Ein Hydroponisches Co-Kultivierungssystem zur gleichzeitigen und systematischen Analyse von Pflanzen- / Mikroben-Molecular-Wechselwirkungen und Signalgebung

Das übergeordnete Ziel dieses Systems besteht darin, die wechselseitigen Signalübertragungen und Reaktionen zwischen Pflanzen und mikrobiellen Partnern oder die Reaktionen von Pflanzen auf Chemikalien bzw. abiotische Faktoren in einem einfachen experimentellen Aufbau zu untersuchen, der der natürlichen Umgebung nahekommt. In diesem Video wird die Co-Kultivierung von Pflanzen mit dem Bakterium Agrobacterium tumefaciens gezeigt. Diese Methode kann dabei helfen, zentrale Fragen zu Pflanzen-Mikroben-Interaktionen, zur Stressreaktion von Mikroben oder Pflanzen sowie zur molekularen Signalübertragung zu beantworten, einschließlich komplexer Signalkaskaden bereits in einem frühen Stadium der pflanzlichen Interaktion mit Mikroben.

Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie hilft, die Natur der Signalübertragung und Reaktion bei mikrobiellen Wechselwirkungen von Pflanzen in einem einfachen Aufbau zu verstehen, der eine Nachbildung der natürlichen Umgebung einschließt. Obwohl diese Methode verwendet werden kann, um Einblicke in die Wechselwirkungen der Pflanze mit einer einzelnen mikrobiellen Art zu gewinnen, eignet sie sich auch zur Untersuchung der Wechselwirkungen der Pflanze mit mehreren mikrobiellen Arten oder mit abiotischen Faktoren. Die Idee zu dieser Methode entstand, während wir nach der Homöostase der Zellkommunikation bei Pflanzen-Mikroben-Wechselwirkungen suchten, die natürlichen Situationen eng nachempfunden sind.

Um das Experiment zu beginnen, müssen die Samen sterilisiert werden. Für Arabidopsis thaliana etwa 200 Samen mit 500 µL entionisiertem Wasser in einem Mikrozentrifugenröhrchen vermischen und das Röhrchen kurz bei hoher Geschwindigkeit verwirbeln. Anschließend das Röhrchen 30 Sekunden lang in einer Tischmikrozentrifuge bei 9000 × g zentrifugieren.

Entfernen Sie mit einer Pipette den wässrigen Überstand. Geben Sie anschließend 300 µL 2 % Natriumhypochlorit zu den Samen hinzu und wirbeln Sie die Mischung mit einem Vortex. Lassen Sie die Mischung bei Raumtemperatur absetzen.

Nach einer Minute die Samen zentrifugieren. Mit der Pipette die Natriumhypochlorit-Lösung entfernen. Anschließend 500 µL sterilem, deionisiertem Wasser zu den Samen hinzufügen und das Gemisch vortexen.

Nach dem Zentrifugieren des Reaktionsgefäßes das Wasser entfernen. 500 Mikroliter 70 %igen Ethanol zu den Samen hinzufügen und die Mischung vortexen. Nach einer Minute, in der die Samen absitzen können, das Reaktionsgefäß erneut zentrifugieren.

Entfernen Sie das 70 % Ethanol mit einer Pipette. Waschen Sie die Samen fünfmal mit jeweils 500 Mikrolitern steriler, deionisierter Wasser. Anschließend resuspendieren Sie die sterilisierten Samen in 500 Mikrolitern sterilem, ultrareinem Wasser.

Geben Sie 25 Milliliter halbstarkes Murashige-und-Skoog-Medium oder MS-Medium mit 0,4 % Phytoagar in jede sterile, tiefe Petrischale. Schneiden Sie für jede Petrischale ein 90 Millimeter mal 90 Millimeter großes Quadrat aus Edelstahlgewebe aus. Biegen Sie die Ecken jedes Maschendrahtrahmens gerade so weit nach oben, dass das Gewebe in die Petrischale passt.

Biegen Sie die Ecken im 90-Grad-Winkel zur Hauptfläche des Netzes, damit die Ecken das Netz abstützen können und darunter ausreichend Platz für die Wurzelentwicklung bleibt. Legen Sie die ausgeschnittenen Netzquadrate in ein Becherglas und bedecken Sie sie mit Aluminiumfolie. Sterilisieren Sie die Netzquadrate im Autoklaven mithilfe eines 30-minütigen Trockenzyklus.

Nachdem das Medium in den Petrischalen erstarrt ist und das Netz steril ist, stellen Sie jedes Netzquadrat mit den nach unten gebogenen Ecken auf das feste Medium. Drücken Sie das Netz so ein, dass die Ecken in das Medium eindringen und der größte Teil des Netzes die Oberfläche des Mediums berührt. Verwenden Sie anschließend eine sterile 200-Mikroliter-Pipette, um die einzeln oberflächensterilisierten A thaliana-Samen aufzuziehen und jeden Samen vorsichtig auf das Netz zu übertragen.

Platzieren Sie die Samen so, dass sie je nach Pflanzenart und den Anforderungen des Experiments beabstandet sind. Verschließen Sie die Petrischalen mit Deckeln und legen Sie poröses chirurgisches Klebeband um die Ränder der Schalen. Wickeln Sie die Samen in Aluminiumfolie ein.

Stratifizieren Sie die Samen, indem Sie die gesamte Petrischale verwenden. Nach zwei Tagen kultivieren Sie die Samen in der Petrischale bei 22 bis 24 Grad Celsius mit einer 16-stündigen Beleuchtungsphase für 10 bis 14 Tage. In einer sterilisierten Flusshaube geben Sie 18 Milliliter autoklaviertes flüssiges MS-Medium in sterile zylindrische Glasgefäße mit sterilen Deckeln.

Verwenden Sie anschließend sterile Pinzette, um jedes Maschenquadrat mit 10 bis 14 Tage alten Sämlingen vorsichtig von der Petrischale mit halbfestem Medium in einen hydroponischen zylindrischen Tank zu überführen. Die hier gezeigten Sämlinge sind Luzerne. Verschließen Sie die Deckel der Tanks mit porösem chirurgischem Klebeband.

Anschließend die Keimlinge bei 22 bis 24 Grad Celsius mit einer 16-stündigen Beleuchtungsphase und Schütteln bei 50 U/min kultivieren. Vor der Inokulation den Behälter mit den Keimlingen sorgfältig auf mögliche Kontaminationen untersuchen. Das Medium in den unkontaminierten Behältern sollte klar und durchsichtig sein.

Wenn die Tanks trüb durch Kontamination sind, entsorgen Sie diese und nummerieren Sie die restlichen Tanks. Entnehmen Sie 20 Mikroliter Hydrokulturlösung aus jedem nummerierten Tank und geben Sie diese auf eine Petrischale mit Luria-Brühe oder LB-Agar. Inkubieren Sie die Schale bei 28 Grad Celsius für 28 Stunden.

Inokulieren Sie unverzüglich jeden nummerierten Hydrokulturtank mit 50 Mikrolitern der Agrobacterium tumefaciens-Suspension in jeden nummerierten Hydrokulturtank. Kultivieren Sie die Keimlinge und das Bakterium A tumefaciens bei 22 bis 24 Grad Celsius mit einer 16-stündigen Lichtperiode und Schütteln bei 50 U/min mit. Untersuchen Sie die beimpfte LB-Platte nach 12 und 28 Stunden der Inkubation, um die Sterilität des hydroponischen Nährmediums zu überprüfen.

Falls eine Kontamination vorliegt, verwenden Sie den entsprechenden nummerierten Tank, der mit Bakterien beimpft wurde, nicht für nachfolgende Analysen. Danach trennen Sie die Wurzeln von der bakteriellen Suspension, indem Sie die Netzplatte anheben. Wenn die Wurzeln für nachfolgende Analysen verwendet werden sollen, schneiden Sie sie ab, spülen Sie sie schnell mit doppelt destilliertem Wasser ab und trocknen Sie sie auf sterilisiertem Filterpapier.

Falls Blätter oder anderes Gewebe verwendet werden, schneiden Sie das Gewebe ab. Für die Transkriptanalyse von Pflanzen sollten die Wurzeln oder Triebe unverzüglich in flüssigen Stickstoff gegeben werden. Für die Transkriptanalyse von Bakterien überführen Sie 1,5 Milliliter der Kultur aus dem Co-Kultivierungsbehälter und pelletieren die Zellen durch Zentrifugation.

Nach einer geeigneten Co-Kultivierung verwenden Sie sterile Schere, um einzelne sekundäre Wurzeln, die Seitenäste der Hauptwurzel, zu trennen. Spülen Sie anschließend die Wurzeln mit doppelt destilliertem Wasser, um locker gebundenes Material zu entfernen. Tauchen Sie jede Wurzel in 30 Mikroliter Wasser auf einem Objektträger ein und bedecken Sie sie mit einem Glasdeckel.

Versiegeln Sie die Ränder der Deckglas mit Nagellack, um die Wurzeln vor Austrocknung zu schützen. Anschließend visualisieren Sie die Anheftung von A tumefaciens an A thaliana-Wurzeln mittels Fluoreszenzmikroskopie. Nach einer geeigneten Co-Kultivierungsphase trennen Sie die Pflanzen vom hydroponischen Medium.

Desinfizieren Sie 18 Milliliter hydroponisches Medium, indem Sie es durch einen 0,2-Mikron-Porenfilter in 50-Milliliter-Konischgefäße leiten. Gefrieren Sie die Proben über Nacht bei 80 Grad Celsius. Lösen Sie am folgenden Tag die Verschlüsse der 50-Milliliter-Konischgefäße und stellen Sie sie für 36 Stunden in eine Gefriertrocknungsanlage.

Schließlich fahren Sie mit der Lagerung oder Verarbeitung der Proben für die HPLC-Analyse und die Detektion der Verbindungen fort. Ohne künstlich zugeführte Nährstoffe wuchs A tumefaciens c58 im Ko-Kultivierungssystem. Im Gegensatz dazu wurde im Kontrollkulturansatz ohne A thaliana praktisch kein bakterielles Wachstum beobachtet.

Die hydroponischen Ko-Kultivierungssysteme können verwendet werden, um die Anheftung von Bakterien an die Wurzelstruktur zu untersuchen, wie in dieser mikroskopischen Visualisierung zu sehen ist, bei der mit PCherry-Rot-Farbstoff markierte Bakterien in charakteristischer korkenzieherartiger oder fadenförmiger Form an der Pflanzenwurzelstruktur lokalisiert waren. Genexpressionsprofile sowohl der Pflanzenteile als auch der wechselwirkenden Mikroben können mittels qRT-PCR bestimmt werden. Nach acht Stunden der Ko-Kultivierung zeigten acht Tumefaciens-Zellen eine Hochregulation der Expression von Virulenzgenen.

Gleichzeitig zeigten die Wurzeln von A. thaliana eine differenzielle Genexpression als Reaktion auf die Kokultivierung. Nach 72 Stunden Kokultivierung waren 35 Verbindungen im Sekretom der inoculierten Pflanzen erhöht und 76 Verbindungen verringert im Vergleich zur Kontrolle. Diese Technik eröffnet Forschern die Möglichkeit, Pflanze-Mikrobe-Interaktionen zu untersuchen und die gegenseitigen Reaktionen zwischen Pflanze und Mikrobe oder Mikrobiom-Partnern sowie die Reaktionen der Pflanze auf abiotische Faktoren in einem einfachen Aufbau zu erforschen, der eng an die natürliche Umgebung angelehnt ist.

Nachdem Sie sich dies gemeinsam angesehen haben, hoffen wir, dass Sie nun in der Lage sind, ein pflanzlich-mikrobielles Kokultivierungssystem in der Hydrokultur einzurichten, um molekulare Pflanzen, mikrobielle Wechselwirkungen und Signalantworten in einer natürlicheren und besser kontrollierbaren Umgebung zu untersuchen.