Bestimmung der optimalen chromosomalen Speicherorte für eine DNA-Element in Escherichia coli mit einem neuartigen Transposon-vermittelte Ansatz

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, die optimale chromosomale Position eines gegebenen DNA-Elements durch Transposon-vermittelte zufällige Insertion, Konkurrenzexperimente und Ganzgenomsequenzierung zu bestimmen. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der DNA-Replikation zu beantworten, wie z. B. die Bedeutung einer chromosomalen Lokalisation eines genetischen Elements. Der Vorteil dieser Technik besteht darin, dass die transposonbasierte zufällige Insertion mit der Auswahl des fittesten Klons durch Wachstumsvorteil gekoppelt wird.

Hier wird es durch die E.coli DARS2-Region vereinfacht. Diese Methode kann zwar Aufschluss über die chromosomale Organisation von Escherichia coli geben, kann aber auch auf andere Bakterien angewendet werden. Nach der Aufbereitung von elektrokompetanten Zellen wie MG1655 delta DARS2 gemäß dem Textprotokoll fügen Sie ein Mikrogramm pNKBOR DARS2 zu 40 Mikrolitern Zellen hinzu und geben die Mischung in eine vorgekühlte sterile Küvette mit einem Abstand von 0,2 Zentimetern.

Setzen Sie die Küvette in die Elektroporationskammer ein. Dann elektropolieren Sie die Zellen mit 18 Kilovolt, 500 Ohm und 25 Mikrofarad. Die Zeitkonstante sollte etwa fünf Millisekunden betragen und es sollte keine Lichtbögen auftreten.

Die Bakteriensuspension wird schnell zurückgewonnen, indem man sie in einem Milliliter vorgewärmter LB-Brühe wieder suspendiert und in ein 15-Milliliter-Reagenzglas umfüllt. Inkubieren Sie die Zellen unter belüfteten Wachstumsbedingungen bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten ohne Antibiotikaauswahl. Dann werden die Bakterien auf die LB-Agarplatten aufgetragen, die mit 50 Mikrogramm pro Milliliter Kanamycin ergänzt werden, und die Platten über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubiert.

Zählen Sie am nächsten Tag die Völker aus der Elektroporation. Eine Kolonie wird als gleichwertig mit einer chromosomalen Transposon-Insertion angesehen. Gib einen Milliliter LB-Brühe auf jeden Teller und wasche alle Völker ab.

Verwenden Sie denselben einen Milliliter LB-Brühe wieder, um die Bakterienkonzentration zu erhöhen. Sammeln Sie dann alle Kolonien in derselben 50-Milliliter-Tube. Wirbeln Sie das Röhrchen vor, um das Ausgangsmaterial einzufrieren, und mischen Sie einen Milliliter Zellsuspension mit einem Milliliter 50%igem Glycerin auf Eis.

Übertragen Sie die Röhren für 10 Minuten auf Trockeneis. Sobald die Kulturen eingefroren sind, stellen Sie sie in einen Gefrierschrank mit minus 80 Grad Celsius. Tauen Sie die Transposon-Bibliothek ab minus 80 Grad Celsius auf Eis auf.

Mischen Sie durch Pipettieren und übertragen Sie dann 100 Mikroliter der Transposonbibliothek auf 10 Milliliter LB in einem 15-Milliliter-Reagenzglas. Züchten Sie die Zellen unter kontinuierlichem Schütteln bei 37 Grad Celsius für acht Stunden in die stationäre Phase. Passen Sie die Parameter nach Belieben an unterschiedliche Wachstumsbedingungen an.

Um die Bakterienpopulation etwa alle 10 Generationen zu vermehren, überführen Sie 10 Mikroliter der zuvor stationären Phase in 10 Milliliter frisches, vorgewärmtes Medium und züchten Sie die Kultur weitere acht Stunden lang in die stationäre Phase. Bewahren Sie nach jeweils 100 Wettkampfgenerationen fünf Ein-Milliliter-Proben auf und lagern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius. Bereiten Sie die Sonde für den Southern-Blot gegen einen ein Kilobyte großen Abschnitt des NKBOR durch PCR-Amplifikation mit spezifischen Primern vor, wie hier aufgeführt.

Führen Sie die Beispiele mit dem folgenden Programm aus. Markieren Sie das resultierende PCR-Fragment mit P32-markiertem dATP unter Verwendung des Random-Primer-Systems nach Smith und bereiten Sie die gesamte zelluläre DNA gemäß dem Textprotokoll vor. Verdauen Sie die gesamte zelluläre DNA mit Pvul, wodurch NKBOR mit der interessierenden Region außerhalb einer von der Sonde abgedeckten Region geschnitten wird.

Führen Sie einen Southern-Blot mit 0,7%igem Agarose-Gel nach Loebner-Olsen und von Freiesleben durch. Um DARS2-Insertionsstellen aus einzelnen Klonen nach schätzungsweise 700 Konkurrenzgenerationen mit einfachem Gen-Walking zu identifizieren, isolieren Sie genomische DNA für das PCR-Template, indem Sie zunächst Bakterien auf einer LB-Agarplatte verteilen und über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubieren. Beimpfen Sie LB-Brühe mit einzelnen Völkern und lassen Sie sie über Nacht bei 37 Grad Celsius wachsen.

Füllen Sie dann 20 Mikroliter in 200 Mikroliter autoklaviertes destilliertes Wasser um. Wirbeln Sie die Kolonien in Lösung und erhitzen Sie die Mischung dann 10 Minuten lang bei 100 Grad Celsius. Zentrifugieren Sie die Proben fünf Minuten lang bei maximaler Geschwindigkeit und bewahren Sie das Zelllysat dann bei minus 20 Grad Celsius für die zukünftige Verwendung auf.

Entwerfen Sie als Nächstes drei verschachtelte Primer, die innerhalb des Transposons Ihrer Wahl geglüht werden sollen, wie hier gezeigt. Verwenden Sie 200 Nanogramm genomische DNA, einen verschachtelten Primer und einen zufälligen Primer, um eine 20-Mikroliter-PCR-Reaktion vorzubereiten. Führen Sie dann die Beispiele mit dem folgenden Programm aus.

Für die zweite Amplifikation verwenden Sie einen Mikroliter der ersten Reaktion als Vorlage und verwenden Sie den verschachtelten Primer zwei und denselben zufälligen Primer. Führen Sie eine dritte Reaktion auf ähnliche Weise durch, indem Sie den verschachtelten Primer drei, denselben zufälligen Primer und einen Mikroliter aus der zweiten Reaktion als Template verwenden. Lassen Sie die Produkte aus der PCR-Endreaktion auf einem 1,5%igen Agarosegel und Statin mit Ethidiumbromid laufen.

Schneiden Sie eine Bande im Bereich von 100 bis 800 Basenpaaren aus und isolieren Sie die DNA mit einem handelsüblichen DNA-Gel-Extraktionskit gemäß den Anweisungen des Herstellers. Um eine Durchflusszytometrie durchzuführen, gleichen Sie jede Bakterienkultur aus, indem Sie sie mindestens 10 Generationen lang in der exponentiellen Wachstumsphase halten. Messen Sie den OD600 und stellen Sie sicher, dass er 0,3 nie überschreitet.

Um den Rifampicin-Auslauf gemäß dem Textprotokoll durchzuführen, überführen Sie einen Milliliter Kultur in ein 15-Milliliter-Röhrchen mit 30 Mikrolitern RIF-CEF. Inkubieren Sie das Röhrchen bei 37 Grad Celsius und schütteln Sie es mindestens vier Stunden lang. Für die EXP-Probe wird ein Milliliter exponentiell wachsender Kultur in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen auf Eis gegeben.

Ernten Sie die Zellen dann durch Zentrifugation bei 15.000 G und vier Grad Celsius für fünf Minuten. Suspendieren Sie das Pellet erneut in 100 Mikrolitern eiskaltem 10 Millimolar Tris pH 7,5 und fügen Sie einen Milliliter eiskaltes 77%iges Ethanol hinzu. Lagern Sie die Proben bis zur Verwendung bei vier Grad Celsius.

Färben Sie die Zellen, indem Sie 100 bis 300 Mikroliter fixierter Zellen durch Zentrifugation bei 15.000 mal G für 15 Minuten ernten. Entfernen Sie den Überstand und verwenden Sie 130 Mikroliter DNA-Färbelösung, um das Pellet wieder zu suspendieren. Inkubieren Sie die Proben dann 10 Minuten lang auf Eis und im Dunkeln.

Schließlich bestimmen Sie mit Hilfe der Durchflusszytometrie den Ursprung pro Zelle, die relative Zellmasse und den relativen DNA-Gehalt. Nach der Extraktion von DNA aus dem ursprünglichen Transposon-Pool und alle geschätzten 100 von 700 Wettbewerbsgenerationen wurde die DNA mit Pvul geschnitten, von dem bekannt ist, dass es das Transposon NKBOR DARS2 einmal in einer Region schneidet, die nicht von der Sonde abgedeckt wurde, und es wurde ein Southern-Blot durchgeführt. Wie hier gezeigt, fehlten dem anfänglichen DARS2-Pool deutliche Banden, was zeigt, dass DARS2 zufällig über das Chromosom eingefügt wurde.

Im Laufe der Zeit entwickelte sich ein Muster, bei dem sich der anfänglich große Pool von DARS2-Klonen zu nur einem oder wenigen persistenten DARS2-Klonen entwickelte. Die Sequenzierung des gesamten Genoms wurde verwendet, um DARS2-Insertionsstellen aus dem Startpool zu identifizieren. Und nach 400, 500 und 700 Generationen der Konkurrenz in einer repräsentativen Untergruppe der sequenzierten Insertion wurden 98% aller DARS2-Insertionen in der Nähe der chromosomalen Position des Wildtyps DARS2 gefunden.

Und 2% wurden an anderer Stelle auf dem Chromosom gefunden. Zuvor wurde gezeigt, dass DARS2-defiziente Zellen die Replikation synchron initiieren und eine Abnahme der Ursprungskonzentration im Vergleich zu Wildtyp-Zellen aufweisen. Hier stellt das Vorhandensein eines DARS2-Elements im Terminus die Synchronität oder den zellulären Ursprungsgehalt nicht auf Wildtyp-Niveau wieder her, während die ausgewählten DARS2-Klone IR und RPPH die Replikation synchron initiieren.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die optimale Chromosomenposition eines bestimmten DNA-Elements bestimmen können. Dies geschieht durch transposonbasierte zufällige Insertionen, gefolgt von Konkurrenzexperimenten und schließlich der Sequenzierung des gesamten Genoms.