Test zur Phosphorylierung und Mikrotubuli binden zusammen mit Lokalisierung des Tau-Proteins in Colorectal Krebszellen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Tau-Phosphorylierung, die Mikrotubuli-Bindungsfähigkeit von Tau und die Lokalisation von Tau mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie in Darmkrebszellen zu untersuchen. Diese Methode kann für die meisten biologischen Forschungsbereiche effektiv sein, insbesondere für die Krebs- und Demenzforschung, bei der Phosphorylierung und Mikrotubuli-Bindung wichtige Faktoren sind. Der Hauptvorteil des vorgestellten Phosphoratase-Assays besteht darin, dass er eine einfache Möglichkeit bietet, die gesamte Phosphorylierung von Proteinproben wahrzunehmen.

Der Hauptvorteil des Mikrotubuli-bindenden Assays besteht darin, dass es ein einfaches Verfahren ist, um die Mikrotubuli-bindenden Proteine von nicht-bindenden Fraktionen zu trennen. Der Hauptvorteil der Tau-Lokalisierungstechnik besteht jedoch darin, dass sie eine relativ geringe Menge an primären und sekundären Antikörpern benötigt. Um mit diesem Verfahren zu beginnen, bereiten Sie alle Reagenzien vor, wie im Textprotokoll beschrieben.

Etwa eine Million HCT-116-Zellen werden in Kulturschalen überführt, die ein Minimum an essentiellem Medium enthalten, das mit 10 % fötalem Rinderserum und 1 % Penicillin-Streptomycin ergänzt wird. Wenn die Zellen eine Konfluenz von 65 % erreichen, verwenden Sie einen Aspirator, um das FBS-ergänzte Medium zu entfernen. Fügen Sie dann serumfreies MEM hinzu, das entweder Curcumin oder Lithiumchlorid enthält.

Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % Kohlendioxid für 24 Stunden. Waschen Sie danach die Zellen mit 10 Millilitern eiskaltem PBS. Fügen Sie einen Milliliter eiskaltes PBS hinzu und verwenden Sie dann einen Zellschaber, um die Zellen abzukratzen und in 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen zu überführen.

Vier Minuten lang bei 1800 mal G und vier Grad Celsius zentrifugieren. Wir suspendieren die Zellpellets in 100 Mikrolitern vollständigem RIPA-Puffer bei vier Grad Celsius für 20 Minuten und achten darauf, die Röhrchen regelmäßig zu klopfen, um die Zellen zu lysieren. Dann beschallen Sie die Proben kurz mit einer Amplitude von 10 %, pulsieren Sie 0,2 Sekunden lang ein- und 0,2 Sekunden lang aus, insgesamt 2 Sekunden lang.

Zentrifugieren Sie das Zellhomogenat bei 22.570 G und vier Grad Celsius für 20 Minuten. Übertragen Sie die Überstände in neu markierte Röhrchen und messen Sie dann die Proteinkonzentration mit dem Bradford-Assay, wie im Textprotokoll beschrieben. Nach der Vorbereitung von Proben, die 20 Mikrogramm Gesamtprotein enthalten, fügen Sie jeweils zwei Mikroliter alkalischen Phosphatasepuffer und 10 Mikroliter alkalische Phosphatase hinzu.

Fügen Sie dann destilliertes Wasser hinzu, so dass das endgültige Volumen jeder Probe 20 Mikroliter beträgt. Inkubieren Sie die Proben eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius. Während die Proben inkubieren, bereiten Sie weitere Proben in der gleichen Konzentration, jedoch ohne Phosphatase zum Vergleich vor.

Nach einer Stunde stoppen Sie die Reaktion, indem Sie entweder EDTA in einer Endkonzentration von 50 Millimolar oder Natriumorthovanadat in einer Endkonzentration von 10 Millimolar hinzufügen. Frisch zubereiteten 4XSDS-Gelladepuffer mit 400 Millimolar DTT hinzufügen. Inkubieren Sie die Proben mit einem Wärmeblock fünf Minuten lang bei 100 Grad Celsius.

Wirbeln Sie die Proben und lassen Sie sie dann 10 bis 15 Minuten lang bei Raumtemperatur abkühlen. Laden Sie anschließend 13 Mikroliter Probe pro Vertiefung sowie die molekular gewogene Leiter auf ein 10%iges Polyacrylamid-Gel. Schließen Sie das Elektrophoresesystem an eine Stromquelle an und stellen Sie die Spannung für 20 Minuten auf 70 Volt ein, um die Proteinproben aus dem Stapelgel in das Auflösungsgel zu bewegen.

Erhöhen Sie danach die Temperatur auf 125 Volt und lassen Sie das Gel etwa 70 bis 120 Minuten lang laufen, bis die Proben und die Proteinleiter das Ende des Gels erreichen. Übertragen Sie das Gel mit einem Nasselektroblotting-System für etwa 100 Minuten auf eine Polyvinylidenfluoridmembran bei 100 Volt. Als nächstes inkubieren Sie die Membran, um sie 90 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 4 %igem Rinderserumalbumin abzutupfen.

Inkubieren Sie den Blot über Nacht in einer primären Antikörperlösung bei 4 Grad Celsius. Waschen Sie den Blot am nächsten Tag dreimal in PBST und waschen Sie ihn jeweils sieben Minuten lang. In der unsicheren Sekundärantikörperlösung 90 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.

Waschen Sie dann viermal mit PBST, wobei jede Wäsche sieben Minuten dauert. Entwickeln Sie den Blot mit einem Chemilumineszenz-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers. Decken Sie den entwickelten Blot mit transparenter Plastikfolie ab und nehmen Sie dann Chemilumineszenzbilder des Blots mit einem kommerziell erhältlichen Chemilumineszenz-Bildgebungssystem auf.

Nach der Vorbereitung frischer Proben werden diese 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius inkubiert. Ultrazentrifugieren Sie die Proben bei 100.000 G und 25 Grad Celsius für 60 Minuten. Übertragen Sie als Nächstes 120 Mikroliter jedes Überstands, der ungebundenes Tau enthält, in separate, saubere und markierte Röhrchen.

Geben Sie 120 Mikroliter Fibic Probenpuffer zu dem Pellet, das gebundenes Tau enthält. Nach gründlichem Mischen durch Vortexen und Pipettieren die Mischung in saubere, beschriftete Röhrchen umfüllen. Nach der Vorbereitung von Proben mit äquivalenter Proteinkonzentration ist ein frischer 4XSDS-Gelladepuffer mit 400 millimolaren DTT hinzuzufügen.

Verwenden Sie einen Wärmeblock, um die Proben fünf Minuten lang bei 100 Grad Celsius zu inkubieren. Wirbeln Sie die Proben vor und lassen Sie sie dann 10 bis 15 Minuten bei Raumtemperatur abkühlen. Laden Sie 13 Mikroliter Probe pro Vertiefung und die Molekulargewichtsleiter auf ein 10%iges Polyacrylamidgel.

Schließen Sie die positiven und negativen Elektroden des Elektrophoresesystems an eine Stromquelle an und stellen Sie dann die Spannung für 20 Minuten auf 70 Volt ein. Erhöhen Sie danach die Temperatur auf 125 Volt und lassen Sie das Gel etwa 70 bis 120 Minuten lang laufen, bis die Proben und die Proteinleiter das Ende des Gels erreichen. Verwenden Sie ein nasses Elektroblotting-System, um das Gel etwa 100 Minuten lang bei 100 Volt auf eine Polyvinylidenfluoridmembran zu übertragen.

Inkubieren Sie die Membran, um sie 90 Minuten lang bei Raumtemperatur in 4%igem Rinderserumalbumin zu tupfen. Inkubieren Sie dann über Nacht in einer primären Antikörperlösung bei vier Grad Celsius. Waschen Sie den Blot am nächsten Tag viermal mit PBST, wobei jede Wäsche sieben Minuten dauert.

Inkubieren Sie den gewaschenen Blot 90 Minuten lang bei Raumtemperatur in der entsprechenden Sekundärantikörperlösung. Waschen Sie dann sieben Minuten lang mit PBST und wiederholen Sie die Wäsche insgesamt viermal. Entwickeln Sie den Blot mit einem Chemilumineszenz-Kit.

Decken Sie es mit transparenter Plastikfolie ab und nehmen Sie Bilder mit einem Chemilumineszenz-Bildgebungssystem auf. Legen Sie zunächst Deckblätter in die Vertiefungen einer Gewebeabdeckplatte mit sechs Vertiefungen und säen Sie dann 250.000 Zellen in jede Vertiefung in das empfohlene Kulturmedium. Spülen Sie die Zellen nach 24 Stunden zweimal mit PBS.

Fügen Sie serumfreies MEM hinzu, das Curcumin enthält, und inkubieren Sie es 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % Kohlendioxid. Waschen Sie die Zellen danach erneut mit eiskaltem PBS. Fixieren Sie die Zellen in 3,7% Formaldehyd in einem 37 Grad Celsius heißen Inkubator im Dunkeln.

Waschen Sie die Zellen mit PBS und fixieren Sie die Zellen dann 15 Minuten lang in eiskaltem Methanol bei 20 Grad Celsius. Danach inkubieren Sie die Zellen 10 Minuten lang auf Eis in 3 % BSA und 0,1 % Triconex 100 in PBS. Waschen Sie die Zellen mit PBS und inkubieren Sie sie dann eine Stunde lang bei Raumtemperatur in Blockpuffer

Geben Sie anschließend 60 Mikroliter Primärantikörperlösung in das geschnittene Polyvinylidenfluoridstück in jeder Vertiefung. Platzieren Sie die Deckgläser so, dass die Zellen mit der Antikörperlösung in Kontakt kommen. Über Nacht bei 4 Grad Celsius in einer dunklen, feuchten Kammer inkubieren.

Waschen Sie die Zellen am nächsten Tag viermal mit PBS. Geben Sie 80 Mikroliter der Sekundärantikörperlösung zu jedem der Polyvinylidenfluoridstücke und platzieren Sie die Deckgläser so, dass die Zellen mit der Antikörperlösung in Kontakt kommen. In einer dunklen, feuchten Kammer bei Raumtemperatur zwei Stunden lang inkubieren.

Waschen Sie danach die Zellen viermal mit PBS. Montieren Sie die Proben mit DAPI auf das Eindeckmedium und befestigen Sie dann die Deckgläser auf Glasobjektträgern. Dann in einer dunklen Kammer bei Raumtemperatur eineinhalb Stunden inkubieren.

Untersuchen Sie die Objektträger mit einem konfokalen Mikroskop. In dieser Studie wird die cite-spezifische Tau-Phosphorylierung mit einem Phospho-Tau-Antikörper untersucht. Es wird beobachtet, dass Zellen, die mit Curcumin behandelt werden, mit zunehmender Konzentration von Curcumin vermindertes Tau exprimieren.

Andererseits nimmt die Phospho-Tau-Expression bei niedrigeren Konzentrationen von Curcumin zu und nimmt nur bei sehr hohen Konzentrationen ab. Anschließend werden die mit Lithiumchlorid behandelten Zellen untersucht. Wie zu sehen ist, ist die Expression sowohl von Tau als auch von Phospho-Tau unter der Behandlung mit Lithiumchlorid signifikant verringert.

Die Gesamtphosphorylierung wird dann durch einen Phosphotase-Assay bewertet. Es wird beobachtet, dass Tau in mit Phosphotase behandelten Proben im Vergleich zur unbehandelten Kontrollprobe schneller migriert, was darauf hindeutet, dass die Kontrollprobe phosphoryliert ist. Mit Curcumin behandelte Zellproben zeigten sehr ähnliche Ergebnisse, was darauf hindeutet, dass die Behandlung von Darmkrebszelllinien die Tau-Phosphorylierung nicht reduzierte.

Sowohl mit Phosphatasen behandelte als auch unbehandelte Proben wiesen in Proben von Zellen, die mit Lithiumchlorid behandelt wurden, nahezu den gleichen Bereich auf, was auf eine Verringerung der Tau-Phosphorylierung hinweist. Als nächstes wird der mikrotubuläre Bindungsassay von Zellproben unter Verwendung von Tau 352 als Positivkontrolle erfolgreich etabliert. Wie hier gezeigt, führt sowohl die Behandlung mit Curcumin als auch mit einer niedrigen Konzentration von Lithiumchlorid zu einer gehemmten Mikrotubuli-Bindungsaktivität.

Anschließend wird eine konfokale Mikroskopie durchgeführt. Nach der Behandlung mit Curcumin ist zu beobachten, dass Tau in den Zellkern transloziert. Dies stützt frühere Studien, die berichten, dass nukleares Tau eine Schlüsselrolle beim Schutz der neuronalen DNA spielt.

Nachdem Sie dieses Video gesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie einen Phosphotase-Assay durchführen, um die gesamte Phosphorylierung von Proteinproben zu bestimmen, und wie Sie einen Mikrotubuli-Bindungsassay durchführen. Sie sollten in der Lage sein, herauszufinden, wie Sie einen Immunfluoreszenz-Assay durch konfokale Mikroskopie mit verschiedenen kleineren Mengen an Antikörpern durchführen können. Die hier vorgestellten Verfahren sind kosteneffektiv und werden möglicherweise bei der Entdeckung und Entwicklung neuer therapeutischer Wirkstoffe zur Behandlung verschiedener Tauphorese und Krebsarten helfen.