Verbesserung der Anwendung des hochmolekularen Biotinylierte Dextran Amin für Thalamocortical Projektion Tracing in der Ratte

Das übergeordnete Ziel dieses Videos ist es, ein verfeinertes Protokoll für die Anwendung von BDA mit hohem Molekulargewicht zur Untersuchung der optimalen neuronalen Markierung im Zentralnervensystem zu demonstrieren. Diese Maßnahme kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der neuronalen Netzwerke zu beantworten. Durch die Visualisierung der Rahmenstruktur der neuronalen Beschriftung durch neuronale Schaltkreise.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Möglichkeit bietet, lokale neuronale Schaltkreise und deren chemische Eigenschaften zu starten. Bereiten Sie eine Mikroliter-Mikrospritze vor, die mit einer Glasmikropipette ausgestattet ist, und testen Sie sie, indem Sie flüssiges Paraffin aufziehen. Nachdem Sie die Ratte mit einem zugelassenen Protokoll betäubt haben, bestätigen Sie die Tiefenanästhesie, indem Sie nicht auf ein Schwanzkneifen reagieren.

Rasieren Sie dann die Oberseite des Kopfes des Tieres mit einem Elektrorasierer und schrubben Sie die Operationsstelle mit 10 % Povidon-Jod, gefolgt von 70 % Ethanol. Befestigen Sie die Ratte in der stereotaktischen Vorrichtung, indem Sie stumpfe Ohrstangen in die Ohren einführen und die oberen Schneidezahnen der Ratte in den Mundhalter einsetzen. Tragen Sie eine Augensalbe auf die Augen auf.

Verwenden Sie sterile OP-Handschuhe und -Abdeckungen, um sterile Bedingungen zu gewährleisten. Reinigen Sie die Kopfhaut der Operationsstelle erneut mit 70%igem Ethanol. Nachdem Sie mit einem Skalpell einen sagittalen Schnitt in die Haut gemacht haben, verwenden Sie sterile Applikatoren mit Wattespitze, um den Muskel und das Periost vom Schädel abzukratzen.

Bestimmen Sie anhand von vordefinierten Koordinaten aus einem Atlas den Ort für die Kraniotomie. Führen Sie eine Kraniotomie mit einem Fräser mit einem Bohrer mit runder Spitze durch, um bis zu einer Tiefe von etwa einem Millimeter zu bohren, bis die Hirnhäute sichtbar sind. Exzitieren Sie die Dura mater mit einer Mikrozange, um die Großhirnrinde über der Injektionsstelle freizulegen.

Stoßen Sie das flüssige Paraffin aus der Mikrospritze aus und ziehen Sie dann eine 10%ige BDA-Lösung auf. Montieren Sie die Spritze in das Mikroinjektionsgerät und schließen Sie die Mikropumpe an. Manipulieren Sie unter einem Stereomikroskop das Mikroinjektionsgerät.

Führen Sie die gefüllte Glasmikropipette durch die kortikale Oberfläche des Gehirns bis zu einer Tiefe von 5,8 Millimetern in das VPM ein. Verwenden Sie dann die Mikropumpe, um über einen Zeitraum von drei Minuten 100 Nanoliter 10 % BDA in das VPM zu injizieren. Ziehen Sie die Pipette nach fünf Minuten langsam heraus.

Nähen Sie die Wunde mit sterilem Faden und legen Sie die Ratte dann in einen warmen Erholungsbereich, bis sie wieder zu Bewusstsein kommt und sich vollständig erholt hat. Nachdem Sie die Ratte eingeschläfert haben, verwenden Sie eine Schere und eine Pinzette, um die Brusthöhle der Ratte zu öffnen und Zugang zum Herzen zu erhalten. Führen Sie einen intravenösen Katheter in den linken Ventrikel in Richtung Aorta ein und öffnen Sie dann die rechte Ohrmuschel.

Zuerst wird bei physiologischer Temperatur etwa ein bis zwei Minuten lang mit 0,9% Kochsalzlösung perfundiert, bis das aus dem Herzen austretende Blut klar ist. Und dann fahren Sie mit 250 bis 300 Millilitern 4%-Paraformaldehyd in 0,1 molaren Phosphatpuffer fort. Fixieren Sie das präparierte Gehirn zwei Stunden lang bei Raumtemperatur in 4%-Paraformaldehyd.

Dann wird das Gehirn auf 30 % Saccharose in 0,1 molaren PBS übertragen und drei Tage lang bei vier Grad Celsius kryogeschützt. Nach drei Tagen, wenn das Gehirn in der Lösung versunken ist, teilen Sie das Gehirn mit Hilfe einer Gehirnmatrix in drei Blöcke in koronaler Richtung auf. Der zentrale Block enthält den ventralen posteromedialen Kern des Thalamus im primären somatosensorischen Kortex.

Montieren Sie den zentralen Block des Gehirns auf dem Gefriertisch des Gleitmikrotoms, um ihn in der koronalen Ebene zu schneiden, und schneiden Sie ihn im gefrorenen Zustand bei 40 Mikrometern. Sammeln Sie die Schnitte in einer Sechs-Well-Schale, die 0,1 molare PBS enthält. Beginnen Sie mit der Färbung, indem Sie die Abschnitte etwa eine Minute lang mit 0,1 molaren PBS unter Schaukeln spülen.

Dann werden die Schnitte in eine gemischte Lösung von Streptavidin-AF594 in AF500/525 grün fluoreszierendem Nissl-Farbstoff in 0,1 molaren PBS mit 0,3 % Triton X-100 überführt und zwei Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. Waschen Sie die Abschnitte nach dem Färben dreimal in 0,1 molaren PB unter Schaukeln. Montieren Sie die Schnitte mit histochemischen Standardtechniken auf die Objektträger.

Trocknen Sie die Abschnitte etwa eine Stunde lang an der Luft. Tragen Sie 50%iges Glycerin in destilliertem Wasser auf die Thoreszenzbereiche und den Deckslip auf, bevor Sie die Objektträger abbilden. Diese repräsentative Mikroaufnahme zeigt die Injektionsstelle von BDA in Rot des ventralen posteromedialen Kerns des Thalamus auf dem Hintergrund einer grünen Nissl-Färbung.

Hier ist die Thoreszenz-BDA-Markierung zu sehen, einschließlich Thalamylcorticol-Axone in Schicht vier und kortikale Thalamus-Neuronen in den Schichten fünf und sechs. Zum Vergleich zeigt diese Mikroaufnahme, dass die konventionelle BDA-Markierung mit einem Standardverfahren der Avidin-Biotin-Peroxidase ein ähnliches Muster der neuronalen Markierung aufweist wie die thorescent BDA-Markierung. Diese Ansicht mit höherer Vergrößerung eines thorezenten BDA-markierten Schnitts zeigt die anterograd markierten axonalen Dorne im Detail in rot.

Der retrograd markierte neuronale Zellkörper, die Dendriten und die dendritischen Stacheln sind hier im Detail dargestellt. Sobald sie gemeistert sind, können die Kraniotomie und die stereotaktische Injektion in 20 bis 30 Minuten durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt werden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie BDA mit hohem Molekulargewicht anwenden können, um neuronale Verbindungen und die detaillierte Struktur der neuronalen Markierung wiederzubeleben.