Name: Aufnahme synaptische Plastizität in akuten Hippocampal Scheiben gepflegt in einem kleinvolumigen Recycling - Perfusions- und untertauchen-Typ-Kammer-System (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Erfahren Sie eine Methode zur Aufzeichnung synaptischer Plastizität in akuten Hippocampus-Schnitten mit stabilisiertem Sauerstoffniveau in recyceltem Puffer. Diese Technik ermöglicht Langzeit-Elektrophysiologie und verbessert die Kosteneffizienz bei Experimenten zur Gedächtnisbildung.

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W.W durchgeführt, analysiert, und die Experimente entworfen und schrieb das Manuskript. D.X. und C.P Abbildung Vorbereitung unterstützt und die Experimente durchgeführt. Diese Arbeit wurde unterstützt von NSFC (31320103906) und 111-Projekt (B16013), T.B.

Die Tiere wurden im Einklang mit den etablierten Standards der Pflege der Tiere und Verfahren des Institute of Brain Science und State Key Labor der medizinischen Neurobiologie der Fudan University, Shanghai, China aufrechterhalten.
1. Vorbereitung der Lösung
Hinweis: Siehe Tabelle der Materialien.
<ol>
	<li>Bereiten Sie den slicing Puffer (modifizierte Gey-Lösung): 92 mM NaCl, KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 30 mM Nahco33, 2, 5 mM 25 mM Glukose, 20 mM HEPES, 3 mM Na+-Pyruvat, 10 mM MgSO4und 0,5 mM CaCl2.</li>
	<li>Stellen Sie den pH-Wert auf 7,6 mit 1 M NaOH ohne Carbogenation.</li>
	<li>Speichern des Puffers bei 4 ° C. Hinweis: Die Titration klärt die trübe Flüssigkeit. Die Osmolalität ist 305-310 mOsm. Die Carbogen21 enthält 5 % Kohlendioxid und 95 % Sauerstoff.</li>
	<li>Vorbereiten der ACFS durch Verdünnung eine 10-fach-Stammlösung der ACFS, die keine Bikarbonat und Glucose, enthält geben eine endgültige Zusammensetzung des: 124 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 2,5 mM CaCl2, 2 mM MgCl2und 1,25 mM KH2PO4.</li>
	<li>Fügen Sie Bikarbonat und Glukose um 10 mM Glukose und 26 mM Nahco33erreichen.</li>
	<li>Carbogenate der ACFS durch eine perforierte Silikonschlauch mit einem blockierten Ende sofort nach dem Hinzufügen der Nahco3-3.</li>
	<li>Messen Sie den pH-Wert während der Carbogenating (pH 7,3-7,4). Hinweis: Die Pufferkapazität kann leicht durch die Veränderung der Menge an Nahco33angepasst werden. Da die daraus resultierenden pH-Wert temperaturabhängig ist, ist es notwendig, den daraus resultierenden pH-Wert während der Carbogenating bei der Arbeitstemperatur (z. B. 30 ° C) zu überprüfen.</li>
</ol>
2. Vorbereitung des akuten Hippocampal Scheiben
Hinweis: Siehe Tabelle der Materialien.
<ol>
	<li>Legen Sie ein Slice-Holding-Netz in eine Inkubation Kammer für akute Gehirnscheiben, füllen Sie die Kammer mit ACFS und Carbogenate (4-6 L/h) für mindestens 30 min22 bei 28-30 ° C.</li>
	<li>Cool die chirurgischen Instrumente bis auf 2 bis 4 ° C.</li>
	<li>Ort ein Becherglas gefüllt mit kalt- und Carbogenated schneiden Puffer (2 bis 4 ° C), in ein Eis-Wasser-Gemisch, in der Nähe der Vibratome beibehalten.</li>
	<li>Ratten oder Mäusen zu betäuben, bis die Hornhaut Reflexe (30-50 s) verschwinden mit Isofluran indem man 500 µL einer 2 L-Glas-Glas oder 12,5 µL in einem 50 mL-Tube.</li>
	<li>Isolieren des Gehirns mit einer Methode beschrieben und dargestellt im Detail in den Publikationen der Mathis Et al. (2011) 23 und Yuanxiang Et al. (2014) 24.</li>
	<li>Cool das Gehirn 2-4 ° c in einem eiskalten slicing Puffer (für mindestens 2 min) vor das Kleinhirn sezieren und Trennung der Hemisphären.</li>
	<li>Verwenden Sie eine kalte chirurgischen Klinge, um ein Stück des dorsalen Cortex in einem Winkel von 70 ° entlang der dorsalen Kante jeder Hemisphäre25 quer Scheiben von den ventralen und den mittleren Teil des Hippocampus, zu untersuchen, wie in Abbildung 1C und E.</li>
	<li>Übertragen Sie mit einem kalten dental Zement Spachtel eine Halbkugel auf ein Stück Filterpapier kurz trocknen die erstellte Fläche (ca. 1-2 s).</li>
	<li>Montieren Sie die beiden Hemisphären mit frisch geschnittenen Oberflächen auf der eiskalten slicing-Plattform mit schnell wirkenden Klebstoff Leim; haben Sie die kaudalen Ende der Hemisphären Fläche die Rasierklinge (Abbildung 1D).</li>
	<li>Die Slice-Plattform in die Kühlkammer ein Vibratome und füllen Sie die Kammer mit dem slicing Puffer (2 bis 4 ° C). Carbogenate mit einem perforierten Silikonschlauch.</li>
	<li>350 µm-Scheiben mit angemessenen Vibratome Einstellungen (z. B. Klinge Vorwärtsgeschwindigkeit: 1,2 mm/s, Klinge Amplitude: 1 mm).</li>
	<li>Isolieren die hippocampale Bildung aus dem Subiculum und dem entorhinalen Cortex mit zwei Injektion Kanülen (&#62; 28 G) als Schere.</li>
	<li>Entfernen Sie die Luftblasen aus dem Slice-Holding-Netz der zuvor vorbereiteten Inkubation Kammer mit einer Pasteurpipette.</li>
	<li>Übertragen Sie die Scheiben, die gewisse Transparenz an das Stratum Pyramidale von der Schneid-Plattform auf dem Netz der Inkubation Kammer haben. Vermeiden Sie Falten, stretching, Überschneidungen und schweben durch Absaugen ACFS und die Scheibe in einem großen Mund Pasteurpipette. Hinweis: Die ganze Prozedur (Schritt 2.5-2.14) kann 5-10 Minuten dauern; Daher ist es wichtig, die Temperatur der Pufferlösung im Laufe der Zeit weiterhin bei 4 ° c zu überprüfen</li>
	<li>Inkubieren Sie die Scheiben bei 30 ° C für mindestens 1,5-2 h in der Inkubation Kammer und bieten Sie Carbogen bei 4-6 L/h. Hinweis: Stellen Sie die Durchflussmenge des Carbogen zirkulieren den Puffer in den Inkubator, sondern verhindern, dass die Scheiben schweben.</li>
</ol>
(3) Änderungen der Carbogenation für das ACFS Recycling von kleinen Stauseen
<ol>
	<li>Fügen Sie einen 3-Wege-Rohr-Anschluss bis zum Ausfluss des recycling-Systems (Abbildung 2B).</li>
	<li>Anschließen Sie den mittleren Arm des 3-Wege-Rohr-Verbinder mit einem Carbogen Zuleitung und regulieren Sie die Durchflussmenge mit einem Luftstrom Meter (ca. 3-4 L/h, Abbildung 2D und Abbildung 4C).</li>
	<li>Fügen Sie einen zweiten Rohr 3-Wege-Connector auf den Zufluss des recycling-Systems. Schließen Sie den mittleren Arm an das Rohr mit Blick auf die Inline-Heizung, am Oberarm zu einem dünnen Silikonschlauch (10 cm Länge) und der Unterarm mit dem Zustrom Schlauch aus dem Reservoir (Tiefpass-Filter; Abbildung 4 ( C).</li>
	<li>Legen Sie den Schlauch Squeezer auf einen dünnen Silikonschlauch (OD: 2 mm) an einer Position entlang dem Rohr wo das Pulsieren der ACFS in der Slice-Kammer, erzeugt durch die peristaltischen Pumpe befindet sich an seinem Minimum. Hinweis: Die Abfluss-Carbogenation (Abfluss-Carb.) Änderung verringert die Empfindlichkeit der Carbogenation Ebene, um die Lautstärke des ACFS Reservoirs, die Recyclingquote, ACFS und relative Rohr positioniert in kleinen ACFS Stauseen (&#60; 50 mL; ( Abbildung 3). Bezüglich der Tiefpass-Filter reduziert eine bestimmte Menge an Luft in der dünnen Silikonschlauch das Pulsieren der ACFS Strömung; Daher sollte der Schlauch meist mit Luft befüllt werden.</li>
</ol>
4.Aufnahme synaptische Antworten in einer Überflutung Slice Kammer
Hinweis: Siehe Tabelle der Materialien.
<ol>
	<li>Vorwärmen der ACFS Lösung in einem Wasserbad auf ca. 28-30 ° C (Dies verhindert Blasenbildung in der Aufnahme-Kammer).</li>
	<li>Starten Sie das recycling-System (4-5 mL/min) und aktivieren Sie die Inline-Heizung um das System für mindestens 1 h equilibrate.</li>
	<li>Weichen Sie ein kleines Stück Linsenreinigung Papier und eine Nylon-Netzgewebe für ein paar Minuten (Abbildung 4) auf eine u-förmige Platindraht in der Überflutung Slice Kammer fixiert.</li>
	<li>Entfernen Sie den u-förmigen Platindraht.</li>
	<li>Schalten Sie das recycling und legen Sie eine Scheibe auf der Linse Reinigungspapier.</li>
	<li>Sofort das Slice-Holding-Netz auf das Slice, schalten Sie die Pumpe, und lassen Sie die Scheibe für 30 min equilibrate ohne Eintauchen das Ziel in der ACFS.</li>
	<li>ACFS Borosilikat-Mikropipette (d. h. die Aufnahme-Elektrode) einfüllen (Tipp Widerstand: 1-2 MΩ, 1/3 mit ACFS gefüllt) und in die Pipette Halterung zu montieren.</li>
	<li>Die Isolierung des Metall Stimulationselektrode überprüfen, indem es in Nahco33 Lösung (&#62; 40 mM). Verbinden Sie die Elektrode am Minuspol Ein Gleichspannungserzeuger (1-2 V, Pluspol: Silber oder Platin Draht), und beobachten Sie die Blasenbildung an der Spitze unter dem Mikroskop Dissektion (&#62; 60 X Vergrößerung).</li>
	<li>Setzen die getesteten Epoxy-isolierte Wolfram Stimulationselektrode in den Manipulator-Halter und die Referenz Drähten in der Slice-Kammer.</li>
	<li>Fügen Sie eine zweite Referenzelektrode in die Kammer und schließen Sie es an die Referenz-Buchse des Headstage der Aufnahme-Elektrode (Abb. 4A).</li>
	<li>Klicken Sie in der Verstärker-Steuerungssoftware auf das Feld "Null Klammer-Modus" und fahren Sie durch Doppelklicken auf das Feld "Output gain Liste". Wählen Sie einen Gewinn von "100", doppelklicken Sie auf das "high-Pass Filter Listenfeld (Bessel)," wählen Sie "0,1 Hz", und doppelklicken Sie auf das "low Pass Filter Listenfeld (AC)" wählen Sie "3 kHz."</li>
	<li>Klicken Sie in der Recording-Software, die auf "Acquire | Protokoll zu öffnen." Wählen Sie eine Protokoll, die Einstellungen für episodische Stimulationen erlaubt hat und die Digitalisierung der verstärkten Potentiale bei 10-20 kHz für 50-100 ms und löst automatisch eine Reiz-Isolator 10 ms nach dem Start eine episodische Aufnahme.</li>
	<li>Legen Sie die Stimulation und Aufnahme Elektroden in Linie und Parallel zur Stratum Pyramidale, zum Beispiel (Abbildung 4B und Abbildung 5).</li>
	<li>Klicken Sie auf "erwerben | Bearbeiten Sie Protokoll"und wählen Sie die Registerkarte"Trigger"(im Popup-Fenster). Klicken Sie auf den "Trigger-Quelle" Feld und wählen Sie "Leertaste" als Triggerquelle. Klicken Sie auf die Schaltfläche "OK". Klicken Sie auf "Record", um die Übernahme starten und beachten das Popup-Fenster mit einem Trigger-Taste.</li>
	<li>Klicken Sie in der Impuls-Isolator-Software auf das Feld "Voltage Control" und geben Sie "0". Klicken Sie auf den Button "Download". Klicken Sie im Fenster "recording-Software" und drücken Sie die Leertaste. Wiederholen Sie diesen Zyklus durch sequentiell Eingabe von Werten von 1 bis 8, z. B. bei 1 mV Schritten im Feld "Voltage Control".</li>
	<li>Korrelieren Sie die Stärke der Stimulation mit fEPSP-Hang-Werte und bestimmen Sie die Stimulation Kraft benötigt, um 40 % fEPSP-Steigung maximal. Klicken Sie auf "Voltage Control Box" und geben Sie den ermittelten Wert. Klicken Sie auf den Button "Download". Hinweis: Ein Reiz-Isolator wird verwendet, um kurze Spannung oder Stromimpulse auf Gehirngewebe anwenden. Die biphasische Impulse haben 100 µs pro Phase.</li>
	<li>Klicken Sie in der Aufzeichnungssoftware die Stopp-Taste und dann Menü "Acquire". Klicken Sie auf "Bearbeiten-Protokoll" und wählen Sie die Registerkarte "Trigger" im Popup-Fenster. Klicken Sie auf den Trigger Quellensammlung und wählen Sie "interner Timer" als Triggerquelle. Klicken Sie auf die Schaltfläche "OK". Klicken Sie auf der Record-Taste, die die automatische Aufzeichnung von Feld Potenziale beginnt alle 30 s, zum Beispiel. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Stopp" nach 30-60 min.</li>
	<li>Klicken Sie im Menü "Acquire", klicken Sie auf "Open Protocol", wählen Sie das gewünschte Induktion Protokoll der synaptischen Plastizität, und klicken Sie auf "OK". Klicken Sie auf "Record", um automatisch die hochfrequente Stimulation und Aufzeichnung zu aktivieren. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Stopp". Hinweis: Bei Studien in Bezug auf synaptische Plastizität, wenden Sie eines der standard Induktion Paradigmen für Langzeitpotenzierung oder Langzeitdepression nach längerer Grundlinie Aufnahme. Repräsentative Beispiele für die resultierende Modulation des synaptischen Getriebes sind in Abbildung 7 und Abbildung 8dargestellt.</li>
	<li>In der Aufzeichnungssoftware, klicken Sie auf "Acquire | Öffnen Sie Protokoll"und wählen Sie das gleiche Protokoll wie in Schritt 4.12. Klicken Sie auf "OK" und klicken Sie dann auf "Record." Laufen Sie automatisch potenzielle Feldaufnahmen für 2-4 h, zum Beispiel. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Stopp", um die Aufzeichnung zu beenden.</li>
	<li>Im Falle von pharmazeutischen Studien gelten die Verbindung direkt zu der ACFS Reservoir ist ständige Verbindung Verwaltung gewünscht (Abbildung 6).</li>
</ol>
5. Reinigung der Einrichtung und Hinweise
Hinweis: Siehe unten für allgemeine Tipps.
<ol>
	<li>Reinigen Sie das System wöchentlich durch das recycling von 10 % H2O2 für nicht mehr als 20 min, gefolgt vom Waschen mit entionisiertem H2O. Hinweis: Ethanol ist nicht für die Reinigung empfohlen. Es empfiehlt sich ebenfalls nicht die Referenz Drähten und Ziel in H2O2einzutauchen.</li>
	<li>Niedergeschlagene Salz auf der Oberfläche der Objektivlinse oder Kammer Umgebung mit 0,1 N HCl und dann Wasser zu entfernen.</li>
	<li>Waschen Sie Carbogen Bubbler in destilliertem Wasser oder 0,1 N HCl.</li>
	<li>Tauchen die Scheibe Inkubation Kammer 10 % H2O2 für 5 min einmal in der Woche und dann gründlich ausspülen der Inkubation Kammer mit entionisiertem H2O.</li>
	<li>Spülen Sie bei Metall Stimulation Elektroden die anregende Elektrodenspitze mit entionisiertem Wasser nach jedem Experiment und wischen Sie die anregende Elektrodenspitze mit einem Wattebausch, getränkt mit Ethanol, verbleibende Gewebe zu entfernen.</li>
	<li>Reduzieren Sie den Widerstand der kommerziellen Metall Stimulation Elektroden durch die Isolierung an der Spitze durch eine sorgfältige streichen mit Schleifpapier entfernen.</li>
	<li>Reduzieren Sie den Verlust von Carbogen aus der ACFS und recycling durch die Rohre durch den Austausch der Silikon-Schläuche mit Polytetrafluorethylen Röhren.</li>
	<li>Halten Sie die silberne Drähte der Aufnahme Elektrode und Bezugselektrode in Bleichmittel für mehrere Tage auf der Drahtoberfläche AgCl bilden.</li>
</ol>

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<li>Thiemann, W., Malisch, R., Reymann, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+microcirculation+chamber+for+inexpensive+long-term+investigations+of+nervous+tissue+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Bull%22%5BJournal%5D)">A new microcirculation chamber for inexpensive long-term investigations of nervous tissue in vitro.</a> Brain Res Bull. 17 (1), 1-4 (1986).</li>
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</ol>

Die Autoren erklären, dass die Forschung in der Abwesenheit von kommerziellen oder finanziellen Beziehungen geführt wurde, die als ein potenzieller Interessenkonflikt ausgelegt werden könnte.

Obwohl Schnittstelle Slice Kammern robuster synaptische Antworten25,26,27,28aufweisen, bieten untertauchen Kammern zusätzlichen Komfort für die Patch-Clamp-Aufnahme und Fluoreszenz Imaging. So haben wir beschrieben, verschiedene Aspekte der möglichen Feldaufnahmen in akuten hippocampal Scheiben mit einer kommerziellen untertauchen Slice-Kammer, die leicht auf die Darstellung der Fluoreszenz Son...

1951 wurden die ersten gemeldeten akuten Gehirn Slice Experimente durchgeführt1. 1971, nach erfolgreichen in-vitro- Aufnahmen von Piriform Rinde2,3 und die Entdeckung, dass hippocampale Neuronen quer entlang der Septotemporal Achse des Hippocampus4, eines miteinander der in-vitro- Ersteinspielungen von hippocampal neuronalen Aktivität erreicht5war. Die Ähnlichkeit der neurophysiologischen oder Neurostructural Parameter der Neuronen in Vivo und in Vitro Bedingungen sind noch Gegenstand der Debatte6, aber im Jahr 1975, Schwartzkroin7 darauf hingewiesen, dass die basale Eigenschaften der Neuronen werden in Vitro beibehalten und die Hochfrequenz-Stimulation (z.B. Tetanization) der Afferenzen in der hippocampal Bildung induziert eine lang anhaltende Erleichterung der synaptischen Potentiale8. Elektrophysiologische Aufzeichnung von neuronaler Aktivität in Vitro stark erweitert die Studie der zellulären Mechanismen aktivitätsabhängige synaptische Plastizität9,10, 1973 von Bliss entdeckt worden war Et al. 11 in in Vivo Experimente mit Kaninchen.
Die Untersuchung von neuronaler Aktivität oder Signalwege in Gehirnscheiben und besonders in akuten hippocampal Scheiben, ist jetzt ein Standardwerkzeug. Jedoch schon überraschend, in-vitro- Experimente standardisiert werden, wie durch die mehrere Ansätze, die für die Erstellung und Pflege von akuten hippocampal Scheiben bestehen. Reid Et al. (1988) 12 überprüft die methodischen Herausforderungen für die Aufrechterhaltung der akuten Hirnschnitten in verschiedene Arten von Slice-Kammern und die Entscheidungen des Badens Medium, pH-Wert, Temperatur und Sauerstoff. Diese Parameter sind immer noch schwer zu kontrollieren in der Aufnahme Kammer durch die maßgefertigte Elemente der in-vitro- Slice-Aufnahme-Setups. Publikationen finden Sie, dass einige methodischen Herausforderungen und das überwinden helfen, neue Arten von Überflutung Slice Kammern, z. B. eine interstitielle 3D Microperfusion System13, eine Kammer mit verstärkten Laminar-Flow und Sauerstoff beschreiben könnte liefern Sie14, ein System mit computergesteuerten Temperatur Kontrolle15und ein Mehrkammer-Aufnahme System16. Da diese Kammern nicht leicht zu bauen sind, verlassen sich die meisten Wissenschaftler auf handelsüblichen Slice Kammern. Diese Räume können auf einem Mikroskopsystem, so dass die Kombination der Elektrophysiologie und Fluoreszenz-imaging-17,18,19montiert werden. Da diese Kammern die Gehirnscheiben in künstlichen Liquor cerebrospinalis (ACFS) unter Wasser halten, muss eine hohe Durchflussrate der Pufferlösung beibehalten werden, erhöht die Kosten der Droge-Anwendung. Zu diesem Zweck haben wir ein Recyclingsystem Perfusion mit Abfluss-Carbogenation integriert, die genügend Stabilität für die Langzeitaufzeichnung von Feld-Potenziale in einer Überflutung Slice Kammer mit einem relativ kleinen ACFS Volume bereitstellt. Darüber hinaus zusammengefasst wir wie die Verwendung von diesem experimentellen Carbogenation/Perfusion System das Ergebnis der Tätigkeit-abhängige synaptische Plastizität10 auswirkt und wie Hemmung der eukaryotischen Dehnung Faktor-2 Kinase (eEF2K) moduliert synaptische Getriebe20.

<table><tbody><tr><td>Reagenzien erforderlich</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sinopharm chemisches Reagenz, China</td><td>10019318</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sinopharm chemisches Reagenz, China</td><td>10016318</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sinopharm chemisches Reagenz, China</td><td>10017618</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 &middot; 6H2O</td><td>Sinopharm Chemisches Reagenz, China</td><td>10012818</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sinopharm Chemisches Reagenz, China</td><td>10005861</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sinopharm Chemisches Reagenz, China</td><td>10018960</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sinopharm Chemisches Reagenz, China</td><td>10010518</td><td></td></tr><tr><td>NaH2 PO4</td><td>Sinopharm Chemisches Reagenz, China</td><td>20040718</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Natriumpyruvat</td><td>Sigma</td><td>A4043</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sinopharm Chemisches Reagenz, China</td><td>20025118</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sinopharm Chemisches Reagenz, China</td><td>10019718</td><td></td></tr><tr><td>Werkzeuge und Materialien zum Sezieren</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Enthaupter</td><td>Harvard apparatus</td><td>55-0012</td><td>für Rattenenthauptung</td></tr><tr><td>Verbandschere</td><td>SCHREIBER</td><td>12-4227</td><td>für Mäuse-Enthauptung</td></tr><tr><td>Doppelschneidklinge</td><td>Flying Eagle, China</td><td>74-C</td><td></td></tr><tr><td>IRIS Schere</td><td>RWD, China</td><td>S12003-09</td><td></td></tr><tr><td>Bone Rongeurs</td><td>RWD, China</td><td>S22002-14</td><td></td></tr><tr><td>Löffel</td><td>Hammacher&nbsp;</td><td>HSN 152-13</td><td></td></tr><tr><td>Zahnzementspachtel</td><td>Hammacher&nbsp;</td><td>HSN 016-15</td><td></td></tr><tr><td>Dental-Doppelendbagger</td><td>Blacksmith Surgical, USA</td><td>BS-415-017</td><td></td></tr><tr><td>Vibrierendes Mikrotom</td><td>Leica, Deutschland</td><td>VT1200S</td><td></td></tr><tr><td>chirurgische Klinge&nbsp;</td><td>RWD, China</td><td>S31023-02</td><td></td></tr><tr><td>chirurgischer Halter</td><td>RWD, China</td><td>S32007-14</td><td></td></tr><tr><td>Elektrophysiologie Geräte und Materialien</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vertikaler Pipettenabzieher</td><td>Narishige, Japan</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>Schwingungsisolationstisch</td><td>Meirits, Japan</td><td>ADZ-A0806</td><td></td></tr><tr><td>Unterwasser-Aufzeichnung Kammer</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-26GLP</td><td></td></tr><tr><td>4-Achsen-Mikromanipulator</td><td>Sutter, USA</td><td>MP-285, MP-225</td><td></td></tr><tr><td>Platindraht</td><td>World Precision Instruments</td><td>PTP406</td><td></td></tr><tr><td>Verstärker</td><td>Molekulare Geräte, USA</td><td>Multiclamp 700B</td><td></td></tr><tr><td>Datenerfassungssystem</td><td>Molekulare Geräte, USA</td><td>Digidata 1440A</td><td></td></tr><tr><td>Analyse Software</td><td>Molecular Devices, USA</td><td>Clampex 10.2</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszenzmikroskop</td><td>Nikon, Japan</td><td>FN1</td><td></td></tr><tr><td>LED-Lichtquelle</td><td>Lumen Dynamics Group, Kanada</td><td>X-cite 120LED</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipetten</td><td>Harvard Apparat</td><td>GC150TF</td><td>extrazelluläre Aufzeichnung</td></tr><tr><td>Borosilikat-Mikropipetten</td><td>Sutter, USA</td><td>BF150-86</td><td>Patch-Klemme</td></tr><tr><td>Wolframelektrode</td><td>A-M Systems, USA</td><td>575500</td><td></td></tr><tr><td>Schlauchpumpe</td><td>Länger, China</td><td>BT00-300T</td><td></td></tr><tr><td>Schläuche für Schlauchpumpe</td><td>ISMATEC, Wertheim, Deutschland</td><td>SC0309</td><td>1x Zulauf, ID: 1,02 mm</td></tr><tr><td>Rohre für Schlauchpumpe</td><td>ISMATEC, Wertheim, Deutschland</td><td>SC0319</td><td>2x Rohre für Abfluss, ID: 2,79 mm</td></tr><tr><td>CCD-Kamera</td><td>PCO, Deutschland</td><td>pco.edge sCMOS</td><td></td></tr><tr><td>Objektivreinigungspapier</td><td>Kodak</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mL konisches Zentrifugenröhrchen</td><td>Thermo scientific</td><td>339652</td><td></td></tr><tr><td>Vorkammer</td><td>Warner Instruments</td><td>BSC-PC</td><td></td></tr><tr><td>Inline-Heizung</td><td>Warner Instruments</td><td>SF-28</td><td></td></tr><tr><td>Temperaturregler</td><td>Warner Instruments</td><td>TC-324B</td><td></td></tr></tbody></table>

aufnahme synaptische plastizität in akuten hippocampal scheiben gepflegt in einem kleinvolumigen recycling - perfusions- und untertauchen-typ-kammer-system

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Obwohl Experimente an Hirnschnitten seit 1951 im Einsatz gewesen, noch Probleme, die die Wahrscheinlichkeit, dass eine stabile und erfolgreiche Analyse der synaptischen Übertragung Modulation bei potenziellen oder intrazellulären Feldaufnahmen zu reduzieren. Dieses Manuskript beschreibt methodische Aspekte, die bei der Verbesserung der experimenteller Bedingungen für die Aufrechterhaltung der akuten Hirnschnitten und zum Aufzeichnen von Feld exzitatorischen postsynaptischen Potenziale in einer handelsüblichen untertauchen Kammer hilfreich sein könnten mit einem Abfluss-Carbogenation. Die Abfluss-Carbogenation hilft, um den Sauerstoffgehalt in Experimenten zu stabilisieren, die verlassen sich auf das recycling von einem kleinen Puffer Reservoir zur Verbesserung der Wirtschaftlichkeit der Droge Experimente. Darüber hinaus präsentiert das Manuskript repräsentative Experimente, die die Auswirkungen von verschiedenen Carbogenation-Modi und Stimulation Paradigmen auf die aktivitätsabhängige synaptische Plastizität der synaptischen Übertragung untersuchen.

Im Abschnitt Protokoll beschrieben wir die Vorbereitung der akuten hippocampal Scheiben aus dem ventralen und mittleren Teil der hippocampalen Bildung (Abbildung 1) von männlichen C57BL/6 Mäusen und männliche Wistar-Ratten (5-8 Wochen). Die Position der Hemisphären auf der Aufschnittmaschine-Plattform hilft um sie stabil zu halten und beseitigt die Notwendigkeit der Stabilisierung mit Agar oder Agarose. Die Perfusion System selbst basiert auf einer peristalti...

Dieses Protokoll beschreibt die Stabilisierung der Sauerstoffgehalt in einem kleinen Volumen der recycelten Puffer und methodischen Aspekten der Aufnahme aktivitätsabhängige synaptische Plastizität in getauchten akute hippocampal Scheiben.

Aufnahme synaptische Plastizität in akuten Hippocampal Scheiben gepflegt in einem kleinvolumigen Recycling - Perfusions- und untertauchen-Typ-Kammer-System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine Methode bereitzustellen, die eine vereinfachte Karbogenierung von kleinen Volumina recycelnden ACSF ermöglicht und langfristige Ableitungen von Feldpotentialen mittels einer auf einem Fluoreszenzmikroskop montierten Ableitkammer erlaubt. Diese Methode kann uns helfen, zentrale Fragen auf dem Gebiet der Neuroplastizitäten zu beantworten, die sich auf die zugrundeliegenden Lignin-Pfade beziehen, welche die synaptische Übertragung und die Bildung von Erinnerungen auf zellulärer Ebene des Lernens und Gedächtnisses regulieren. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie zur Stabilisierung des Sauerstoffgehalts eines kleinen biologischen Reservoirs beiträgt und dadurch die Kosteneffizienz von Experimenten verbessert, die spezifische Antagonisten oder Agonisten verwenden.Die Herstellung der akuten Hippocampus-Schnitte wird von den Doktoranden Xia und Weiguang unseres Labors demonstriert. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie mit einem kalten chirurgischen Messer ein Stück des dorsalen Kortex unter einem Winkel von 70 Grad entlang der dorsalen Kante jeder Hemisphäre präparieren. Überführen Sie mithilfe eines kalten Zahnzementspatels jede Hemisphäre auf ein Stück Filterpapier, um die Oberfläche kurz abzutrocknen.Montieren Sie die beiden Hemisphären mit frisch geschnittenen Oberflächen mithilfe eines schnell härtenden Klebers auf der eiskalten Schneideplattform, sodass das kaudale Ende der Hemisphären zur Rasierklinge zeigt. Anschließend bringen Sie die Schneideplattform in die Kühlkammer eines Vibratoms ein. Füllen Sie die Kammer mit dem Schneidepuffer bei zwei bis vier Grad Celsius und karbogenisieren Sie diesen.Danach 350 Mikrometer dicke Schnitte mit geeigneten Vibrometeinstellungen herstellen. Isolieren Sie die hippocampale Formation unter Verwendung zweier Injektionskanülen als Schere vom Subikulum und den entorhinalen Kortizes. Entfernen Sie die Bläschen vom Haltegitter für die Schnitte in der zuvor vorbereiteten Inkubationskammer mithilfe einer Pasteurpipette.Überführen Sie dann die Schnitte, die im Stratum pyramidale eine gewisse Transparenz aufweisen, mit einer Pasteurpipette mit großem Mundungsquerschnitt von der Schneideplattform auf das Netz der Inkubationskammer. Fügen Sie in diesem Schritt einen Dreifach-Rohrverbinder am Ausfluss des Recycling-Systems hinzu. Verbinden Sie den mittleren Arm des Dreifach-Rohrverbinders mit einem Carbogen-Zufuhrrohr und regulieren Sie die Strömungsgeschwindigkeit mithilfe eines Luftdurchflussmessgeräts.Danach einen zweiten dreifachen Schlauchverbinder am Zufluss des Recyclingsystems anbringen. Den mittleren Arm mit dem Schlauch, der zum Inline-Heizer zeigt, verbinden, den oberen Arm mit einem dünnen Silikonschlauch und den unteren Arm mit dem Zulaufschlauch aus dem Reservoir. Anschließend einen Schlauchquetscher an einer Stelle auf dem dünnen Silikonschlauch anbringen, an der die Pulsation des ACSF in der Schnittkammer, erzeugt durch die peristaltische Pumpe, ihr Minimum erreicht.Tränken Sie nun ein kleines Stück Linsenreinigungspapier und ein an einem U-förmigen Platindraht befestigtes Nylonnetz mehrere Minuten lang in der Tauchschneidkammer. Danach entfernen Sie den U-förmigen Platindraht. Schalten Sie die Zirkulation aus und legen Sie eine Schnittprobe auf das Linsenreinigungspapier.Danach die Scheibenträger-Mesh sofort auf die Schnittstelle legen. Die Pumpe einschalten und die Schnittstelle 30 Minuten lang ohne Eintauchen des Objektivs in ACSF äquilibrieren lassen. In der Zwischenzeit die Aufnahmeelektrode mit ACSF füllen und in den Pipettenhalter einsetzen.Überprüfen Sie die Isolierung der metallischen Stimulations-Elektrode, indem Sie sie in eine Natriumbicarbonat-Lösung geben. Verbinden Sie die Elektrode mit dem negativen Pol eines Gleichspannungs-Generators und beobachten Sie die Bildung von Bläschen an der Spitze unter einem Stereomikroskop. Danach bringen Sie die getestete apoxylackisolierte Wolfram-Stimulations-Elektrode in den Manipulatorhalter und den Referenzdraht in die Schnittkammer ein.Fügen Sie eine zweite Referenzelektrode in die Kammer ein und verbinden Sie sie mit der Referenzbuchse der Kopfstufe der Aufnahmeelektrode. Klicken Sie in der Verstärker-Steuerungssoftware auf das Feld für den Null-Clamp-Modus und danach zweimal auf die Ausgangsverstärkungs-Liste. Wählen Sie eine Verstärkung von 100, doppelklicken Sie auf das Feld für den Hochpassfilter und wählen Sie drei Kilohertz aus, dann doppelklicken Sie auf die Liste für den Tiefpassfilter AC, um 0,1 Hertz auszuwählen.Klicken Sie in der Aufnahmesoftware auf „Acquire“ und öffnen Sie ein Protokoll. Wählen Sie ein Protokoll mit Einstellungen, die episodische Stimulationen ermöglichen und die Digitalisierung verstärkter Potentiale mit 10 bis 20 Kilohertz über 50 bis 100 Millisekunden erlauben, und das automatisch einen Stimulusisolator 10 Millisekunden nach Beginn einer episodischen Aufnahme auslöst. Platzieren Sie die Stimulations- und Ableitelektroden in einer Linie und parallel zur Stratum pyramidalis.Klicken Sie anschließend auf „Acquire“, „Edit Protocol“ und wählen Sie im Popup-Fenster die Registerkarte „Trigger“. Klicken Sie auf das Feld „Trigger Source“ und wählen Sie die Leertaste als Triggerquelle. Klicken Sie dann auf die Schaltfläche „Okay“ und anschließend auf die Aufnahmetaste, um die Datenaufnahme zu starten.Klicken Sie in der Stimulus-Isolator-Software auf das Spannungssteuerungsfeld und geben Sie null ein. Klicken Sie auf die Schaltfläche zum Herunterladen. Danach klicken Sie auf das Fenster der Aufnahmesoftware und drücken die Leertaste.Wiederholen Sie diesen Zyklus, indem Sie nacheinander Werte von 1000 bis 8000 eingeben. Korrelieren Sie die Reizstärke mit den FEPSP-Steigungs-Werten und ermitteln Sie die Reizstärke, die erforderlich ist, um 40 % des maximalen FEPSP-Steigungs-Werts zu erreichen. Klicken Sie auf das Spannungssteuerungsfeld und geben Sie den ermittelten Wert ein.Klicken Sie dann auf die Schaltfläche zum Herunterladen. Klicken Sie in der Aufnahmesoftware auf die Stopp-Taste und anschließend auf das Menü „Acquire“. Klicken Sie auf „Edit Protocol“ und wählen Sie im Popup-Fenster die Registerkarte „Trigger“.Anschließend klicken Sie auf das Auslöserquellen-Feld und wählen den internen Timer als Auslöserquelle. Klicken Sie auf die Schaltfläche „OK“, gefolgt von der Aufnahmetaste, die die automatische Aufzeichnung der Feldpotentiale alle 60 Sekunden startet. Klicken Sie nach 30 bis 60 Minuten auf die Stopp-Taste.Klicken Sie in der Aufnahmesoftware auf „acquire“, öffnen Sie das Protokoll und wählen Sie dasselbe Protokoll wie bei der Basislinienaufnahme aus. Klicken Sie auf die Schaltfläche „okay“ und anschließend auf „record“. Führen Sie die Feldpotentialaufnahmen automatisch für zwei bis vier Stunden fort.Wenn es abgeschlossen ist, klicken Sie auf die Stopp-Taste, um die Aufnahme zu beenden. Diese Abbildung zeigt repräsentative Aufnahmen der aktivitätsabhängigen Potenzierung der synaptischen Übertragung unter Verwendung der Ausfluss-Carbogenierung und Reservoir-Carbogenierung mit Wiederverwendung eines kleinen ACSF-Reservoirs. Die Potenzierung wurde nach dem Zeitpunkt null durch drei 100-Hertz-pro-Sekunde-Trains induziert.Diese Abbildung zeigt, dass die Ausfluss-Karbogenierung mit Wiederverwendung eines kleinen ACSF-Puffers die Induktion der LTD im Vergleich zu Experimenten mit ausschließlicher Puffer-Karbogenierung verbessert hat. Sobald die Methode beherrscht ist, kann die Schnittpräparation innerhalb von fünf bis zehn Minuten durchgeführt werden, und eine stabile Ableitung des Feldpotentials kann bei korrekter Durchführung über mehrere Stunden aufrechterhalten werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, den Karbogenierungsgrad, die Perfusionsgeschwindigkeit, die Position der Elektroden sowie die Stimulationsstärke entsprechend Ihrer spezifischen Versuchsanordnung anzupassen.Nach Durchführung dieses Verfahrens können andere Methoden wie das Patch-Clamp-Verfahren oder die forensische Mikroskopie angewendet werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise zur Virilisierung der zellulären Lokalisation von Ravin-Proben im Zusammenhang mit der Induktion aktivitätsabhängiger synaptischer Plastizität. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Forschern auf dem Gebiet der Neuroplastizität den Weg, aktivitätsabhängige synaptische Plastizität als zellulären Mechanismus des Lernens und Gedächtnisses in in-vitro-Hirnschnitten des Hippocampus sowie in transgenen Mausmodellen zu untersuchen. Nach Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie akute Schnitte aus dem temporalen Hippocampus präpariert werden und wie stabile Bedingungen für Langzeitaufnahmen synaptischer Übertragungen unter Verwendung eines geringen Volumens recycelter ACSF erreicht werden können.Beachten Sie, dass die Arbeit mit Tieren und chemischen Verbindungen gefährlich sein kann, und ergreifen Sie stets Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen und die ordnungsgemäße Desinfektion, während Sie dieses Verfahren durchführen.

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Forschung

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Neuroscience

Neurowissenschaften

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Vorbereitung der akuten Schnitten des Hippocampus von Ratten und transgenen Mäusen für das Studium der Synaptic Veränderungen während des Alterns und Amyloid-Pathologie

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Aufnahme synaptische Plastizität in akuten Hippocampal Scheiben gepflegt in einem kleinvolumigen Recycling - Perfusions- und untertauchen-Typ-Kammer-System (Video) | JoVE Journal

Aufnahme synaptische Plastizität in akuten Hippocampal Scheiben gepflegt in einem kleinvolumigen Recycling - Perfusions- und untertauchen-Typ-Kammer-System

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