Ein genetisch manipuliertes Mausmodell des sporadischen Darmkrebses
6. Juli 2017
Ein Protokoll für die Etablierung eines gentechnisch veränderten Mausmodells von Darmkrebs durch segmentale Adeno-Cre-Infektion und deren Überwachung durch hochauflösende Koloskopie wird vorgestellt.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine segmentale Adeno-Cre-Infektion des Dickdarms in einem gentechnisch veränderten Mausmodell zu erreichen. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet des Darmkrebses (CRC) zu beantworten, da sie ein hervorragendes Modell für die Untersuchung der Biologie und Behandlung von CRC darstellt. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass jedes Labor mit Erfahrung in der Nagetierchirurgie dieses Modell verwenden kann, um hochgradig reproduzierbare und leicht zugängliche Tumore im Dickdarm zu erzeugen.
Beginnen Sie damit, eine betäubte Maus in Rückenlage zu bringen und Salbe auf die Augen des Tieres aufzutragen. Kleben Sie die Maus in eine sichere Position und bestätigen Sie dann den entsprechenden Sedierungsgrad durch Zusammenkneifen der Zehen. Machen Sie einen etwa 15 Millimeter großen Schnitt in der Mittellinie in der Haut des Unterbauchs.
Fassen Sie dann mit einer Pinzette die Bauchwandmuskulatur und schneiden Sie den Muskel vorsichtig mit einer Schere ein, um die Bauchhöhle zu öffnen. Nach der Identifizierung des distalen Dickdarms wird das Gewebe vorsichtig mit einer feinen Klemme etwa 15 Millimeter proximal zum Anus umklammert. Führen Sie als Nächstes einen flexiblen Teflonschlauch transanal ein und schieben Sie den Schlauch vorsichtig vor, bis er den luminalen Verschluss erreicht.
Kanülieren Sie das Rohr mit einer 30-Gauge-Kanüle. Schließen Sie eine Standard-Ein-Milliliter-Spritze an die Kanüle an und spülen Sie den Dickdarm mit mehreren Millilitern normaler Kochsalzlösung, bis alle Fäkalien evakuiert sind. Sobald der distale Dickdarm leer ist, ersetzen Sie den Kochsalzschlauch durch einen neuen Teflonschlauch und verwenden Sie eine zweite Klemme, um den Dickdarm etwa drei Millimeter distal der ersten Klemme zu verschließen.
Mit einer zweiten Ein-Milliliter-Spritze, die mit einer 30-Gauge-Kanüle ausgestattet ist, injizieren Sie vorsichtig 50 bis 80 Mikroliter 0,25 % Trypsin-EDTA in das geklemmte Dickdarmsegment. Der Dickdarm sollte sich so weit aufblähen, dass die Schleimhautbarriere aufgebrochen wird, ohne das eingeklemmte Gewebesegment zu perforieren. Entfernen Sie nach 10 Minuten die distale Klemme.
Entfernen Sie dann den Trypsinschlauch und spülen Sie den distalen Dickdarm mit 500 Mikrolitern normaler Kochsalzlösung. Nach dem Einsetzen eines neuen Teflonschlauchs klemmen Sie den Dickdarm wieder ein und blasen das Gewebe mit 50 bis 80 Mikrolitern der adenoviralen Lösung auf. Entfernen Sie nach 30 Minuten die Klemmen und den Schlauch und verschließen Sie die Bauchdecke mit 6-0 schnell resorbierbaren Laufnähten.
Verschließen Sie die Haut mit chirurgischen Wundklammern und überwachen Sie das Tier auf einem Heizkissen, bis es sich vollständig erholt hat. Um das Tumorwachstum mittels Koloskopie zu überwachen, legen Sie das anästhesierte tumortragende Tier in Rückenlage auf ein Heizkissen und führen Sie das Endoskop transanal in den Darmtrakt ein. Insufflieren Sie die Luft sanft unter visueller Kontrolle, um den Dickdarm zu dehnen.
Schieben Sie dann das Oszilloskop vorsichtig nach vorne, bis eine Schleimhautläsion im distalen Dickdarm identifiziert werden kann, wobei jedes endoskopische Bild gespeichert wird, während es für eine spätere Auswertung aufgenommen wird. Wenn alle Bilder aufgenommen wurden, entfernen Sie das Endoskop langsam und legen Sie die Maus auf ein 38 Grad Celsius heißes Heizkissen, bis sie vollständig wiederhergestellt ist. Die Tumore können einfach und wiederholt per Darmspiegelung überwacht werden, ohne dass die Tiere stark belastet werden.
Die Krankheitsmanifestationen sind denen des menschlichen Darmkrebses sehr ähnlich, wobei die Tiere zunächst Adenome entwickeln, gefolgt von der Entwicklung eines Adenokarzinoms im distalen Dickdarm. Abhängig vom bedingten Genotyp der Tiere metastasieren die Tumoren auch in das Bauchfell und in die Leber. Wenn ein fluoreszierendes Cre-Reporter-Allel verwendet wird, können die Tumormanifestationen leicht durch Fluoreszenzproteinexpression identifiziert werden, die je nach Reporterallel hell genug sein kann, um bei Tageslicht sichtbar gemacht zu werden.
Histologisch sind 95% der sich entwickelnden Tumoren Adenokarzinome, die dem menschlichen Darmkrebs sehr ähnlich sind und das gesamte Spektrum der Tumorentwicklung vom nicht-invasiven Adenom bis zum Adenokarzinom aufweisen, das in die umgebenden Strukturen eindringt. Einmal gemeistert, kann diese Technik in 50 Minuten abgeschlossen werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, immer besonders auf die Verletzlichkeit des Dickdarms zu achten.
Eine Perforation führt unweigerlich zu Peritonitis und Sepsis und erfordert einen Abbruch des Einlaufs. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Adenoviren Sicherheitsmaßnahmen der Biosicherheitsstufe zwei erfordert, da das Virus gefährlich sein kann.
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Übersicht
In diesem Artikel wird ein Protokoll zur Erstellung eines genetisch veränderten Mausmodells für Darmkrebs mittels segmentaler Adeno-Cre-Infektion vorgestellt. Das Modell wird mittels hochauflösender Koloskopie überwacht und stellt ein wertvolles Werkzeug zur Untersuchung der Biologie und Behandlung von Darmkrebs dar.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Darmkrebsforschung
- Genetisch veränderte Mausmodelle
- Onkologie
Hintergrund
- Das kolorektale Karzinom (CRC) ist ein bedeutendes Gesundheitsproblem.
- Genetisch veränderte Mausmodelle sind für die Krebsforschung unverzichtbar.
- Mittels segmentaler Adeno-Cre-Infektion kann eine lokalisierte Tumorentwicklung induziert werden.
- Die hochauflösende Koloskopie unterstützt die Tumorkontrolle.
Zweck der Studie
- Etablierung eines reproduzierbaren Modells für die Darmkrebsforschung.
- Erleichterung der Untersuchung der Biologie des Darmkrebses und der Behandlungsoptionen.
- Bereitstellung einer Methode, die für Labore mit Erfahrung in der Chirurgie von kleinen Nagetieren zugänglich ist.
Verwendete Methoden
- Segmentale Adeno-Cre-Infektion des Kolons.
- Verwendung anästhetisierter Mäuse für chirurgische Eingriffe.
- Anwendung der hochauflösenden Koloskopie zur Tumormonitoring.
- Erzeugung kolonlokalisierter Tumoren zu Forschungszwecken.
Hauptergebnisse
- Das Protokoll ermöglicht die erfolgreiche Einrichtung lokalisierte Tumoren.
- Hohe Reproduzierbarkeit der Ergebnisse über verschiedene Versuche hinweg.
- Zugänglichkeit für Labore mit grundlegenden chirurgischen Fähigkeiten.
- Potenzial, kritische Fragen in der Darmkrebsforschung zu beantworten.
Schlussfolgerungen
- Das etablierte Modell ist ein wertvolles Werkzeug für Studien zum kolorektalen Karzinom (CRC).
- Es vertieft das Verständnis der CRC-Biologie und -Therapie.
- Zukünftige Forschungsarbeiten können auf dieser Methodik aufbauen, um weitere Erkenntnisse zu gewinnen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Dieses genetisch veränderte Mausmodell schließt eine entscheidende Lücke in der Forschung zum kolorektalen Karzinom, indem es ein reproduzierbares, immunkompetentes System bereitstellt, das die menschliche Tumorentwicklung vom Adenom bis zum Adenokarzinom eng nachahmt. Die segmentale Adeno-Cre-Infektionsmethode ermöglicht eine lokalisierte Tumorinduktion im distalen Kolon, verringert die Variabilität und unterstützt die mechanistische Risikominimierung in präklinischen Studien. Die Verträglichkeit mit der longitudinalen Überwachung mittels Koloskopie verbessert die translationale Kontinuität und stärkt das Vorhersagevertrauen bei der therapeutischen Bewertung.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen in einem krankheitsrelevanten System mit intakter Immuncompetenz.
- Operationaler Wert: Unterstützt die biologische Ent风险bewertung durch einheitliche Tumorentwicklung und histopathologische Übereinstimmung mit dem menschlichen kolorektalen Karzinom.
- Prädiktiver Wert: Erleichtert die Target-Validierung, indem molekulare Signalwege in einem räumlich kontrollierten Tumormikromilieu bewertet werden können.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt quantifizierbare, überwachbare Tumoren mittels Kolonoskopie und ermöglicht so die longitudinale Verfolgung von Biomarkern.
- Operative Bedeutung: Bietet eine standardisierte, reproduzierbare Plattform zur Beurteilung der Wirkstoffantwort über die Zeit.
- Skalierbarkeit: Kompatibel mit Workflows für hochauflösende Bildgebung und unterstützt damit longitudinale Studiendesigns in Entdeckungspipelines.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationale Kontinuität: Modelliert das gesamte Spektrum des Tumorprogressionsverlaufs, von Adenom bis hin zu invasivem Adenokarzinom, wodurch die menschliche Erkrankung nachgebildet wird.
- Metastasenbewertung: Ermöglicht die Beurteilung peritonealer und hepatischer Metastasen basierend auf dem konditionalen Genotyp und unterstützt so entscheidungsrelevante risikoadjustierte Fortschritte.
- Fluoreszenzmarkierung zur Verfolgung: In Kombination mit Cre-Reporter-Allelen ermöglicht dies die nichtinvasive Visualisierung von Tumoren und verbessert dadurch die Endpunktbestimmung in therapeutischen Studien.
Pipeline- und Workflow-Integration
Das Modell fügt sich in die Entdeckungskette von der Target-Validierung über die Lead-Identifizierung bis hin zur präklinischen Wirksamkeitsprüfung ein, insbesondere für Wirkstoffe, die auf die kolorektale Karzinogenese oder metastatische Progression abzielen.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Aufklärung von Signalwegen und die funktionelle Validierung von Zielstrukturen in einem klinisch relevanten anatomischen Kontext.
- Bereitstellung für die Substanzscreening: Ermöglicht standardisierte Tumorauslösung und -überwachung und damit konsistente Bewertung von Wirkstoffen über verschiedene Studien hinweg.
- Analytik: Die koloskopische Überwachung liefert quantitative, reproduzierbare Messgrößen für das Tumorlastvolumen und die Kinetik des Tumorfortschritts.
- Translationale Forschung: Histopathologische und metastatische Merkmale entsprechen denen des humanen kolorektalen Karzinoms und unterstützen präklinische Studien mit biomarkerbasierter Ausrichtung.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Das chirurgische und Überwachungsprotokoll ist in Laboren mit grundlegenden Kenntnissen der Nagetierchirurgie reproduzierbar und ermöglicht die Validierung an mehreren Standorten.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Verringert mechanistische Unschärfen, indem er ein genetisch definiertes, immunkompetentes Modell für sporadischen kolorektalen Krebs bereitstellt.
- Operativer Wert: Standardisierte chirurgische Technik und koloskopische Überwachung gewährleisten Reproduzierbarkeit und reduzieren die Variabilität zwischen den Tieren.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch durch die Möglichkeit einer frühen Beurteilung der therapeutischen Wirksamkeit und Toxizität in einem klinisch vorhersagenden System.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung von Kandidaten basierend auf Tumormorphologie, metastatischem Potenzial und Therapieansprechen.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Überlebenschirurgie an Nagetieren und aseptischer Technik, um eine Kolonperforation und Sepsis zu vermeiden.
- Benötigt Biosicherheitsstufe-2-(BSL-2-)Einrichtungen für den Umgang mit adenoviralen Vektoren.
- Hängt vom Zugang zu hochauflösenden Koloskopiegeräten für die longitudinale Tumormonitoring ab.
- Erfordert konditional mutierte Mauskolonien mit geeigneten cre-loxP-Genotypen für die gezielte Rekombination.
- Auf die Zielregion des distalen Kolons beschränkt; nicht geeignet für pankolonische oder proximale Tumorstudien, ohne dass die Methode angepasst wird.
