Name: Bestimmung der optimalen chromosomalen Speicherorte für eine DNA-Element in Escherichia coli mit einem neuartigen Transposon-vermittelte Ansatz (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: Erfahren Sie die Bestimmung optimaler chromosomaler Positionen für DNA-Elemente in Escherichia coli mittels Transposon-vermittelter Insertion, Wettbewerbsexperimenten und Whole-Genome-Sequencing. Diese Methode liefert wertvolle Einblicke in die bakterielle Chromosomenorganisation.

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Die Autoren wurden durch Zuschüsse aus der Novo Nordisk Stiftung, die Lundbeck-Stiftung und der dänischen National Research Foundation (DNRF120) durch das Zentrum für bakterielle Stressantwort und Persistenz (BASP) finanziert.

1. Sammlung der Bibliothek Transposon Hinweis: die chromosomale Locus DARS2 wurde in die Mini Tn 10 geklont-basierte Transposon, NKBOR (auf pNKBOR) 21, was zu NKBOR:: DARS2 (pJFM1). pNKBOR erhalten Sie Online- 22. pNKBOR ist ein R6K-basierte Selbstmord-Vektor, der Initiator Protein π für Replikation 23 erfordert. Plasmid pJFM1 ist daher in der Lage, in einer E. Coli-Stamm (z. B. Dh5α λ Pir) mit einer chromosomalen Kopie des Gens Pir zu replizieren. Jedoch wenn der Pir-defizienten Wildtyp MG1655 pJFM1 verwandelt, pJFM1 kann nicht replizieren, zur Auswahl von Kanamycin-resistente Klone erzeugt durch die zufällige Einfügungen von NKBOR:: DARS2 in das bakterielle Chromosom. Der Einfachheit halber werden diese als DARS2 Einfügungen bezeichnet. Siehe Abbildung 1 für eine schematische Darstellung der Methodik.
<ol><li>Bereiten Electrocompetent MG1655 Δ DARS2 von der aktiv wachsenden Zellen in Lysogeny Brühe (LB) bei 37 ° C 24 gewachsen.</li>
	<li>Electroporate pJFM1 in Electrocompetent MG1655 Δ DARS2, laut Gonzales Et Al. 24 <ol><li>add 1 µg der pJFM1 (in 1 µL Wasser) bis 40 µL Electrocompetent E. Coli MG1655 Δ DARS2 und übertragen Sie diese Mischung auf eine Küvette vorgekühlt, sterilen 0,2 cm Lücke. Legen Sie die Küvette in die Elektroporation Kammer. Electroporate mit 18 kV, 500 Ω und 25 µF; die Zeitkonstante sollte ~5.0 ms, und keine Lichtbögen auftreten sollten.</li>
		<li>Schnell die Bakteriensuspension wiederherstellen, indem Sie es in 1 mL vorgewärmten LB Brühe und Transfer zum 15 mL Reagenzglas resuspending.</li>
		<li>Lassen die Zellen durch Inkubation unter belüftete Wachstumsbedingungen bei 37 ° C für 30 min, ohne Antibiotika Auswahl wiederherstellen. Die Bakterien auf LB-Agar-Platten ergänzt mit 50µg/mL Kanamycin-Platte und über Nacht bei 37 ° C inkubieren.</li>
	</ol></li> <li>Zählen die Kolonien aus der Elektroporation: eine Kolonie gilt gleich einem chromosomalen Transposon einfügen. 
	Hinweis: Kolonien nach Augenmaß oder mit einer Kolonie Zähler gezählt werden können. Die Anzahl der Kolonien ist umgekehrt proportional zu den durchschnittlichen Abstand zwischen der Transposons befindet sich im Chromosom von jeder Klon.</li>
	<li>Add 1 mL LB Brühe zu jeder Platte und alle Kolonien abwaschen; 1 mL LB Brühe sollte ausreichen, um ~ 100.000 Kolonien abwaschen. Die Wiederverwendung der gleichen 1 mL LB Brühe, die bakterielle Konzentration zu erhöhen. Bündeln Sie alle Kolonien in der gleichen 50 mL Tube.</li>
	<li>Wirbel der Röhre und frieren die Start-Material (t = 0). Um es zu fixieren, verrühren Sie 1 mL Zellsuspension mit 1 mL 50 % Glycerin auf Eis. Übertragen Sie die Rohre um Trockeneis für 10 min. Einmal die Kulturen gefroren sind, übertragen Sie sie auf einem-80 ° C Gefrierschrank. 
	Hinweis: Eine Zellkonzentration von mindestens 50.000 KBE/mL wird bei diesem Schritt erwartet.</li>
</ol> 2. Wettbewerb-Experiment in LB <ol><li>Tauwetter Transposon-Bibliothek von-80 ° C auf dem Eis. Mix von pipettieren.</li>
	<li>Transfer 100 µL der Transposon-Bibliothek zu 10 mL LB im Reagenzglas 15 mL.</li>
	<li>Wachsen die Zellen, belüftet durch kontinuierliche schütteln (250 u/min), für 8 h bei 37 ° C, stationäre Phase (d. h. OD 600 = ~ 4.0). Diese Parameter zu verschiedenen Wachstumsbedingungen wie gewünscht anpassen.</li>
	<li>Propagieren der Bakterienpopulation durch kontinuierlichen Transfers in frisch vorgewärmte Medium jeder ~ 10 Generationen. Zu diesem Zweck auf 10 mL frisches LB 10 µL der vorherigen stationären Phase Kultur übertragen und wachsen für eine weitere 8 h an der stationären Phase (d. h. OD 600 = ~ 4.0). 
	Hinweis: Da die Start- und Endzeiten optische Dichte sind die gleichen, 1,000-fold Verdünnung entspricht ~ 10 Generationen von Wachstum (2 10 = 1.024). Der Bakterienpopulation kann entweder direkt in frisch vorgewärmte Medium weitergegeben oder gespeichert bei 0-4 ° C (auf Eis) und am Folgetag propagiert. LB wurde hier verwendet, um möglichst viele zelluläre Verdoppelungen in kurzer Zeit wie möglich (Verdopplungszeit in der Nähe von 22 min.) zu gewährleisten.</li>
	<li>Nach jeweils 100 Generationen des Wettbewerbs sparen fünf 1-mL-Proben bei-80 ° C (wie in Schritt 3.3 beschrieben).</li>
	<li>Wenn die Fitness-Unterschiede zwischen den Zellen mit einzelnen Transposon Einfügungen klein sein sollen, halten Sie die Dauer des Wettbewerbs lange; hier 700 Generationen (t = 700) dienten.</li>
</ol> 3. Southern-Blot Analyse, Experiment über Wettkampfzeit zu überwachen <ol><li>bereiten die Sonde für die südlichen Fleck (1-kb-Abschnitt von der NKBOR) durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Amplifikation mit spezifischen Primer durchführen: NKBOR_Probe_FW : Gatgttggacgagtcggaat und NKBOR_Probe_RV: Cgttacatccctggcttgtt.
	<ol><li>Inkubation bei 98 ° C für 30 s für erste Denaturierung. Führen Sie dann 35 Zyklen bei 98 ° C für 10 s, 60 ° C für 30 s und 72 ° C für 45 s. Verwenden Sie für die letzte Erweiterung, 72 ° C für 10 min. 
		Hinweis: Die Vorlage für die PCR-Reaktion war ein gereinigtes pNKBOR Plasmid 21.</li>
		<li>Kennzeichnen die resultierende PCR-Fragment mit [α - 32P] dATP mit der zufälligen Primer-System nach Smith 25.</li>
	</ol></li> <li>Vorbereitung der gesamten zelluläre DNA nach Løbner-Olesen und von Freiesleben 26 für t = 0 und ausgewählten Zeitpunkten bis t = 700 Generationen des Wettbewerbs geschätzt.</li>
	<li>Verdauen die totale zelluläre DNA mit Pvu I, der schneidet die NKBOR mit der Region von Interesse einmal nur in einer Region nicht durch die Sonde abgedeckt; 1 Einheit der Pvu ich kann verwendet werden, um vollständig verdauen 1 µg Substrat DNA. 
	Hinweis: Die Sonde erkennt Fragmente mit einem Teil das Transposon, zusammen mit chromosomaler DNA verschiedener Längen, je nach der Insertionsstelle.</li>
	<li>Führen einen südlichen Fleck mit einer 0,7 % Agarosegel nach Løbner-Olesen und von Freiesleben 26.</li>
</ol> 4. Identifikation der fitteste Klone <ol><li>Gebrauch leicht gen gehen, wie von Harrison Et Al. beschrieben 27, DARS2 Einfügung Websites aus einzelnen Klone (isoliert auf LB-Platten) nach 700 geschätzte Generationen des Wettbewerbs zu identifizieren; Weitere Bands auf der Southern-Blot, die weitere Isolate sind erforderlich, um alle Transposon Einfügungen decken.
	<ol><li>Isolierung genomischer DNA für PCR-Vorlage. Bakterien auf eine LB-Agar-Platte mit 50 µg/mL Kanamycin verteilen und über Nacht bei 37 ° C inkubieren. Wachsen einzelne Kolonien über Nacht in LB Brühe bei 37 ° C und anschließend übertragen 20 µL in 200 µL autoklaviert destilliertes Wasser (oder verwendet DNA Reinigung, wie in Schritt 3.2).
		<ol><li>Vortex mischen. Erhitzen Sie die Mischung bei 100 ° C für 10 min und Zentrifuge mit max. Geschwindigkeit für 5 min. die Zelle lysate bei-20 ° C für eine spätere Verwendung speichern.</li>
		</ol></li> <li>Design drei verschachtelte Primer zu Tempern in das Transposon Wahl (siehe Abbildung 2 für eine grafische Darstellung der PCR-Strategie). 
		Hinweis: Nested Primer entwerfen sollten sicherstellen, dass verschachtelte Primer 3 am nächsten an die bekannten 5 liegt &#39; Ende das Transposon DNA, gefolgt von Nested Primer 2 und 1. Der Abstand zwischen den Nested Primer 3 und die 5 &#39; Ende des bekannten tRansposon DNA sollte ausreichend für eine Sequenz durchlesen von der bekannten DNA an die unbekannten DNA (um die spezifische chromosomale Transposon Einstichstelle zu finden). Für NKBOR wurden die folgenden verschachtelten Primer verwendet: pNKBOR_Nested3_RV: Gcagggctttattgattcca, pNKBOR_Nested2_RV: Tcagcaacaccttcttcacg, und pNKBOR_Nested1_RV: Actttctggctggatgatgg. Zufällige Zündkapseln, die mit der Anerkennung-Standorten der bekannten Restriktionsenzyme werden auch benutzt. Um ein Ergebnis zu erzielen, sollte man mindestens zwei verschiedene zufällige Primer verwenden. Die Restriktionsschnittstellen für die Restriktionsenzyme (e.g.,Sau 3AI und Hin dIII) sollte am 3 gefunden werden &#39; beenden und vorangegangen durch zehn zufällige Basen 5 &#39; - NNNNNNNNNNGATC - 3 &#39; und 5 &#39; - NNNNNNNNNNAAGCTT - 3 &#39; sind die Primer mit einer Sau 3AI Website (GATC) und einer Hin-dIII-Website (AAGCTT), bzw., wo N = A, T, G oder c</li>
		<li>Einsatz 200 ng genomic DNA in einem 20-µL-PCR-Reaktion. Inkubation bei 98 ° C für 30 s für die ursprünglichen Denaturierung. Führen Sie 25 Zyklen bei 98 ° C für 30 s, 50 ° C für 15 s und 72 ° C für 4 Minuten. Verwenden Sie für die letzte Erweiterung 72 ° C für 10 min. Einsatz Primer Paare bestehend aus Nested Primer 1 und eines zufälligen Primern.</li>
		<li>Grundierung Paare bestehend aus Nested Primer 2 und die gleichen zufällige Grundierung aus die zweite Verstärkung, mit 1 µL seine frühere Reaktion als Vorlage verwenden.</li>
		<li>Wiederholen Sie Schritt 4.1.4 mit Primer-Paaren bestehend verschachtelt Primer 3 und der gleichen zufällige Primer.</li>
		<li>Führen die Produkte von der endgültigen PCR-Reaktion auf eine 1,5 % Agarosegel und Fleck mit Interkalation Bromid. Schneiden Sie eine Band im Bereich von 100-800 bp und isolieren die DNA mit Hilfe kommerzieller DNA-Gel extrahieren Kit nach Angaben des Herstellers &#39; s-Richtung. Die DNA in 15 µL Wasser Aufschwemmen. 
		Hinweis: Vorsicht. Interkalation Bromid ist giftig und muss mit Vorsicht behandelt werden.</li>
		<li>Sequenz die Band isoliert im vorherigen Schritt (Schritt 4.1.6) mit Nested Primer 3 als Sequenzierung Primer, mit Sanger-Sequenzierung bei einem kommerziellen Anbieter.</li>
	</ol></li> <li>Durchführen WGS.
	<ol><li>Durchführen WGS auf die gesamte DNA extrahiert aus ausgewählt Proben während des Wettbewerbs-Experiment, wie beschrieben durch Frimodt-Møller Et Al 4.</li>
	</ol></li> <li>Sequenzierung Analyse.
	<ol><li>Align gepaart-Ende liest bis 150 Ns, NKBOR, AF310136.1 1.904 zusammenhängenden &#8230; 2.204 mit Bowtie2 28 mit einem Intervall zwischen Saatgut Teilzeichenfolgen (S, 1, 1,15) und eine maximale Anzahl von mehrdeutige Zeichen (L, 0, 0,9).</li>
		<li>Wählen Sie die ausgerichteten liest und dann neu ausrichten, um beide MG1655 Ref | NC_000913.3 und NKBOR gb | AF310136 mit BlastN 29</li> <li>weisen Umsetzung einsetzen Positionen an Knotenpunkten MG1655-NKBOR.</li>
	</ol></li></ol> 5. Flow Cytometry <ol><li>Proben für Durchflusszytometrie.
	<ol><li>Balance jeder Kultur indem Sie in der exponentiellen Wachstumsphase seit mindestens zehn Generationen beibehalten. Die OD 600 zu überprüfen und sicherzustellen, dass es nie mehr 0,3 als.</li>
		<li>Erfassen zwei Arten von Flow Proben.
		<ol><li>Für RIF-Rundlauf, 1 mL der Kultur auf eine 15 mL-Tube mit 30 µL der RIF-CEF (300 µg/mL Rifampicin und 36 µg/mL Cephalexin in 12,5 mM NaOH gelöst) übertragen. Lassen Sie es bei 37 ° C für mindestens 4 h schütteln. 
			Hinweis: Rifampicin blockiert indirekt die Einleitung der Chromosom-Replikation beim laufenden Runden der Replikation weiterhin zur Kündigung zulassen. Cephalexin verhindert die Zellteilung, die Replikation Rundlauf (RIF-Rundlauf) und die Ansammlung von Zellen mit vollständig replizierten Chromosomen führt. Die Anzahl der vollständig replizierten Chromosomen ist gleich der Anzahl der Ursprung zum Zeitpunkt der Behandlung mit Rifampicin und Cephalexin 20.</li>
			<li>Für die EXP-Probe, Transfer 1 mL der exponentiell wachsenden Kultur zu einer 1,5-mL-Tube auf Eis.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Die Zellen wie folgt zu beheben. Ernte der Zellen durch Zentrifugation bei 15.000 x g für 5 min bei 4 ° c Aufschwemmen das Pellet in 100 µL eiskalte 10 mM Tris pH 7,5 und fügen Sie 1 mL eiskaltes 77 % Ethanol. Die Proben bei 4 ° C bis zu seiner Verwendung zu speichern.</li>
	<li>Färben die Zellen wie folgt. Ernte 100-300 µL der fixen Zellen durch Zentrifugation bei 15.000 x g für 15 min. entfernen den Überstand und das Pellet in 130 µL Aufschwemmen &#34; DNA-Färbelösung &#34; (90 µg/mL Mithramycin, 20 µg/mL Interkalation Bromid, 10 mM MgCl 2 und 10 mM Tris, pH 7,5). Setzen Sie die Proben auf Eis und im Dunkeln; die Proben sind bereit für Flow-Zytometrie-Analyse nach 10 min 
	Hinweis: Andere DNA Flecken als Interkalation Bromid und Mithramycin kann auch gebrauchte 30 , 31.</li>
	<li>Bestimmen den Ursprung pro Zelle, die relative Zelle Masse und relative DNA-Gehalt von Flow-Zytometrie Analyse.
	<ol><li>Perform Durchflusszytometrie, wie zuvor beschrieben 32. RIF-Rundlauf und EXP-Proben mit dem Flow Cytometer Hersteller laufen &#39; Anweisungen des . Verwenden Sie für Mithramycin und Interkalation Bromid-gefärbten Zellen, Erregung Wellenlängen 395 und 440 nm und sammeln die Fluoreszenz über 565 nm.
		<ol><li>Die relative Zelle Masse und relative DNA-Gehalt bestimmen die EXP-Proben, Single-Parameter nach vorne-Licht Streuung im Vergleich zu Zelle Nummer Histogramme und Fluoreszenzintensität im Vergleich zu Zelle Nummer Histogramme für mindestens 30.000 Veranstaltungen zu erhalten ausführen entspricht das Mobilfunksignal.</li>
			<li>Einsatz vorwärts verstreut einzelne Parameter Lichtverteilung messen die durchschnittliche Relative Zell-Messe 
			Hinweis: Nach vorne verteilt Licht ist ein Maß für die durchschnittliche Zelle Masse 20.</li>
			<li>Verwendung Fluoreszenz Intensitätsverteilungen Single-Parameter zur Messung der durchschnittlichen DNS Inhalt 20.</li>
			<li>Erhalten die DNA-Konzentration als das Verhältnis der durchschnittlichen DNA-Gehalt auf die durchschnittliche Zelle Masse 20.</li>
		</ol></li> <li>Bestimmen Sie die Anzahl der Ursprünge pro Zelle.
		<ol><li>Run RIF-Rundlauf Proben zu Single-Parameter Fluoreszenzintensität versus Zelle Nummer Histogramme für mindestens 30.000 Veranstaltungen entspricht das Mobilfunksignal.</li>
			<li>Verwendung Fluoreszenz Intensitätsverteilungen Single-Parameter zu bestimmen, die Zahl der Chromosomen in jeder Zelle 20.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Asynchronie-Index (Ai) zu berechnen.
	<ol><li>Berechnen die Ai, wie durch Løbner-Olesen Et Al. beschrieben 32, mit Hilfe der Fluoreszenz einzelner Parameter Intensitätsverteilungen der RIF-Rundlauf Proben und die Formel Ki = (f3 + f5 + f6 + f7) / (f2 + f4 + f8), wo fx ist der Bruchteil Zellen mit x Anzahl der vollständig replizierten Chromosomen. Einweihungen als asynchrone betrachten A &#62; 0.1.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Die hier verwendete Methodik nutzt State-of-the-Art Techniken, eine schwierige Frage in Bezug auf die optimale genomische Position eines genetischen Elements zu beantworten. Die zufällige Aufnahme des genetischen Elements (vermittelt durch das Transposon) ermöglicht die schnelle und einfache Sammlung von Tausenden von Klone, die dann vorgenommen werden kann, wählen für die optimale Position des untersuchten genetischen Elements gegeneinander antreten (d.h. der fitteste Klon).
Hier wur...

Durch seine Lage im Genom kann die Funktion eines genetischen Elements beeinträchtigt werden. In Bakterien ergibt sich somit vor allem vor Störungen durch die Transkription des benachbarten Gene, lokalen DNA Topologie und/oder Replikation-assoziierten Gen Dosierung. Insbesondere die Prozesse der DNA-Replikation und Segregation gesteuert werden, mindestens im Teil, durch nicht-kodierenden chromosomalen Regionen1und die ordnungsgemäße Funktion dieser Regionen hängt genomische Position/Kontext. In e. coli, Beispiele sind die Dif -Standort, erforderlich für Schwester Chromosom Auflösung2; KOPS-Sequenzen, erforderlich für Chromosom Abtrennung3; Daten, DARS1und DARS2 Regionen, für die ordnungsgemäße chromosomale Replikation Steuerung (unten; ( 4). präsentieren wir Ihnen eine Methode, für die zufällige Umzug, Auswahl und Bestimmung der optimalen genetischen Kontext eines bestimmten genetischen Elements, hier veranschaulicht durch das Studium der DARS2 nicht-kodierende Region.
In E. Coli, DnaA ist der Initiator Protein verantwortlich für DNA-Strang Eröffnung um einzelne Replikation HerkunftoriC, und für die Einstellung von der Helikase DnaB5,6,7. DnaA gehört zu den AAA+ (d. h. ATPasen verbunden mit vielfältigen Aktivitäten) Proteine und ATP und ADP zu binden mit ähnlich hohen Affinitäten5. Das Niveau der DnaAATP peaks bei Einleitung8, wo DnaAATP bildet ein Multimer auf oriC auslöst, die DNA duplex Öffnung9. Nach der Einleitung oriC erfolgt durch einen Mechanismus mit der Bindung des Proteins SeqA Hemimethylated vorübergehend nicht verfügbar für Wiederaufnahme wegen Sequestrierung oriC10,11. Während der Sequestrierung, sinkt das Niveau der DnaAATP durch mindestens zwei Mechanismen: die regulatorischen Inaktivierung der DnaA (RIDA)12,13 und Daten-abhängige DnaAATP Hydrolyse (Gefässwiderstand)14 ,15. RIDA und Gefässwiderstand fördern die Umwandlung von DnaAATP zuADPDnaA. Vor einer neuen Runde der Initiation, DnaAADP wird wieder aktiviert, DnaAATP bei bestimmten DnaA-Reaktivierung Sequenzen (DARS): DARS1 und DARS216,17. Die chromosomalen Daten, DARS1und DARS2 Regionen sind nicht-kodierende und Handeln in einem Chaperon-Manier zu modulieren, DnaAATP/DnaAADP fußenden. Diese Regionen außerhalb der Ursprung der Replikation, ermöglichen der Montage von einem komplexen DnaA für entweder die Inaktivierung (Daten, 14) oder Aktivierung (DARS1 und DARS2; 17) der DnaA. DARS2 in einer Zelle löschen, ändert nicht Masse Verdoppelung Zeit aber Ergebnisse asynchroner Replikation Einleitung15,16,18. Jedoch DARS2-mangelhafte Zellen haben eine Fitness Kosten im Vergleich zu einer ansonsten isogenen Wildtyp, während beide kontinuierliches Wachstum Wettbewerb im Reich Medium oder die Einrichtung der Besiedlung im Darm Maus18. Dies bedeutet, dass bereits geringe Veränderungen Asynchronie/Herkunft Konzentration wirkt sich negativ auf die bakterielle Fitness haben. In E. Coligibt es einen Selektionsdruck auf Chromosom Symmetrie (d. h. zwei fast gleich lang Replikation Arme)19pflegen. Daten, DARS1und DARS2 Regionen haben den gleichen relativen Abstand zu oriC in alle E. Coli Stämme18, trotz großen Schwankungen in der Größe von Chromosom sequenziert.
Hier verwenden wir die DARS2 Region von E. Coli als Beispiel für die Identifizierung von der chromosomalen Position(en) optimal für seine Funktion. DARS2 wurde in das Transposon NKBOR und die daraus resultierende NKBOR eingefügt::DARS2 Transposon anschließend nach dem Zufallsprinzip eingefügt in das Genom der MG1655 ΔDARS2. Wir erzeugt somit eine Ansammlung von Zellen, jede besitzen DARS2 platziert an einem anderen Ort auf dem Chromosom. Ein in-vitro- Wettbewerb Experiment, wo alle Zellen in der Auflistung wurden gebündelt und während des kontinuierlichen Wachstums in LB für eine geschätzte 700 Generationen gegeneinander angetreten, wurde durchgeführt. Das Ergebnis des Experiments Wettbewerb wurde überwacht/ermittelt mithilfe von südlicher Fleck, leicht gen zu Fuß und Sequenzierung des gesamten Genoms (WGS; ( Abbildung 1). Endpunkt-Klone zu Fuss leicht gen gelöst waren gekennzeichnet durch Durchflusszytometrie, Zellzyklus Parameter zu bewerten. In einer durchflusszytometrischen Analyse können die Zellengröße, DNA-Gehalt und Einleitung Synchronität für eine große Anzahl von Zellen gemessen werden. Während der Durchflusszytometrie, ein Strom von Einzelzellen übergibt einen Lichtstrahl der entsprechenden Wellenlänge die gefärbte DNA begeistern die dann gleichzeitig durch Photomultiplier, die sammeln die emittierte Fluoreszenz, ein gewisses Maß an DNA-Gehalt, registriert ist sofern die Zellen sind für DNA gefärbt. Das vorwärts-verstreut Licht ist ein Maß für die Zelle Masse20.
Die in-vitro- Wettbewerb Experiment, das wir hier vorstellen wird verwendet, um Fragen in Bezug auf die Bedeutung der chromosomalen Position und genomische Kontext des genetischen Elements. Die Methode ist neutral und einfach zu bedienen.

<table><tbody><tr><td>Autoklavierte Mili-Q Wasser</td><td></td><td>Keine</td><td></td></tr><tr><td>Elektroporationsküvetten, 0,1 cm</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P41050</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad MicroPulser Elektroporationssystem</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2100</td><td></td></tr><tr><td>LB Bouillon</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12780029&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>LB Agar, Pulver (Lennox L Agar)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22700025</td><td></td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17904</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand&nbsp; Petrischalen aus Kunststoff</td><td>Fisher Scientific</td><td>S33580A</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50mL Konische Zentrifugenröhrchen</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 15mL Konische Zentrifugenröhrchen</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>Nunc&nbsp; Kryoröhren</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V7634&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity-DNA-Polymerase (2 U/&mikro; L)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F530S</td><td></td></tr><tr><td>dATP, [&alpha;-32P]- 3000Ci/mmol 10mCi/ml, 250 & Mikro; Ci</td><td>PerkinElmer</td> BLU012H250UC DECAprime II <td>DNA-Markierungskit</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM1455</td><td></td></tr><tr><td>Spektralphotometer&nbsp; SF/MBV/03.32</td><td>Pharmacia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hermle Zentrifuge&nbsp; &nbsp; &nbsp; SF/MBV/03.46</td><td>Hermle</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ole Dich Zentrifuge&nbsp; SF/MBV/03.29</td><td>Ole Dich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorftubes 1,5 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9661</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorftubes 2,0 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T2795</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Merck</td><td>6404</td><td></td></tr><tr><td>96% Ethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>16368</td><td></td></tr><tr><td>Trizma HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-3253</td><td></td></tr><tr><td>Phenol Ultra Pure</td><td>BRL</td><td>5509UA</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Merck</td><td>2445</td><td></td></tr><tr><td>Ribonuklease A Typ II A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R5000</td><td></td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfat (SDS)</td><td>Merck</td><td>13760</td><td></td></tr><tr><td>Lysozym</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L 6876</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>405-7</td><td></td></tr><tr><td>0,5M Na-EDTA pH 8.0</td><td>BRL</td><td>5575 UA</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycinsulfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10106801001</td><td></td></tr><tr><td>PvuI (10 U/&micro; L)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ER0621</td><td></td></tr><tr><td>Ultrareine Agarose</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16500500</td> DNA-Gel-Ladefarbstoff <td></td></tr><tr><td>(6X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0611</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Borat-EDTA-Puffer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4415</td><td></td></tr><tr><td>Ethidiumbromid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7637</td><td></td></tr><tr><td>Salzsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>433160</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71687</td><td></td></tr><tr><td>Whatman&nbsp; 3MM</td><td>Papiere Sigma-Aldrich</td><td>WHA3030931</td><td></td></tr><tr><td>SSC Buffer 20x mal; Konzentrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6639</td><td></td></tr><tr><td>Amersham Hybond-N+</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN119B</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll&nbsp; 400</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8016</td><td></td></tr><tr><td>Polyvinylpyrrolidon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PVP40</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin - Fraktion V</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85040C</td><td></td></tr><tr><td>Desoxyribonukleinsäure-Natriumsalz aus Lachshoden</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1626</td><td></td></tr><tr><td>Carestream Kodak &nbsp; BioMax &nbsp; Lichtfilm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z373494</td><td></td></tr><tr><td>GenElute &nbsp; Gel-Extraktionskit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>NA1111&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>GenElute &nbsp; PCR-Aufreinigungskit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>NA1020</td><td></td></tr><tr><td>T100&nbsp; Thermocycler</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SmartSpec Plus Spektralphotometer</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rifampicin</td><td>Serva</td><td>34514.01</td><td></td></tr><tr><td>Cephalexin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4895</td><td></td></tr><tr><td>Mithramycin</td><td>Serva</td><td>29803.02</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid-Hexahydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>246964</td><td></td></tr><tr><td>Apogee A10 Instrument</td><td>Apogee</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

bestimmung der optimalen chromosomalen speicherorte für eine dna-element in escherichia coli mit einem neuartigen transposon-vermittelte ansatz

Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Die optimale chromosomalen Position(en) eines bestimmten DNA-Elements war/waren bestimmt durch Transposon-vermittelten zufällige Einblendung gefolgt von Fitness-Auswahl. In Bakterien kann die Auswirkungen der genetischen Kontext auf die Funktion eines genetischen Elements schwer abzuschätzen sein. Mehrere Mechanismen, einschließlich topologische Effekte, transkriptionelle Interferenz von benachbarten Gene und/oder Replikation-assoziierten Gen Dosierung, können die Funktion eines bestimmten genetischen Elements beeinflussen. Hier beschreiben wir eine Methode, die erlaubt die zufällige Integration eines DNA-Elements in das Chromosom von Escherichia coli und wählen Sie die günstigsten Standorten mit einem einfachen Wachstum Wettbewerb zu experimentieren. Die Methode nutzt eine gut beschriebene Transposon-basiertes System der zufällige Insertion, gepaart mit einer Auswahl an der stärkeren Clone(s) von Wachstum nutzen, ein Verfahren, das auf experimentelle Bedürfnisse leicht einstellbar ist. Die Art der fitteste Clone(s) kann durch ganze Genomsequenzierung auf eine komplexe Multi-klonale Population oder einfach zu Fuß für die schnelle Identifizierung von ausgewählten Klonen gen bestimmt werden. Hier war die nicht-kodierenden DNA-Region DARS2, die die Initiation der Replikation der Chromosomen in E. Colikontrolliert, als Beispiel verwendet. Die Funktion des DARS2 ist bekannt durch Replikation-assoziierten Gen Dosierung beeinträchtigt werden; der engere DARS2 ruft nach der Herkunft der DNA-Replikation, desto aktiver wird es. DARS2 wurde nach dem Zufallsprinzip in das Chromosom ein DARS2eingefügt-Belastung gelöscht. Die daraus resultierende Klone mit einzelnen Einfügungen wurden gebündelt und für Hunderte von Generationen gegeneinander konkurrierten. Schließlich wurden die fittesten Klone gekennzeichnet und festgestellt, dass DARS2 eingefügt in unmittelbarer Nähe zu den Originalschauplätzen der DARS2 enthalten.

Ein südlicher Fleck wurde getan, um sicherzustellen, dass DARS2 das Chromosom in der Transposon-Bibliothek nach dem Zufallsprinzip verteilt wurde (t = 0) und, die die stärksten Klonen würde im Laufe der Zeit beibehalten. Der Southern Blot erfolgte auf DNA extrahiert aus dem anfänglichen Transposon-Pool (bei t = 0) und alle geschätzten 100 aus 700 Generationen des Wettbewerbs (Abbildung 3). Hier war die totale zelluläre DNA aus jeden Zeitpunkt verdaut...

Hier war die Macht der ein Transposon-vermittelten zufällige einführen eines nicht-kodierende DNA-Elements verwendet, um seine optimale chromosomalen Position zu lösen.

Bestimmung der optimalen chromosomalen Speicherorte für eine DNA-Element in Escherichia coli mit einem neuartigen Transposon-vermittelte Ansatz

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, die optimale chromosomale Position eines beliebigen DNA-Abschnitts mithilfe von transposonvermittelter zufälliger Insertion, Konkurrenzexperimenten und Ganzgenomsequenzierung zu bestimmen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der DNA-Replikation zu beantworten, beispielsweise welche Bedeutung die chromosomale Lage eines genetischen Elements hat. Der Vorteil dieser Technik liegt darin, dass sie die zufällige Insertion auf Transposonbasis mit der Selektion des am besten angepassten Klons durch Wachstumsvorteil verbindet.Hier wird es durch die E.coli-DARS2-Region vereinfacht. Obwohl diese Methode Einblicke in die chromosomale Organisation von Escherichia coli liefern kann, ist sie auch auf andere Bakterien anwendbar. Nach der Herstellung elektrokompententer Zellen, beispielsweise MG1655 delta DARS2 gemäß dem Textprotokoll, fügen Sie ein Mikrogramm pNKBOR DARS2 zu 40 Mikrolitern Zellen hinzu und überführen das Gemisch in eine vorab gekühlte sterile Küvette mit 0,2 Zentimeter Spaltbreite.Platzieren Sie die Küvette in die Elektroporationskammer. Elektroporieren Sie anschließend die Zellen bei 18 Kilovolt, 500 Ohm und 25 Mikrofarad. Die Zeitkonstante sollte etwa fünf Millisekunden betragen, und es sollte kein Lichtbogen entstehen.Stellen Sie die bakterielle Suspension schnell wieder her, indem Sie sie in einem Milliliter vorgewärmter LB-Brühe resuspendieren und in ein 15-Milliliter-Reagenzglas überführen. Inkubieren Sie die Zellen unter belüfteten Wachstumsbedingungen bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten ohne antibiotische Selektion. Anschließend impfen Sie die Bakterien auf LB-Agarplatten, die mit 50 Mikrogramm pro Milliliter Kanamycin ergänzt sind, und inkubieren die Platten über Nacht bei 37 Grad Celsius.Am folgenden Tag die Kolonien aus der Elektroporation zählen. Eine Kolonie gilt als ein chromosomaler Transposon-Einbau. Zu jeder Platte ein Milliliter LB-Brühe hinzufügen und alle Kolonien abwaschen.Verwenden Sie dieselbe Menge von einem Milliliter LB-Brühe, um die bakterielle Konzentration zu erhöhen. Anschließend sammeln Sie alle Kolonien in demselben 50-Milliliter-Röhrchen. Vortexen Sie das Röhrchen, um das Ausgangsmaterial einzufrieren, und mischen Sie einen Milliliter Zellsuspension mit einem Milliliter 50 % Glycerin auf Eis.Überführen Sie die Röhrchen für 10 Minuten in Trockeneis. Sobald die Kulturen eingefroren sind, bringen Sie sie in einen Gefrierschrank bei minus 80 Grad Celsius. Tauen Sie die Transposon-Bibliothek von minus 80 Grad Celsius auf Eis auf.Mischen Sie durch Pipettieren und überführen Sie dann 100 Mikroliter der Transposon-Bibliothek in 10 Milliliter LB in einem 15-Milliliter-Reagenzglas. Kultivieren Sie die Zellen unter Belüftung mit kontinuierlichem Schütteln bei 37 Grad Celsius für acht Stunden bis zur stationären Phase. Passen Sie die Parameter nach Bedarf an unterschiedliche Wachstumsbedingungen an.Um die bakterielle Population etwa alle 10 Generationen zu vermehren, überführen Sie 10 Mikroliter der zuvor im stationären Wachstumsstadium befindlichen Kultur in 10 Milliliter frisches, vorgewärmtes Medium und inkubieren die Kultur weitere acht Stunden bis zum Erreichen der stationären Phase. Speichern Sie nach jeweils 100 Generationen der Konkurrenz fünf Proben zu je einem Milliliter und lagern Sie diese bei minus 80 Grad Celsius. Bereiten Sie die Sonderprobe für den Southern Blot gegen einen ein-Kilobasen-Abschnitt des NKBOR durch PCR-Amplifikation unter Verwendung spezifischer Primer vor, wie hier aufgelistet.Führen Sie die Proben mit dem folgenden Programm durch. Markieren Sie das resultierende PCR-Fragment mit P32-markiertem dATP unter Verwendung des Zufallsprimer-Systems gemäß Smith und bereiten Sie die gesamte zelluläre DNA gemäß dem Textprotokoll vor. Verdauen Sie die gesamte zelluläre DNA mit Pvul, das NKBOR schneidet, wobei der Bereich von Interesse außerhalb eines von der Sonde abgedeckten Bereichs liegt.Führen Sie einen Southern-Blot mit einem 0,7 %igen Agarosegel gemäß Loebner-Olsen und von Freiesleben durch. Um mit der einfachen Gen-Geht-Methode (easy gene walking) DARS2-Einbaustellen aus einzelnen Klonen zu identifizieren, isolieren Sie nach etwa 700 Generationen der Konkurrenz genomische DNA als PCR-Vorlage, indem Sie Bakterien zunächst auf einer LB-Agarplatte ausstreichen und über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubieren. Impfen Sie LB-Brühe mit einzelnen Kolonien an und kultivieren Sie diese über Nacht bei 37 Grad Celsius.Überführen Sie anschließend 20 Mikroliter in 200 Mikroliter autoklaviertes destilliertes Wasser. Vortexen Sie die Kolonien in Lösung und erhitzen Sie das Gemisch dann 10 Minuten lang auf 100 Grad Celsius. Zentrifugieren Sie die Proben bei maximaler Drehzahl für fünf Minuten und bewahren Sie anschließend das Zelllysat bei minus 20 Grad Celsius für die spätere Verwendung auf.Als Nächstes entwerfen Sie drei geschachtelte Primer, die innerhalb des gewählten Transposons annealen, wie hier gezeigt. Verwenden Sie 200 Nanogramm genomische DNA, den geschachtelten Primer eins und einen zufälligen Primer, um eine 20-Mikroliter-PCR-Reaktion vorzubereiten. Führen Sie anschließend die Proben mit dem folgenden Programm durch.Verwenden Sie für die zweite Amplifikation ein Mikroliter der ersten Reaktion als Vorlage und verwenden Sie den nested Primer zwei sowie denselben zufälligen Primer. Führen Sie eine dritte Reaktion in ähnlicher Weise unter Verwendung des nested Primers drei, des gleichen zufälligen Primers und eines Mikroliters aus der zweiten Reaktion als Vorlage durch. Laufen Sie die Produkte der abschließenden PCR-Reaktion auf einem 1,5%-Agarosegel und färben Sie mit Ethidiumbromid. Schneiden Sie ein Band im Bereich von 100 bis 800 Basenpaaren aus und isolieren Sie die DNA mithilfe eines kommerziellen DNA-Gel-Extraktionskits gemäß den Anweisungen des Herstellers. Um die Durchflusszytometrie durchzuführen, balancieren Sie jede Bakterienkultur, indem Sie sie mindestens über 10 Generationen in der exponentiellen Wachstumsphase halten. Messen Sie den OD600 und stellen Sie sicher, dass dieser niemals 0,3 überschreitet.Um die Rifampicin-Auslaufen gemäß dem Textprotokoll durchzuführen, überführen Sie ein Milliliter Kultur in ein 15-Milliliter-Gefäß, das 30 Mikroliter RIF-CEF enthält. Inkubieren Sie das Gefäß bei 37 Grad Celsius unter Schütteln für mindestens vier Stunden. Für die EXP-Probe überführen Sie ein Milliliter exponentiell wachsende Kultur in ein 1,5-Milliliter-Gefäß auf Eis.Anschließend die Zellen durch Zentrifugation bei 15.000 × g und vier Grad Celsius für fünf Minuten gewinnen. Den Pellet in 100 Mikrolitern eiskaltem 10 Millimolar Tris pH 7,5 resuspendieren und ein Milliliter eiskalten 77 %igen Ethanol hinzufügen. Die Proben bis zur Verwendung bei vier Grad Celsius lagern.Färben Sie die Zellen, indem Sie 100 bis 300 Mikroliter fixierte Zellen durch Zentrifugation bei 15.000 × g für 15 Minuten pelletieren. Entfernen Sie den Überstand und verwenden Sie 130 Mikroliter DNA-Färbelösung, um das Pellet erneut aufzuschwemmen. Anschließend inkubieren Sie die Proben 10 Minuten lang auf Eis und im Dunkeln.Verwenden Sie abschließend die Durchflusszytometrie, um den Ursprung pro Zelle, die relative Zellmasse und den relativen DNA-Gehalt zu bestimmen. Nach der Extraktion der DNA aus dem ursprünglichen Transposon-Pool und jeweils nach geschätzten 100 von 700 Generationen des Wettbewerbs wurde die DNA mit Pvul geschnitten, das bekanntermaßen das Transposon NKBOR DARS2 einmal in einem Bereich schneidet, der nicht durch die Sonde abgedeckt ist, und anschließend wurde ein Southern-Blot durchgeführt. Wie hier gezeigt, wies der anfängliche DARS2-Pool keine deutlichen Banden auf, was darauf hindeutet, dass DARS2 zufällig im gesamten Chromosom eingefügt wurde.Im Laufe der Zeit zeigte sich ein Muster, bei dem sich der anfängliche große Pool an DARS2-Klonen zu nur einem oder wenigen persistierenden DARS2-Klonen entwickelte. Die Ganzgenomsequenzierung wurde verwendet, um DARS2-Einfügestellen aus dem Startpool zu identifizieren. Nach 400, 500 und 700 Generationen des Wettbewerbs in einer repräsentativen Teilmenge der sequenzierten Einfügungen wurden 98 % aller DARS2-Einfügungen nahe der chromosomalen Lokalisation des Wildtyps DARS2 gefunden.Und 2 % wurden an anderen Stellen des Chromosoms gefunden. Es wurde bereits früher gezeigt, dass DARS2-defiziente Zellen die Replikation synchron initiieren und eine verringerte Initiationsstellenkonzentration im Vergleich zu Wildtyp-Zellen aufweisen. Hier bewirkt das Vorhandensein eines DARS2-Elements im Terminus weder eine Wiederherstellung der Synchronität noch des Initiationsstellengehalts auf Wildtyp-Niveau, während die ausgewählten DARS2-Klone IR und RPPH die Replikation synchron initiieren.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die optimale chromosomale Position eines gegebenen DNA-Abschnitts bestimmt werden kann. Dies geschieht durch transposonbasierte zufällige Insertionen, gefolgt von Wettbewerbsversuchen und schließlich der Sequenzierung des gesamten Genoms.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Die Produktion von C. elegans Transgene via Recombineering mit dem GalK Selektionsmarker

Eine schnelle und effiziente Methode, um Fremd-DNA von Interesse in vorgefertigte Akzeptor Stämme, sogenannte Landing-Pad-Stämme, die Integration beschrieben wird. Das Verfahren erlaubt eine ortsspezifische Integration eines DNA-Kassette in die gentechnisch Landeplatz Ort einer gegebenen Dehnung, durch Konjugation und Expression des ΦC31 Integrase.

Site-spezifische bakterielle Chromosom Engineering: ΦC31 Integrase vermittelte Cassette Exchange (IMCE)

Systematische, groß angelegte synthetische genetische (Gen-Gen-oder Epistase) Interaktion Bildschirme können verwendet werden, um genetische Redundanz und Weg cross-talk zu erkunden. Hier haben wir eine High-Throughput-quantitative synthetischen genetischen array Screening-Technologie beschreiben, bezeichnet ESGA dass wir für die Aufklärung epistatische Beziehungen und erforschen genetische Interaktion Netze in den...

Mapping Bakterielle Functional Netzwerke und Pathways in<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Verwendung von Synthetic Genetic Arrays

Quelle: Kazi, M. I., et. al., Generierung von Transposon-Insertionsbibliotheken in gramnegativen Bakterien für die Hochdurchsatz-Sequenzierung. J. Vis. exp. (2020)Dieses Video zeigt die Selektion, Quantifizierung und Konservierung von Gram-negativen Empfängerbakterien, die Transposon-Insertionen auf der Grundlage von Kanamycin-Resistenz tragen.

Isolierung gramnegativer Bakterien mit genomischen Transposon-Insertionen

Enterobacter sp. Ysu wächst in Glucose-Minimalsalzmedium. Auxotrophe werden durch Transformation mit einem transposome die zufällig fügt sich in das Wirtsgenom erzeugt. Mutanten werden durch Replika-Plattierung aus komplexen Medium, um Minimalmedium gefunden. Unterbrochen Gene durch Gen Rettungs- und Sequenzierung identifiziert.

Erzeugung Enterobacter Sp. Ysu Auxotrophe Mit Transposon-Mutagenese

Hier stellen wir ein Protokoll vor, um ein Gen von Interesse auszuschalten, das an der Plasmidkonjugation beteiligt ist, und anschließend die Auswirkungen seiner Abwesenheit mit Hilfe von Paarungsassays zu analysieren. Die Funktion des Gens wird mit Hilfe von Deletions- oder Punktmutationen auf eine bestimmte Region seiner Sequenz weiter untersucht.

Konjugative Mating Assays für sequenzspezifische Analyse der Übertragung beteiligten Proteine ​​in bakteriellen Konjugation

Präsentiert hier ist eine einfache Methode zum Erstellen einer High-Density Transposon Einfügung Bibliothek in Escherichia coli oder Shigella Flexneri mit bakteriellen Konjugation. Dieses Protokoll ermöglicht die Erstellung einer Sammlung von Hunderten von Tausenden von einzigartigen Mutanten in Bakterien durch die zufällige genomische Einfügung ein Transposon.

Schaffung einer dichten Transposon Insertion Bibliothek verwenden bakterielle Konjugation in Enterobacterial Stämme wie Escherichia Coli oder Shigella flexneri

Die reziproke Hemizygosität durch Sequenzierung (RH-seq) ist eine leistungsstarke neue Methode, um die genetische Grundlage eines Merkmalsunterschieds zwischen den Arten abzubilden. Pools von Hemizygoten werden durch Transposon-Mutagenese erzeugt und ihre Fitness wird durch Wettbewerbswachstum mit einer durchgehenden Sequenzierung verfolgt. Die Analyse der resultierenden Daten zeigt Gene, die dem Merkmal zugrunde liegen.

Genetische Kartierung von Thermotoleranzunterschieden zwischen Spezies von Saccharomyces Hefe über Genom-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

Wir beschreiben eine Methode zur Generierung von sättigungsverstärkenden Mutationsbibliotheken in gramnegativen Bakterien und der anschließenden Herstellung von DNA-Amplikonbibliotheken für die Sequenzierung mit hohem Durchsatz. Als Beispiel konzentrieren wir uns auf den ESKAPE-Erreger Acinetobacter baumannii, aber dieses Protokoll ist für eine Vielzahl von Gram-negativen Organismen zugänglich.

Generieren von Transposon-Einfügungsbibliotheken in gramnegativen Bakterien für die Sequenzierung mit hohem Durchsatz

Dies ist eine angepasste Methode zur Identifizierung von Kandidaten für Insektenbesiedlungsfaktoren in einem Burkholderia-nützlichen Symbionten. Der Käferwirt ist mit einer zufälligen mutanten Bibliothek infiziert, die durch Transposonmutagenese erzeugt wird, und die Bibliothekskomplexität nach der Kolonisation wird mit einer in vitro gezüchtetenKontrolle verglichen.

Transposon-Insertionssequenzierung als Werkzeug zur Aufklärung bakterieller Besiedlungsfaktoren in einem Burkholderia gladioli Symbionten von Lagria villosa Käfern

Erfahren Sie die Bestimmung optimaler chromosomaler Positionen für DNA-Elemente in Escherichia coli mittels Transposon-vermittelter Insertion, Wettbewerbsexperimenten und Whole-Genome-Sequencing. Diese Methode liefert wertvolle Einblicke in die bakterielle Chromosomenorganisation.

Bestimmung der optimalen chromosomalen Speicherorte für eine DNA-Element in Escherichia coli mit einem neuartigen Transposon-vermittelte Ansatz (Video) | JoVE Journal

Bestimmung der optimalen chromosomalen Speicherorte für eine DNA-Element in Escherichia coli mit einem neuartigen Transposon-vermittelte Ansatz

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