Aufnahme synaptische Plastizität in akuten Hippocampal Scheiben gepflegt in einem kleinvolumigen Recycling - Perfusions- und untertauchen-Typ-Kammer-System

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, das vereinfachte Mittel zur Carbogenation von kleinvolumigem Recycling-ACSF gewährleistet und Langzeitaufzeichnungen von Feldpotentialen unter Verwendung einer Aufnahmekammer ermöglicht, die an einem Fluoreszenzmikroskop montiert ist. Diese Methode kann uns helfen, die Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Neuroplastizitäten zu beantworten, die sich auf die zugrunde liegenden Ligninwege beziehen, die die synaptische Übertragung und Bildung von Erinnerungen in einem zellulären Lern- und Gedächtnismodus regulieren. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie dazu beiträgt, den Sauerstoffgehalt eines kleinen Bioreservoirs zu stabilisieren, um die Kosteneffizienz der Experimente mit spezifischen Antagonisten oder Agonisten zu erhöhen.

Die Präparation der akuten Hippocampus-Schnitte wird von den Doktorandinnen Xia und Weiguang unseres Labors demonstriert. Um diesen Eingriff zu beginnen, verwenden Sie eine kalte chirurgische Klinge, um ein Stück des dorsalen Kortex in einem 70-Grad-Winkel entlang des dorsalen Randes jeder Hemisphäre zu präparieren. Übertragen Sie jede Halbkugel mit einem kalten Zahnzementspatel auf ein Stück Filterpapier, um die Oberfläche kurz zu trocknen.

Montieren Sie die beiden Halbkugeln mit frisch geschnittenen Oberflächen mit schnell wirkendem Klebekleber auf der eiskalten Schnittplattform, sodass das kaudale Ende der Halbkugeln der Rasierklinge zugewandt ist. Platzieren Sie anschließend die Schneideplattform in der Kühlkammer eines Vibratoms. Füllen Sie die Kammer mit dem Schneidepuffer bei zwei bis vier Grad Celsius und karbogenieren Sie ihn.

Schneiden Sie danach 350-Mikrometer-Scheiben mit den entsprechenden Vibrotomeinstellungen. Isolieren Sie die Hippocampus-Formation aus dem Subiculum und den entorhinalen Kortexen mit zwei Injektionskanülen als Schere. Entfernen Sie die Blasen mit einer Pasteurpipette aus dem Scheibenhaltenetz der zuvor vorbereiteten Inkubationskammer.

Übertragen Sie dann die Scheiben, die an der Schicht pyramidenförmig etwas transparent sind, von der Schnittplattform auf das Netz der Inkubationskammer mit einer Großmaulpasteurpipette. Fügen Sie in diesem Schritt einen Dreiwege-Rohrverbinder zum Abfluss des Recyclingsystems hinzu. Verbinden Sie den mittleren Arm des Dreiwege-Schlauchverbinders mit einem carbogen Zuleitungsschlauch und regeln Sie die Durchflussmenge mit einem Luftmassenmesser.

Fügen Sie danach dem Zulauf des Recyclingsystems einen zweiten Dreiwege-Schlauchverbinder hinzu. Verbinden Sie den mittleren Arm mit dem Schlauch, der der Inline-Heizung zugewandt ist, den oberen Arm mit einem dünnen Silikonschlauch und den unteren Arm mit dem Zulaufrohr aus dem Behälter. Platzieren Sie dann einen Schlauchquetscher auf einem dünnen Silikonschlauch an einer Stelle entlang des Schlauchs, an der die von der Peristolpumpe erzeugte Pulsation des ACSF in der Schichtkammer am geringsten ist.

Tränken Sie nun ein kleines Stück Linsenreinigungspapier und ein Nylonnetz, das an einem U-förmigen Platindraht befestigt ist, für einige Minuten in der Tauchscheibenkammer. Entfernen Sie danach den U-förmigen Platindraht. Schalten Sie das Recycling aus und legen Sie eine Scheibe auf das Linsenreinigungspapier.

Lege dann sofort das Scheibenhaltenetz auf die Scheibe. Schalten Sie die Pumpe ein und lassen Sie die Scheibe 30 Minuten lang äquilibrieren, ohne das Objektiv in ACSF zu tauchen. Füllen Sie in der Zwischenzeit die Aufzeichnungselektrode mit ACSF und montieren Sie sie in den Pipettenhalter.

Überprüfen Sie die Isolierung der Metallstimulationselektrode, indem Sie sie in Natriumbicarbonatlösung legen. Schließen Sie die Elektrode an den Minuspol eines Gleichspannungsgenerators an und beobachten Sie die Blasenbildung an der Spitze unter einem Präpariermikroskop. Platzieren Sie anschließend die geprüfte apoxidisolierte Wolfram-Stimulationselektrode in der Halterung des Manipulators und den Referenzdraht in der Scheibenkammer.

Fügen Sie der Kammer eine zweite Referenzelektrode hinzu und verbinden Sie diese mit der Referenzbuchse des Kopftisches der Aufnahmeelektrode. Klicken Sie in der Verstärkersteuerungssoftware auf das Feld für den Zero-Clamp-Modus und doppelklicken Sie dann auf das Listenfeld für die Ausgangsverstärkung. Wählen Sie eine Verstärkung von 100, doppelklicken Sie auf das Hochpassfilterfeld, wählen Sie drei Kilohertz und doppelklicken Sie auf das Tiefpassfilter-Listenfeld AC, um 0,1 Hertz auszuwählen.

Klicken Sie in der Aufnahmesoftware auf Erwerben, Protokoll öffnen. Wählen Sie ein Protokoll, das über Einstellungen verfügt, die episodische Stimulationen und die Digitalisierung verstärkter Potentiale bei 10 bis 20 Kilohertz für 50 bis 100 Millisekunden ermöglichen und das 10 Millisekunden nach dem Start einer episodischen Aufzeichnung automatisch einen Stimulusisolator auslöst. Platzieren Sie die Stimulations- und Aufzeichnungselektroden in einer Linie und parallel zur pyramidalen Schicht.

Klicken Sie anschließend auf Erwerben, Protokoll bearbeiten und wählen Sie die Registerkarte Auslöser im Popup-Fenster. Klicken Sie auf das Feld für die Triggerquelle und wählen Sie die Leertaste als Triggerquelle. Klicken Sie dann auf die Schaltfläche "OK" und dann auf die Schaltfläche "Aufnehmen", um die Erfassung zu starten.

Klicken Sie in der Stimulus-Isolator-Software auf das Spannungssteuerfeld und geben Sie Null ein. Klicken Sie auf die Download-Schaltfläche. Klicken Sie anschließend auf das Fenster der Aufnahmesoftware und drücken Sie die Leertaste.

Wiederholen Sie diesen Zyklus, indem Sie nacheinander Werte zwischen 1000 und 8000 eingeben. Korrelieren Sie die Stimulationsstärke mit den FEPSP-Steigungswerten und bestimmen Sie die Stimulationsstärke, die erforderlich ist, um maximal 40 % der FEPSP-Steigung zu erreichen. Klicken Sie auf das Spannungsregelfeld und geben Sie den ermittelten Wert ein.

Klicken Sie dann auf die Download-Schaltfläche. Klicken Sie in der Aufnahmesoftware auf die Schaltfläche Stopp und dann auf das Erfassungsmenü. Klicken Sie auf Protokoll bearbeiten und wählen Sie die Registerkarte Trigger im Popup-Fenster.

Klicken Sie anschließend auf das Feld für die Triggerquelle und wählen Sie den internen Timer als Triggerquelle aus. Klicken Sie auf die Schaltfläche OK, gefolgt von der Aufnahmetaste, die alle 60 Sekunden die automatische Aufzeichnung der Feldpotentiale startet. Klicken Sie nach 30 bis 60 Minuten auf die Stopp-Schaltfläche.

Klicken Sie in der Aufzeichnungssoftware auf Erwerben, Protokoll öffnen und wählen Sie dasselbe Protokoll wie für die Baseline-Aufzeichnung aus. Klicken Sie auf die Schaltfläche "OK" und dann auf "Aufnehmen". Lassen Sie die Feldpotenzialaufzeichnungen automatisch zwei bis vier Stunden lang laufen.

Wenn der Vorgang abgeschlossen ist, klicken Sie auf die Schaltfläche Stopp, um die Aufnahme zu beenden. Diese Abbildung zeigt die repräsentativen Aufzeichnungen der aktivitätsabhängigen Potenzierung der synaptischen Transmission mittels Ausflusscarbogenation und Reservoircarbogenation mit dem Recycling eines kleinen ACSF-Reservoirs. Die Potenzierung wurde nach dem Zeitpunkt Null um dreimal 100 Hertz pro Sekunde induziert.

Diese Abbildung zeigt, dass die Abflussauffrischung mit Recycling eines kleinen ACSF-Reservoirs die LTD-Induktion im Vergleich zu Experimenten mit reiner Lagerstättenaufladung verbesserte. Einmal gemeistert, kann die Slice-Vorbereitung in fünf bis 10 Minuten durchgeführt werden und eine stabile Field Potential-Aufnahme kann auch über viele Stunden erreicht werden, wenn sie richtig durchgeführt wird. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, den Karbogenationsgrad, die Perfusionsgeschwindigkeit, die Position der Elektroden und die Stimulationsspannung an Ihre spezifische Äquivalenz anzupassen.

Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden, wie z.B. die Patch-Clamp, die forensische Mikroskopie durchgeführt werden, um die zusätzlichen Fragen zu beantworten, wie z.B. die Virilisierung der Saftzelllokalisation von Ravin-Sonden als Reaktion auf die Induktion der aktivitätsabhängigen synaptischen Plastizität. Nach ihrer Entwicklung ebnet diese Technik Forschern auf dem Gebiet der Neuroplastizität den Weg, die aktivitätsabhängige synaptische Plastizität als zelluläre Lern- und Gedächtnisform in in vitro Hippocampus-Schnitten von gut tab- und transgenen Mausgenen zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie eine akute Schnittpräparation aus dem temporalen Hippocampus durchführen und wie Sie mit einem kleinen Volumen recycelter ACSF stabile Bedingungen für die Langzeitaufzeichnung synaptischer Übertragungen erhalten.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Tieren und chemischen Verbindungen gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen und die richtige Desinfektion getroffen werden sollten.