Bestimmung der Zelloberflächenexpression und der endozytischen Rate von Proteinen in primären Astrozytenkulturen unter Verwendung von Biotinylierung

In diesem Video werden zwei Methoden vorgestellt, die Zelloberflächen-Biotinylierung und die Puls-Chase-Biotinylierung. In der folgenden Demonstration werden wir Astrozyten verwenden. Dies sind die am häufigsten vorkommenden Gliazelltypen im Gehirn, und sie exprimieren zufällig unser Protein von Interesse, nämlich Aquaporin-4.

Die Methoden, die wir in dieser Arbeit verwenden, könnten auf viele verschiedene Zelltypen angewendet werden, und diese könnten entweder Zellen in Suspension oder adhärente Zellen umfassen. Diese Techniken können verwendet werden, um die Expression und Internalisierung der Zelloberfläche praktisch jedes Transmembranproteins zu untersuchen, solange es eine extrazelluläre Domäne besitzt, die für Biotin zugänglich ist. Das übergeordnete Ziel dieses Zelloberflächen-Biotinylierungsassays ist es, die Auswirkungen von Laminin auf die Expression des wasserdurchlässigen Kanals Aquaporin-4 an der Plasmamembran von Astrozyten zu bestimmen.

Um mit diesem Verfahren zu beginnen, nehmen Sie die Astrozytenkulturen aus dem Inkubator und entsorgen Sie das Medium durch Aspiration. Waschen Sie die Zellen dreimal mit vier Millilitern gekühltem CM-PBS und legen Sie das Geschirr auf zerstoßenes Eis. Entfernen Sie das CM-PBS durch Aspiration und pipettieren Sie dann zwei Milliliter Biotinpuffer in jede Vertiefung.

Kippen Sie die Schalen einige Male vorsichtig hin und her, um eine vollständige Abdeckung zu gewährleisten, bevor Sie die Kulturen 30 Minuten lang auf Eis legen. Entfernen Sie anschließend den Biotin-Puffer, ersetzen Sie ihn durch vier Milliliter Quenching-Puffer und halten Sie die Kulturen 10 Minuten lang auf Eis. Anschließend aspirieren und durch die gleiche Menge des Quenching-Puffers ersetzen, bevor die Kulturen 10 Minuten lang auf Eis gelassen werden.

Entsorgen Sie dann den Quenching-Puffer und waschen Sie die Zellen dreimal mit vier Millilitern gekühltem CM-PBS. Anschließend werden die Zellen in einen Milliliter gekühltes CM-PBS abgeschabt und die Suspension in ein Mikrozentrifugenröhrchen überführt. Anschließend werden die Zellen durch Zentrifugation bei 100 g drei Minuten lang in einer gekühlten Mikrozentrifuge auf vier Grad Celsius pelletiert.

Danach verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren die Zellen in 500 Mikrolitern Lysepuffer. Lassen Sie die Proben dann 30 Minuten lang auf Eis und wirbeln Sie sie alle fünf Minuten vortexen. Zentrifugieren Sie anschließend das Lysat bei 14.000 g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius, um alle Reinigungsmittel und löslichen Materialien zu pelletieren.

Übertragen Sie dann den Überstand in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen. Sparen Sie 50 Mikroliter des Lysats und fügen Sie 25 Mikroliter mit drei X Ladepuffer hinzu. Anschließend denaturieren Sie es, indem Sie es in einem trockenen Bad auf 95 Grad Celsius erhitzen.

Dies ist die Eingangsfraktion, die sowohl biotinylierte Zelloberflächenproteine als auch nicht-biotinylierte zytosolische Proteine enthält. Übertragen Sie mit einer abgeschnittenen Pipettenspitze 75 Mikroliter Streptavidin-Agarose-Kügelchen in das Lysat und inkubieren Sie es drei Stunden lang bei vier Grad Celsius auf einem Shaker. Danach pelletieren Sie die Streptavidin-Agarose-Kügelchen durch Zentrifugation bei 1.500 g für 30 Sekunden bei vier Grad Celsius.

Sparen Sie 50 Mikroliter des Überstands und fügen Sie 25 Mikroliter drei X Ladepuffer hinzu. Anschließend denaturieren Sie es bei 95 Grad Celsius in einem Wasserbad oder einem Heizblock. Diese stellt die intrazelluläre Fraktion dar und besteht hauptsächlich aus nicht-biotinylierten zytosolischen Proteinen.

Anschließend die pelletierten Kügelchen in einem Milliliter Waschpuffer resuspendieren und drei Minuten lang bei vier Grad Celsius wiegen. Pelletieren Sie die Kügelchen und entsorgen Sie den Überstand. Wiederholen Sie diesen Vorgang noch viermal, um die unspezifische Bindung von nicht-biotinylierten zytosolischen Proteinen zu minimieren.

Geben Sie 50 Mikroliter Ladepuffer, verdünnt auf ein X mit Lysepuffer. Geben Sie Biotin und Streptavidin aus den Kügelchen ab, indem Sie sie bei 95 Grad Celsius denaturieren. Diese Fraktion sollte nur biotinylierte Proteine der Zelloberfläche enthalten.

Anschließend wird die Eingangs-, Zelloberflächen- und intrazelluläre Fraktion mittels SDS-PAGE getrennt und mittels Western Blotting analysiert. Das übergeordnete Ziel des Pulse-Chase-Biotinylierungsexperiments ist es, die ungefähre Internalisierungsrate von Aquaporin-4 in Astrozyten zu bestimmen. Nehmen Sie zunächst die Astrozytenkulturen aus dem Inkubator und aspirieren Sie das Medium.

Waschen Sie dann die Zellen dreimal mit vier Millilitern gekühltem CM-PBS und legen Sie das Geschirr auf zerstoßenes Eis. Aspirieren Sie das CM-PBS und pipettieren Sie dann drei Milliliter Biotinpuffer in jede Schale. Kippen Sie die Schalen einige Male hin und her, um sicherzustellen, dass der Puffer gut verteilt ist, und lassen Sie sie 30 Minuten lang auf Eis.

Aspirieren Sie dann den Biotin-Puffer und ersetzen Sie ihn durch fünf Milliliter warmes Medium. Eine Kulturschale wird 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius und eine zweite Schale 30 Minuten lang bei der gleichen Temperatur inkubiert. Lassen Sie ein anderes Gericht mit vier Grad Celsius als Null-Minuten-Probe stehen.

Am Ende der Inkubationszeit wird das Medium verworfen und die Zellen dreimal mit vier Millilitern gekühltem CM-PBS gewaschen. Anschließend aspirieren Sie das CM-PBS, pipettieren dann sechs Milliliter Reduktionspuffer über die Zellen und lassen die Probe 15 Minuten lang auf Eis. Ersetzen Sie dann das Medium durch sechs Milliliter frischen Reduzierpuffer und legen Sie die Probe für weitere 15 Minuten auf Eis.

Dieser Schritt ist kritisch, da das im Reduktionspuffer enthaltene Glutathion die an der Zelloberfläche verbleibende Biotin-Moase spaltet. Dadurch wird sichergestellt, dass nur internalisierte Proteine mit Biotin markiert werden. Entfernen Sie anschließend die Reduktionslösung und ersetzen Sie sie durch sechs Milliliter Quenchpuffer.

Lassen Sie die Probe weitere 15 Minuten auf Eis und wiederholen Sie den Abschreckschritt noch einmal. Entsorgen Sie dann den Quenching-Puffer und waschen Sie die Zellen dreimal mit vier Millilitern gekühltem PBS. Aspirieren Sie das CM-PBS und kratzen Sie dann die Zellen mit einem Zellheber in einen Milliliter gekühltes PBS und überführen Sie die Suspension in ein Mikrozentrifugenröhrchen.

Die Zellen werden durch Zentrifugation bei 100 g drei Minuten lang pelletiert. Nach drei Minuten wird der Überstand verworfen und die Zellen in 500 Mikrolitern Lysepuffer resuspendiert. Lassen Sie die Probe 30 Minuten lang auf Eis und wirbeln Sie sie alle fünf Minuten ein.

Zentrifugieren Sie das Lysat bei 14.000 g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius, um das Reinigungsmittel und die löslichen Materialien zu pelletieren. Übertragen Sie dann den Überstand in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen. Sparen Sie 50 Mikroliter dieses Lysats und fügen Sie einen Ladepuffer hinzu.

Anschließend denaturieren Sie die Zellen bei 95 Grad Celsius in einem trockenen Bad. Dies ist die Eingangsfraktion, die sowohl biotinylierte endozytierte Proteine als auch nicht-biotinylierte Proteine enthält. Geben Sie mit einer abgeschnittenen Pipettenspitze 150 Mikroliter der Streptavidin-Agarose-Aufschlämmung in das Lysat und inkubieren Sie es drei Stunden lang bei vier Grad Celsius auf einem Shaker.

Nach drei Stunden werden die Streptavidin-Agarose-Kügelchen durch Zentrifugation bei 1.500 g für 30 Sekunden bei vier Grad Celsius pelletiert. Suspendieren Sie die Kügelchen in einem Milliliter Waschpuffer und wiegen Sie sie drei Minuten lang bei vier Grad Celsius. Kügeln Sie die Kügelchen und entsorgen Sie den Überstand.

Wiederholen Sie diesen Vorgang noch viermal, um die unspezifische Bindung von nicht-biotinylierten zytosolischen Proteinen zu minimieren. Dann werden die Kügelchen durch Zentrifugation bei 1.500 g für 30 Sekunden bei vier Grad Celsius pelletiert. Verwerfen Sie den darüber liegenden Waschpuffer und fügen Sie 50 Mikroliter eines x Ladepuffers hinzu.

Setzen Sie Biotin und Streptavidin aus den Kügelchen frei, indem Sie sie bei 95 Grad Celsius denaturieren. Diese Fraktion sollte nur internalisierte Zelloberflächenproteine enthalten. Trennen Sie dann die Eingabe, die Zelloberfläche und die ungebundenen Fraktionen mit SDS-PAGE und analysieren Sie sie durch Western Blotting.

Hier sind die Zelloberflächen-, intrazellulären und Gesamtfraktionen der unbehandelten Astrozyten sowie die mit 24 nanomolaren Lamininen behandelten Astrozyten, die auf Aquaporin-4 und Beta-Dystroglykan untersucht wurden. Dieses Histogramm veranschaulicht die Unterschiede in den Zelloberflächenspiegeln von Aquaporin-4 in den unbehandelten und mit Laminin behandelten Astrozyten, die gegenüber Beta-Dytroglykan normalisiert sind. In dieser Abbildung wurden die internalisierten Proteinfraktionen, die nach null, 15 und 30 Minuten gesammelt wurden, auf Aquaporin-4 untersucht.

Und dieses Histogramm fasst die Internalisierung von Aquaporin-4 für vier unabhängige Experimente zusammen, normiert mit Werten für den Null-Minuten-Zeitpunkt. Das Sternchen zeigt einen statistisch signifikanten Anstieg der Menge an Aquaporin-4 an, die zwischen 15 und 30 Minuten endozytiert wird. Wenn Glutathion verwendet wird, um die Disulfidbindung im spaltbaren Biotin-Analogon aufzubrechen, wird der Beitrag von Aquaporin-4 zur biotinylierten Fraktion der Zelloberfläche stark reduziert.

Dies führt zu einem deutlichen Unterschied zwischen der Null-Minuten- und der 15-Minuten-Probe. Wenn der Schritt weggelassen wird, macht das Signal, das aus dem Zellenoberflächenpool stammt, die Änderung zwischen den beiden Zeitpunkten nicht nachweisbar. Nach diesem Verfahren könnten andere Methoden wie Immunfluoreszenz und TIRF-Mikroskopie angewendet werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, einschließlich des physischen Transports der Fracht.