimmten Typ von Sensilla unter Verwendung von RNA in situ Hybridisierung zu lokalisieren. In diesem Papier wird ein detailliertes und hochwirksames RNA- in situ- Hybridisierungsprotokoll speziell für niedrig exprimierte ODER-Gene von Insekten eingeführt. Darüber hinaus ist eine spezifische OR Gen waS identifiziert durch die Durchführung von doppelfarbigen fluoreszierenden in situ- Hybridisierungsexperimenten unter Verwendung eines coexprimierenden Rezeptor-Gens, Orco , als Marker.

Bei der chromogenen Detektion wurde eine kleine Teilmenge der Antennenzellen in jedem erwachsenen Antennenabschnitt mit den DIG-markierten LmigOR1- und LmigOR2- Antisense-Sonden bezeichnet ( Abbildung 3 ). RNA ISH auf aufeinanderfolgenden Abschnitten, um LmigOR1 und LmigOR2 zu lokalisieren, zeigten, dass Antennenzellen, die die beiden Gene exprimieren , in ORN-Clustern lokalisiert wurden, die LmigORco...

Dieses Papier beschreibt ein detailliertes und hochwirksames RNA- in situ- Hybridisierungsprotokoll, insbesondere für Low-Level-exprimierte Odorant Receptor (OR) -Gen sowie andere Gene in Insektenantennen unter Verwendung von Digoxigenin (DIG) -markierten oder Biotin-markierten Sonden.

Lokalisierung von Odorant-Rezeptor-Genen in Locust-Antennen durch RNA<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisierung

Insects have evolved sophisticated olfactory reception systems to sense exogenous chemical signals. These chemical signals are transduced by Olfactory ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, niedrig exprimierte Geruchsrezeptorgene sowie andere Gene in den Insektenantennen mit Hilfe von Digoxigenin- oder Biotin-markierten Sonden zu lokalisieren. Um mit diesem Verfahren zu beginnen, wählen Sie die neuen adulten Heuschrecken aus, die aktiv sind und intakte Antennen haben, und schneiden Sie die Antennen dann mit sterilen Rasierern in zwei bis drei Millimeter große Stücke. Tragen Sie anschließend die OCT-Verbindung auf einen Gefriermikrotomhalter auf und legen Sie die Proben horizontal auf die Verbindung.Übertragen Sie den Halter bei minus 24 Grad Celsius in das Gefriermikrotom, um ihn auszugleichen, bis die Verbindung gefriert. Nehmen Sie anschließend den Halter heraus und bedecken Sie die Proben mit etwas Masse. Übertragen Sie den Halter erneut für mindestens 10 Minuten bei minus 24 Grad Celsius in das Gefriermikrotom, dann schneiden Sie die gefrorenen Proben in 12 Mikrometer dicke Scheiben.Anschließend die Scheiben nacheinander auf Objektträgern auftauen und 10 Minuten an der Luft trocknen lassen. Legen Sie nach der Vorbereitung der Kryostatschnitte die Objektträger in einen Plastikbehälter und fixieren Sie das Gewebe, indem Sie die Objektträger 30 Minuten lang bei vier Grad Celsius in 4%iger PFA-Lösung inkubieren. Waschen Sie die Objektträger nach 30 Minuten eine Minute lang in einem X PBS.Um die alkalischen Proteine zu eliminieren, übertragen Sie die Objektträger für 10 Minuten auf 0,2 molare Chlorwasserstoffe und dann die Objektträger für zwei Minuten auf ein X PBS mit 1% Triton X-100, um das Oberflächenprotein der Nukleinsäure zu eliminieren. Waschen Sie die Objektträger anschließend zweimal für 30 Sekunden in einem X PBS. Spülen Sie die Objektträger anschließend 10 Minuten lang bei vier Grad Celsius in Formamidlösung.Lassen Sie die Objektträger abtropfen und fügen Sie 100 Mikroliter verdünnte Antisense- und Sensorsonden hinzu, dann legen Sie die Deckgläser auf die Gewebeschnitte. Geben Sie anschließend Formamidlösung oder ein X PBS auf den Boden der Box, um die Umgebung feucht zu halten, aber tauchen Sie die Objektträger nicht in die Flüssigkeit. Anschließend legen Sie die abgedeckten Objektträger waagerecht in eine Feuchtbox und inkubieren 22 Stunden lang bei 55 Grad Celsius.Entfernen Sie nach der Hybridisierung vorsichtig die Deckgläser. Waschen Sie die Seiten zweimal, indem Sie sie 30 Minuten lang in 0,1 x SSC bei 60 Grad Celsius vorsichtig auf einer Wippe bewegen, und spülen Sie dann die Objektträger 30 Sekunden lang in einem X ELS aus. Geben Sie einen Milliliter eines 1%-Blockierungsreagenzes in TBS, ergänzt mit 0,03%Tritin X-100, auf jeden Objektträger und inkubieren Sie es 30 Minuten lang.Entsorgen Sie anschließend die Blockierungslösung. Für den chromogenen Nachweis verwenden Sie das Blockierungsreagenz in TBS, um 750 Einheiten pro Milliliter anti-Digoxigenin-AP-konjugierten Antikörper auf 1,5 Einheiten pro Milliliter AP-Lösung zu verdünnen. Fügen Sie anschließend 100 Mikroliter AP-Lösung zu jedem abgedeckten Objektträger hinzu.Für den TSA-Nachweis verwenden Sie das blockierende Reagenz in TBS, um 750 Einheiten pro Milliliter des konjugierten Anti-Digoxigenin-AP-Antikörpers und des konjugierten Anti-Biotin-Streptavidin-HRP-Antikörpers mit der AP-HRP-Lösung zu verdünnen, und fügen Sie dann 100 Mikroliter AP-HRP-Lösung zu jedem bedeckten Objektträger hinzu. Fügen Sie die Formamidlösung oder ein X PBS hinzu, um die Box feucht, aber nicht matschig zu halten. Anschließend werden die Objektträger in einer feuchten Box 60 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubiert.Waschen Sie die Rutschen dreimal für fünf Minuten in einem X EL ergänzt mit 0,05 % TWEEN 20 auf einer Wippe. Spülen Sie danach die Objektträger fünf Minuten lang in DAP-Puffer, indem Sie den Kunststoffbehälter auf einer Wippe leicht umrühren lassen. Für den chromogenen Nachweis fügen Sie jedem Objektträger 100 Mikroliter NBT/BCIP-Substratlösung hinzu.Legen Sie die Deckgläser vorsichtig auf die Objektträger und inkubieren Sie die Objektträger dann in einer feuchten Box mit Substratlösung für 10 Minuten bis über Nacht bei 37 Grad Celsius. Kontrollieren Sie die Entwicklung, indem Sie sich die Objektträger von Zeit zu Zeit unter dem Mikroskop ansehen. Wenn die Entwicklung fertig ist, stoppen Sie die Reaktion, indem Sie die Objektträger in Wasser umfüllen.Für die TSA-Detektion verwenden Sie eine Spritze, um das HNPP/Fast Red-Substrat aus dem Spritzenvorsatzfilter zu entfernen, und fügen Sie dann 100 Mikroliter HNPP/Fast Red-Substrat zu jedem Objektträger hinzu, der mit einem Deckglas bedeckt ist. Danach inkubieren Sie die Objektträger 30 Minuten lang mit HNPP/Fast Red Substrat bei Raumtemperatur. Entfernen Sie nach 30 Minuten vorsichtig die Deckgläser und waschen Sie die Objektträger dreimal für fünf Minuten in einem X EL mit 0,05 % TWEEN 20.Inkubieren Sie die Objektträger mit 100 Mikrolitern TSA-Substrat pro abgedecktem Objektträger für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Entfernen Sie die Deckgläser vorsichtig und waschen Sie die Objektträger dreimal fünf Minuten lang in einem X ELS, ergänzt mit 0,05 %TWEEN 20, bevor Sie die Objektträger in PBS-Glycerin einbetten. Für den chromogenen Nachweis betrachten Sie die Gewebeschnitte mit einem optischen Mikroskop.Hier ist das Markierungsmuster der Antisense-Sonde LmigOR1 und LmigORco auf den aufeinanderfolgenden Abschnitten der Heuschreckenantenne dargestellt. Hier ist das Markierungsmuster der Antisense-Sonde LmigORco und LmigOR2 auf den aufeinanderfolgenden Abschnitten der Heuschreckenantenne. Die Abbildung der gelegentlich beschrifteten dendritischen Strukturen ist hier dargestellt.Für die TSA-Detektion betrachten Sie die Gewebeschnitte mit einem konfokalen Mikroskop. In dieser Arbeit wurde eine zweifarbige in situ Hybridisierung auf dem longitudinalen Antennenschnitt durchgeführt, um die Expression von LmigOR1 und LmigORco zu veranschaulichen. Die Lokalisierung von LmigOR1-exprimierenden Zellen in Zellclustern, die LmigORco exprimieren, bestätigte seine neuronale Identität, und hier ist eine genaue Ansicht der Box-Bereiche.Gelegentlich wird eine markierte dendritisch-ähnliche Struktur durch einen Pfeil angezeigt, und die eingekreisten Bereiche zeigen die olfaktorischen Rezeptorneuronen, die LmigORco exprimieren und das gleiche Sensillum teilen.

localization-odorant-receptor-genes-locust-antennae-rna-situ

Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Wir zeigen Varianten der extrazellulären Multi-Unit-Aufnahmetechnik, um Geruch hervorgerufenen Reaktionen in den ersten drei Stufen der wirbellosen olfaktorischen charakterisieren. Diese Techniken können leicht an ensemble Aktivität in anderen neuronalen Systemen sowie zu untersuchen.

Multi-unit Recording Methoden zur neuronalen Aktivität in der Locust Charakterisieren (<em&gt; Schistocerca Americana</em&gt;) Olfaktorische Circuits

Hierin beschreiben wir den Prozess der Ganz-Mount-Immunfärbung von Drosophila-Antennen, der es uns ermöglicht, die molekularen Mechanismen, die an der Diversifizierung von olfaktorischen Rezeptorneuronen (ORN) beteiligt sind, besser zu verstehen.

Ganze Berge Immunmarkierung der olfaktorischen Rezeptorneuronen in der<em&gt; Drosophila</em&gt; Antennen

Wir beschreiben ein Protokoll für die Verwendung von Insektenantennen in Form von Elektroantennogrammen (EAGs) auf autonomen Robotern. Unser experimentelles Design ermöglicht stabile Aufzeichnungen innerhalb eines Tages und löst einzelne Geruchspatches bis zu 10 Hz auf. Die Effizienz von EAG-Sensoren für die olfaktorische Suche wird demonstriert, indem ein Roboter zu einer Geruchsquelle gefahren wird.

Mit Insekten Elektroantennogramm Sensoren auf Autonome Roboter für Riech Suchen

RNA in situ Hybridisierung (ISH) ermöglicht die Visualisierung von RNAs in Zellen und Geweben. Hier zeigen wir, wie die Kombination von RNAscope ISH mit immunhistochemischer oder histologischer Farbstoffe erfolgreich eingesetzt werden kann, um mRNAs, die an Axonen lokalisiert sind, in Schnitten des Gehirns von Mäusen und Menschen zu detektieren.

Nachweis von Axonally lokalisierten mRNAs in Gehirnschnitten mittels hochauflösender<em&gt; In-situ-</em&gt; Hybridization

Bettwanzen verlassen sich auf olfaktorische Rezeptorneuronen, die in ihren antennen olfaktorischen Sensillen untergebracht sind, um Semiochemikalien in der Umwelt zu erkennen. Mit Hilfe der Einzelsensillum-Aufzeichnung demonstrieren wir eine Methode zur Bewertung der Reaktion von Bettwanzen auf Semiochemikalien und untersuchen den damit verbundenen Kodierungsprozess.

Verwenden von Einzel Sensillum Aufnahme auf Riech Neuron Antworten von Bed Bugs zu Semiochemicals Detect

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur Bühne und sezieren, olfaktorische Gewebe von Drosophila -Arten zu entwickeln. Das sezierte Gewebe kann später für Molekulare Analysen, wie quantitative RT-PCR (Reverse Transkription-Polymerase Chain Reaction) oder RNA Sequenzierung (RNAseq), sowie in-Vivo -Analysen wie Immunohistochemistry oder in Situ verwendet werden Hybridisierung.

Vorbereitung, Entwicklung von peripheren olfaktorische Gewebe für Molekulare und immunhistochemische Analysen in Drosophila

Dieses Whitepaper beschreibt eine detaillierte und hochwirksame Protokoll für einzelne Sensillum Aufnahmen aus den Sensillen Basiconica auf die Palpen Insekt Mundwerkzeuge.

Einzelne Sensillum Aufnahmen für Locust spürbare Sensillen Basiconica

Diese Studie stellt experimentelle Protokolle für eine biohybride Geruchserkennungsdrohne vor, die auf Seidenmottenantennen basiert. Der Betrieb eines experimentellen Elektroantennennogramms mit Seidenmottenantennen wird vorgestellt, zusätzlich zur Struktur einer Bio-Hybrid-Drohne, die für die Lokalisierung von Geruchsquellen mit dem Spiral-Surge-Algorithmus entwickelt wurde.

Elektroantennen-basierte Bio-Hybrid-Geruchserkennungsdrohne mit Seidenmottenantennen zur Lokalisierung von Geruchsquellen

Der Artikel beschreibt die Methoden und Reagenzien, die notwendig sind, um eine Hybridisierungskettenreaktion, RNA-Whole-Mount-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (HCR, RNA, WM-FISH) durchzuführen, um Einblicke in die räumliche und zelluläre Auflösung von chemosensorischen Rezeptorgenen in der Moskitoantenne und im Oberkieferpalp zu erhalten.

Hybridisierung Kettenreaktion RNA Whole-Mount Fluoreszenz in situ Hybridisierung von chemosensorischen Genen in Riechanhängen von Mücken

Doppel-Fluoreszenz- In situ Hybridisierung in Fresh Hirnschnitten

Erfahren Sie die RNA-In-Situ-Hybridisierung zur Lokalisierung von Odorant-Rezeptor-Genen in Heuschrecken-Antennen. Diese Methode ermöglicht die hochsensitive Detektion schwach exprimierter Gene mit DIG- oder Biotin-markierten Sonden.

Lokalisierung von Odorant-Rezeptor-Genen in Locust-Antennen durch RNA

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