Ein Hydroponisches Co-Kultivierungssystem zur gleichzeitigen und systematischen Analyse von Pflanzen- / Mikroben-Molecular-Wechselwirkungen und Signalgebung

Das übergeordnete Ziel dieses Systems ist es, die wechselseitige Signalinteraktion und -reaktion zwischen Pflanzen und Mikropartnern oder die Reaktionen von Pflanzen auf Chemikalien oder abiotische Faktoren in einem einfachen Versuchsaufbau zu untersuchen, der die natürliche Umgebung genau nachahmt. Dieses Video zeigt die Co-Kultivierung von Pflanzen mit dem Bakterium Agrobacterium tumefaciens. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen zu den mikrobiellen Interaktionen von Pflanzen, der mikrobiellen oder pflanzlichen Stressreaktion und zur molekularen Signalübertragung zu beantworten, einschließlich komplexer Signalwege bereits in einem Anfangsstadium der mikrobiellen Interaktionen einer Pflanze.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie hilft, die Art der Signalübertragung und Reaktion der mikrobiellen Interaktionen einer Pflanze zu verstehen, und zwar in einem einfachen Aufbau, der die Nachahmung der natürlichen Umgebung beinhaltet. Obwohl diese Methode verwendet werden kann, um Einblicke in die Interaktionen von Pflanzen mit einer einzelnen mikrobiellen Art zu erhalten, kann sie auch verwendet werden, um pflanzliche Interaktionen mit mehreren mikrobiellen Arten oder mit abiotischen Faktoren zu untersuchen. Wir hatten die Idee zu dieser Methode, als wir nach der Homöostase der Zellsignale bei Interaktionen mit Pflanzenmikroben suchten, die natürliche Situationen genau nachahmen.

Um das Experiment zu beginnen, muss das Saatgut sterilisiert werden. Kombinieren Sie für Arabidopsis thaliana etwa 200 Samen mit 500 Mikrolitern deionisiertem Wasser in einem Mikrozentrifugenröhrchen und wirbeln Sie das Röhrchen mit hoher Geschwindigkeit durch. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 9000 x g für 30 Sekunden in einer Tisch-Mikrozentrifuge.

Entfernen Sie mit einer Pipette den Wasserüberstand. Fügen Sie dann 300 Mikroliter 2%igen Natriumhypochlorit zu den Samen hinzu und wirbeln Sie sie ein. Lassen Sie die Mischung bei Raumtemperatur absetzen.

Nach einer Minute zentrifugieren Sie die Samen. Entfernen Sie mit der Pipette die Natriumhypochloritlösung. Gib dann 500 Mikroliter steriles, deionisiertes Wasser zu den Samen und wirbele die Mischung ein.

Entfernen Sie nach dem Zentrifugieren des Röhrchens das Wasser. Füge 500 Mikroliter 70%iges Ethanol zu den Samen hinzu und wirbele die Mischung ein. Nachdem Sie die Samen eine Minute lang ruhen gelassen haben, zentrifugieren Sie das Röhrchen.

Entfernen Sie das 70%ige Ethanol mit einer Pipette. Waschen Sie die Samen fünfmal mit 500 Mikrolitern sterilem, entionisiertem Wasser. Anschließend werden die sterilisierten Samen in 500 Mikrolitern sterilem, ultrareinem Wasser erneut suspendiert.

Gießen Sie 25 Milliliter halbstarkes Murashige und Skoog oder MS-Medium mit 04%Phyto-Agar in jede sterile, tiefe Petrischale. Schneiden Sie für jede Petrischale ein 90 Millimeter x 90 Millimeter großes Quadrat aus Edelstahlnetz aus. Biegen Sie die Ecken jedes quadratischen Netzes gerade so weit, dass das Netz in die Petriplatte passt.

Biegen Sie die Ecken in einem 90-Grad-Winkel zum Volumen des Netzes, damit das Netz an den Ecken abgestützt werden kann und unten genügend Platz für die Wurzelentwicklung bleibt. Legen Sie die ausgeschnittenen Maschenquadrate in einen Becher und decken Sie sie mit Alufolie ab. Sterilisieren Sie die Maschenquadrate durch Autoklavieren in einem 30-minütigen Trockenzyklus.

Sobald das Medium in den Petrischalen erstarrt ist und das Netz steril ist, legen Sie jedes Netzquadrat mit den gebogenen Ecken nach unten auf das feste Medium. Schieben Sie das Netz so, dass die Ecken das Medium durchdringen und die Masse des Netzes die Oberseite des Mediums berührt. Verwenden Sie anschließend eine sterile 200-Mikroliter-Pipette, um die einzelnen oberflächensterilisierten A Thaliana-Samen herauszuziehen, und übertragen Sie jeden Samen vorsichtig auf das Netz.

Platzieren Sie die Samen so, dass sie je nach Pflanzenart und experimentellen Anforderungen angeordnet sind. Verschließen Sie die Petrischalen mit Deckeln und legen Sie poröses chirurgisches Klebeband um die Ränder der Platten. Wickeln Sie die Samen in Alufolie ein.

Stratifizieren Sie die Samen, indem Sie die gesamte Petrischale platzieren. Nach zwei Tagen kultivieren Sie die Samen in der Petrischale bei 22 bis 24 Grad Celsius mit einer 16-stündigen Fotoperiode für 10 bis 14 Tage. Gießen Sie in einer sterilisierten Strömungshaube 18 Milliliter autoklaviertes flüssiges MS-Medium in sterile zylindrische Glastanks mit sterilen Deckeln.

Als nächstes überträgst Du jedes Maschenquadrat mit 10 bis 14 Tage alten Sämlingen vorsichtig mit einer sterilen Pinzette aus der Petrischale mit halbfestem Medium in einen hydroponischen zylindrischen Tank. Bei den hier gezeigten Sämlingen handelt es sich um Luzerne. Verschließen Sie die Deckel mit porösem chirurgischem Klebeband auf den Tanks.

Kultivieren Sie die Sämlinge dann bei 22 bis 24 Grad Celsius mit einer 16-stündigen Fotoperiode und Schütteln bei 50 U/min. Untersuchen Sie vor der Inokulation den Tank mit den Setzlingen sorgfältig auf mögliche Verunreinigungen. Das Medium in den unverschmutzten Tanks sollte klar und transparent sein.

Wenn die Tanks durch Verunreinigungen trüb sind, entsorgen Sie sie und nummerieren Sie die restlichen Tanks. Nehmen Sie eine Probe von 20 Mikrolitern hydroponischem Medium aus jedem nummerierten Tank und verteilen Sie es auf eine Petrischale mit Luria-Brühe oder LB-Agar. Inkubieren Sie das Gericht 28 Stunden lang bei 28 Grad Celsius.

Impfen Sie sofort jeden nummerierten Hydrokulturtank mit 50 Mikrolitern der Agrobacterium tumefacians-Suspension in jeden nummerierten Hydrokulturtank. Kultivieren Sie die Sämlinge und das Bakterium A tumefacians bei 22 bis 24 Grad Celsius mit einer 16-stündigen Fotoperiode und Schütteln bei 50 U/min. Untersuchen Sie die gefleckte LB-Platte nach 12 und 28 Stunden Inkubation, um die Sterilität des hydroponischen Wachstumsmediums zu überprüfen.

Im Falle einer Kontamination ist der entsprechende nummerierte Tank, der mit Bakterien beimpft wurde, nicht für weitere nachgelagerte Assays zu verwenden. Trennen Sie als Nächstes die Wurzeln von der Bakteriensuspension, indem Sie die Netzplatte anheben. Wenn Sie Wurzeln für nachfolgende Analysen verwenden, schneiden Sie die Wurzeln ab, spülen Sie sie schnell in doppelt destilliertem Wasser ab und trocknen Sie sie auf sterilisiertem Filterpapier.

Wenn Sie Blätter oder anderes Taschentuch verwenden, schneiden Sie das Taschentuch ab. Für die Analyse des Pflanzentranskripts sollten die Wurzeln oder Triebe sofort in flüssigem Stickstoff abgelagert werden. Für die bakterielle Transkriptanalyse werden 1,5 Milliliter der Kultur aus dem Co-Kultivierungstank überführt und die Zellen durch Zentrifugation pelletiert.

Trennen Sie nach einer entsprechenden Co-Kultivierung mit einer sterilen Schere einzelne Nebenwurzeln, die Seitenäste der Hauptwurzel. Spülen Sie anschließend die Wurzeln in doppelt destilliertem Wasser ab, um lose gebundenes Material zu entfernen. Tauchen Sie jede Wurzel in 30 Mikroliter Wasser auf einem Objektträger und decken Sie sie mit einem Glasdeckglas ab.

Versiegeln Sie die Ränder des Deckglases mit Nagellack, um die Wurzeln vor Austrocknung zu schützen. Visualisieren Sie dann die Anheftung von A-Tumefazianen an A-Thaliana-Wurzeln durch Fluoreszenzmikroskopie. Trennen Sie die Pflanzen nach einer entsprechenden Co-Kultivierung vom hydroponischen Medium.

Sterilisieren Sie die 18 Milliliter Hydrokulturmedium, indem Sie es durch einen 0,2-Mikron-Porenfilter in konische 50-Milliliter-Röhrchen leiten. Frieren Sie die Proben über Nacht bei 80 Grad Celsius ein. Lösen Sie am nächsten Tag die Kappen der konischen 50-Milliliter-Röhrchen und legen Sie sie für 36 Stunden in eine Gefriertrocknungsmaschine.

Fahren Sie abschließend mit der Lagerung oder Verarbeitung der Proben für die HPLC-Analyse und den Nachweis von Verbindungen fort. Ohne künstlich zugeführte Nährstoffe wuchs A tumefacians c58 im Co-Kultivierungssystem. Im Gegensatz dazu wurde in der Kontrollkultur ohne A thaliana im Wesentlichen kein Bakterienwachstum beobachtet.

Die hydroponischen Co-Kultivierungssysteme können verwendet werden, um die Anheftung von Bakterien an die Wurzelstruktur zu untersuchen, wie in dieser mikroskopischen Visualisierung zu sehen ist, in der PCherry-Rotfluoreszenz-markierte Bakterien mit einer typischen steinartigen oder filamentartigen Form in der Wurzelstruktur der Pflanze lokalisiert wurden. Genexpressionsprofile sowohl von Pflanzenposten als auch von interagierenden Mikroben können über QRTPCR ermittelt werden. Nach acht Stunden Co-Kultivierung zeigten acht Tumefazian-Zellen eine Regulation der Expression von Virulenzgenen.

Gleichzeitig zeigten die Wurzeln von A thaliana eine differentielle Genexpression als Reaktion auf die Co-Kultivierung. Nach 72 Stunden Co-Kultivierung waren 35 Verbindungen im Sekretom der inokulierten Pflanzen im Vergleich zur Kontrolle verstärkt und 76 Verbindungen verringert. Diese Technik ebnet Forschern den Weg, Pflanzen-Mikroben-Interaktionen zu untersuchen und die wechselseitigen Reaktionen zwischen Pflanze und Mikrobe oder Mikroben-Biom-Partnern oder Pflanzenreaktionen auf abiotische Faktoren in einer einfachen Einrichtung zu untersuchen, die die natürliche Umgebung genau nachahmt.

Nachdem Sie dies mit Ihnen beobachtet haben, hoffen wir, dass Sie in der Lage sind, ein mikrobielles Co-Kultivierungssystem für Pflanzen in Hydrokulturen einzurichten, um molekulare Pflanzen, mikrobielle Interaktionen und die Signalantworten in einer natürlicheren und handhabbareren Umgebung zu untersuchen.