Name: Bestimmung der Zelloberflächenexpression und der endozytischen Rate von Proteinen in primären Astrozytenkulturen unter Verwendung von Biotinylierung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 42 s
Description: Erfahren Sie biotinylierte Methoden zur Analyse der Zelloberflächenexpression und Endozytose von Proteinen in primären Astrozytenkulturen. Diese Techniken ermöglichen die Untersuchung von Aquaporin-4-Dynamiken.

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Dieses Projekt wurde vom kanadischen Institut für Gesundheitsforschung PG # 20R47867 unterstützt.

1. Bestimmung der relativen Zelloberflächen-Protein-Expression in Astrozyten durch Biotinylierung HINWEIS: Hier veranschaulichen wir die Anwendung dieser Biotinylierungstechnik auf die Untersuchung der Effekte des extrazellulären Matrixmoleküls Laminin auf die Zelloberflächenlokalisierung des wasserdurchlässigen Kanals aapaporin-4 (AQP4). Spezielle Materialien, die für diesen Assay erforderlich sind, umfassen Sulfo-NHS-LC-Biotin und Streptavidin-Agarose-Harz (siehe Tabelle der Materialien ). <ol><li> Unter Verwendung der in Noel et al. 12 , kultivieren kultikale Astrozyten etwa 2 Wochen vor dem Assay und wachsen sie in 75 cm 2 belüfteten Kulturkolben. Wenn Astrozyten 80 - 90% konfluent sind, lösen sie sie von der Kulturoberfläche mit 0,05% Trypsin, und dann passieren sie 1: 3. </li><li> Bei 48 h vor dem Assay, wenn die Zellen wieder 80 - 90% konfluent sind, passieren die Astrozyten 1: 3 (für die cHängen im Kulturformat) auf 60 mm Zellkulturschalen, so dass sie&gt; 70% konfluent am Tag des Experiments stattfinden. Stellen Sie sicher, dass die Zellen gleichmäßig zwischen den Speisen verteilt sind. </li><li> Bei 16 h vor dem Assay pipettieren Sie Laminin in das Kulturmedium auf eine Endkonzentration von 24 nM und inkubieren bei 37 ° C. </li><li> Unmittelbar vor dem Assay wird folgendes vorbereitet und dann auf Eis gelegt oder gekühlt: CM-PBS (100 mg / L MgCl 2 ∙ 6H 2 O und 100 mg / l CaCl 2 in 1X PBS, pH 7,4), Biotinpuffer (0,5 Mg / ml Sulfo-NHS-LC-Biotin in CM-PBS), Quenchpuffer (50 mM NH 4 Cl in CM-PBS), Lysepuffer (25 mM Tris, pH 7,4, 25 mM Glycin, 150 mM NaCl und 5 mM) EDTA, 1% Triton X-100, 1X Protease-Inhibitor-Cocktail), 3X-Beladungspuffer (150 mM Tris, pH 6,8, 6% SDS, 30% Glycerin, 300 mM DTT und 0,01% Bromphenolblau) und Waschpuffer (10 mM Tris (pH 7,4), 1,5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1X Protease-Inhibitor-Cocktail). </li><li> RemOve Speisen, die die Astrozytenkulturen aus dem Inkubator halten und das Medium verwerfen. </li><li> Waschen Sie die Zellen dreimal mit 4 ml gekühltem CM-PBS und legen Sie das Geschirr auf zerkleinertes Eis. </li><li> Pipettieren Sie 2 mL Biotin Puffer in jede Vertiefung, und sanft kippen Gerichte hin und her ein paar Mal, um eine vollständige Abdeckung zu gewährleisten. Verlassen auf Eis für 30 min. </li><li> Entfernen Sie den Biotin-Puffer mit einem Aspirator und ersetzen Sie ihn mit 4 mL Quenching-Puffer. Auf Eis für 10 min verlassen. </li><li> Aspirieren Sie den Quench-Puffer und ersetzen Sie mit einem gleichwertigen Volumen des gleichen. Wieder auf 10 Minuten auf Eis gehen. </li><li> Verwerfen Sie den Quenchpuffer und waschen Sie die Zellen dreimal mit 4 ml gekühltem CM-PBS. </li><li> Kratzen Sie Zellen in 1 ml gekühlte CM-PBS unter Verwendung eines Zelllifters und übertragen Sie die Suspension in das Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Pelletzellen durch Zentrifugation bei 100 xg für 3 min. Verwerfen Sie den Überstand und re-suspendieren Sie Zellen in 500 &amp; mgr; l Lysepuffer. </li><li> Lassen Sie die Proben auf Eis für 30 min, Vortexen alle 5 min, oder plSie bei einem umlaufenden Rotator bei 4 ° C aufnehmen. </li><li> Das Lysat bei 14.000 xg für 10 min bei 4 ° C zentrifugieren, um jegliches Detergens-unlösliche Material zu pelletieren. Übertragen Sie den Überstand in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen. <ol><li> Sparen Sie 50 μl dieses Lysats und fügen Sie Ladepuffer hinzu. Dann durch Erhitzen auf 95 ° C im Trockenbad denaturieren; Dies ist die &quot;Input&quot; -Fraktion, die sowohl biotinylierte Zelloberflächenproteine ​​als auch nicht-biotinylierte zytosolische Proteine ​​enthält. </li></ol></li><li> Erweitern Sie die Öffnung einer Pipettenspitze, indem Sie etwa 0,5 cm Material von seinem Ende mit einer scharfen Schere abschneiden. Unter Verwendung dieser Pipettenspitze werden 75 &amp; mgr; l Streptavidin-Agarose-Perlen (normalerweise bei 4 ° C gelagert) zum Lysat gegeben und bei 4 ° C für 3 h bei Schüttler / Wippe inkubiert. <ol><li> Da Streptavidin-Agarose häufig als eine Aufschlämmung verkauft wird, die 50% Perlen pro Volumen enthält, in einer antimikrobiellen Lösung suspendiert ist, trituriert die Aufschlämmung, um sicherzustellen, daß die KügelchenWerden gleichmäßig suspendiert und dann 150 μl der Suspension in jede Probe pipettiert. </li></ol></li><li> Pellet-Streptavidin-Agarose-Kügelchen durch Zentrifugation bei 1500 xg für 30 s bei 4 ° C. <ol><li> Sparen Sie 50 μl des Überstandes (fügen Sie den Ladungspuffer hinzu und denaturieren ihn bei 95 ° C in einem Wasserbad oder Heizblock); Dies stellt die &quot;intrazelluläre&quot; Fraktion dar und besteht hauptsächlich aus nicht-biotinylierten cytosolischen Proteinen. </li></ol></li><li> Die Pelletperlen in 1 ml Waschpuffer resuspendieren und 3 min bei 4 ° C schneiden. Pelletperlen (wie in Schritt 1.16) und den Überstand verwerfen. Wiederholen Sie diesen Vorgang 4x, um die unspezifische Bindung von nichtbiotinylierten zytosolischen Proteinen zu minimieren. </li><li> Die Perlen durch Zentrifugation (1500 xg für 30 s bei 4 ° C) pelletieren und den darüber liegenden Waschpuffer verwerfen. 50 μl 1X Ladepuffer (verdünnt mit Lysepuffer) zugeben. Freisetzung von Biotin und Streptavidin aus Perlen durch Denaturierung bei 95 ° C; Diese fraktion shoSollte nur biotinylierte Zelloberflächenproteine ​​enthalten (&quot;Zelloberflächen&quot; -Fraktion). <ol><li> Separate Input-, Zell-Oberfläche und intrazelluläre Fraktionen durch SDS-PAGE 13 , und analysieren durch Western Blotting 14 . HINWEIS: Während wir in unseren Experimenten ein 4 - 20% iges Fertigteilgelenk verwendet haben, sollte ein 12 - 14% Trenngel mit einer 4% Stapelschicht (jeweils 0,1% SDS) für die in dieser Studie interessanten Proteine ​​ausreichen. Es sollte auch ein Molekulargewichtsstandard des entsprechenden Größenbereichs verwendet werden. Beachten Sie, dass es manchmal ein beobachtbares Hochschalten in den scheinbaren Molekülmassen von biotinylierten Proteinen geben kann. </li></ol></li></ol> 2. Bestimmung der Internalisierungsrate von Zelloberflächenproteinen in Astrozyten durch Biotinylierung HINWEIS: Im Folgenden beschreiben wir ein typisches Puls-Chase-Biotinylierungsexperiment, das in diesem Fall verwendet wird, um die Endozytose von AQP4 in Astrozyten zu verfolgen. DiesMethode basiert auf der von Madrid et al. 15 Zu den spezialisierten Materialien gehören Sulfo-NHS-SS-Biotin, Streptavidin-Agarose-Harz, reduziertes Glutathion und Iodacetamid (siehe Tabelle der Materialien ). <ol><li> Bereiten Sie Kulturen von Mauskortikalen Astrozyten in 60-mm-Gerichten mit den Methoden vor, die im vorigen Abschnitt beschrieben wurden. Sicherstellen, dass Zellen am Tag des Assays etwa 70% konfluent sind und dass jede Schale eine äquivalente Anzahl von Zellen enthält. </li><li> Unmittelbar vor dem Assay, folgendes vorbereiten und auf Eis geben oder kühlen: CM-PBS (100 mg / l MgCl 2 ∙ 6H 2 O und 100 mg / l CaCl 2 in 1X PBS, pH 7,4), Biotinpuffer (0,5 Mg / ml Sulfo-NHS-SS-Biotin in CM-PBS), reduzierender Puffer (50 mM reduziertes Glutathion, 75 mM NaCl und 75 mM NaOH), Quenchpuffer (50 mM Iodacetamid, 1% BSA, in CM-PBS) Lysepuffer (25 mM Tris, pH 7,4, 25 mM Glycin, 150 mM NaCl und 5 mM EDTA, 1% Triton X-100, 1X-Protease-Inhibitor-Cocktail), 3facher Beladungspuffer (150 mM Tris, pH 6,8, 6% SDS, 30% Glycerin, 300 mM DTT und 0,01% Bromphenolblau) und Waschpuffer (10 mM Tris, pH 7,4, 1,5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1X Protease-Inhibitor-Cocktail). </li><li> Bereiten Sie frisches Zellkulturmedium vor (DMEM, ergänzt mit 10% Fetal Bbovine Serum (FBS), 1% Penicillin / Streptomycin und 1% L-Glutamin) und legen Sie es in ein 37 ° C Wasserbad. </li><li> Entfernen Sie Astrozytenkulturen aus dem Inkubator und saugt das Medium mit einem Aspirator an. </li><li> Waschen Sie die Zellen dreimal mit 4 ml gekühltem CM-PBS und legen Sie das Geschirr auf zerkleinertes Eis. </li><li> Pipettieren Sie 3 ml Biotin Puffer in jedes Gericht, neigen Sie Gerichte hin und her ein paar Mal, um sicherzustellen, dass Puffer ist gut verteilt, und lassen Sie diese auf Eis für 30 min. </li><li> Aspirieren Sie Biotinpuffer und ersetzen Sie ihn mit 5 mL warmem Medium. Inkubieren Sie eine Kulturschale bei 37 ° C für 15 min und eine zweite Schale bei der gleichen Temperatur für 30 min. Lassen Sie ein anderes Gericht bei 46, C als 0 min Probe. </li><li> Am Ende der Inkubationszeit, verwerfen Sie Medium und waschen Sie die Zellen dreimal mit 4 ml gekühltem CM-PBS. Pipette 6 ml reduzieren Puffer über Zellen, und verlassen auf Eis für 15 min. </li><li> Den reduzierenden Puffer entfernen und dann mit 6 mL frischem Reduktionspuffer ersetzen. 10 Minuten auf Eis geben. </li><li> Entfernen Sie die reduzierende Lösung und ersetzen Sie sie mit 6 mL Quenching Puffer. 15 Minuten auf Eis verlassen. </li><li> Wiederholen Sie den Löschschritt noch einmal. </li><li> Verwerfen Sie den Quenchpuffer und waschen Sie die Zellen dreimal mit 4 ml gekühltem PBS. </li><li> Die Zellen in 1 ml gekühlte PBS unter Verwendung eines Zelllifters kratzen und die Suspension in ein Mikrozentrifugenröhrchen überführen. </li><li> Pelletzellen durch Zentrifugation bei 100 xg für 3 min. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie Zellen in 500 μl Lysepuffer. </li><li> Lassen Sie diese auf Eis für 30 min und vortex alle 5 min. Alternativ legen Sie die Proben auf einen End-Over-End-Rotator bei 4 ° C für diese Dauer. </li><li> Zentrifuge die lySate bei 14.000 xg für 10 min bei 4 ° C, um die Detergenz-unlöslichen Materialien zu pelletieren, dann den Überstand in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen überführen. Sparen Sie 50 &amp; mgr; l dieses Lysats, fügen Sie Ladepuffer hinzu und denaturieren bei 95 ° C in einem Trockenbad; Dies ist die &quot;Input&quot; -Fraktion, die sowohl biotinylierte endozytose Proteine ​​als auch nichtbiotinylierte Proteine ​​enthält. </li><li> Unter Verwendung einer geschnittenen Pipettenspitze werden 150 &amp; mgr; l der Streptavidin-Agarose-Aufschlämmung dem Lysat zugesetzt und bei 4 ° C für 3 h bei Shaker / Rocker inkubiert. Weitere Einzelheiten zu diesem Schritt finden Sie unter 1.15. </li><li> Pellet-Streptavidin-Agarose-Kügelchen durch Zentrifugation bei 1.500 xg für 30 s bei 4 ° C. </li><li> Resspend Perlen in 1 ml Waschpuffer und Fels für 3 min bei 4 ° C. Pelletperlen (nach Schritt 2.18) und verwerfen den Überstand. Wiederholen Sie diesen Vorgang 4x, um die unspezifische Bindung von nichtbiotinylierten zytosolischen Proteinen zu minimieren. </li><li> Pelletperlen durch Zentrifugation bei 1500 xg für 30 s bei 4 ° C und entsorgenLiegenden Waschpuffer 50 μL 1X Ladepuffer (verdünnt mit Lysepuffer) zugeben. Freisetzung von Biotin und Streptavidin aus Perlen durch Denaturierung bei 95 ° C; Diese Fraktion sollte nur verinnerlichte Zelloberflächenproteine ​​enthalten (&quot;endozytierte&quot; Fraktion). </li><li> Separate Eingabe, Zelloberfläche und ungebundene Fraktionen durch SDS-PAGE 13 und analysieren durch Western Blotting 14 . HINWEIS: Während wir in unseren Experimenten ein 4 - 20% iges Fertigteilgelenk verwendet haben, sollte ein 12 - 14% Trenngel mit einer 4% Stapelschicht (jeweils 0,1% SDS) für die in dieser Studie interessanten Proteine ​​ausreichen. Es sollte auch ein Molekulargewichtsstandard des entsprechenden Größenbereichs verwendet werden. Beachten Sie, dass es manchmal ein beobachtbares Hochschalten in den scheinbaren Molekülmassen von biotinylierten Proteinen geben kann. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren erklären keinen Interessenkonflikt.

Änderungen: Da diese Verfahren für die Verwendung mit adhärenten Zellen entworfen wurden, haben wir die Verwendung von PBS mit 100 mg / l MgCl 2 ∙ 6H 2 O und angegeben 100 mg / l CaCl 2 (CM-PBS) für die Waschschritte und als Basis von bestimmten Puffern, um sicherzustellen, dass die Zellen an der Kulturoberfläche gebunden bleiben und dass Zell-Zell-Übergänge nicht unterbrochen werden. Jedoch können die Protokolle auch auf nichtadhärent...

Proteine ​​an der Zelloberfläche spielen eine Vielzahl von Rollen, die zentral für die Aufrechterhaltung der Zellfunktion sind. In zahlreichen Fällen ist ihre Aktivität von endozytischen Prozessen abhängig oder moduliert, die sie entweder vorübergehend in intrazellulären Stellen sequestrieren oder sie auf abgebrochene Wege 1 , 2 , 3 , 4 , 5 richten. Hier heben wir 2 Biotinylierungs-basierte Ansätze hervor, die es dem Anwender ermöglichen, die an der Plasmamembran ausgedrückten Proteine ​​spezifisch zu markieren und zu isolieren, und diejenigen, die neu verinnerlicht sind. Über diese Methoden kann die Zelloberflächenexpression und die endozytische Rate eines beliebigen Proteins von Interesse quantifiziert werden, so dass eine klarere Beurteilung seiner Regulation erreicht werden kann. Bestimmung der relativen Zelloberflächen-Proteinexpression durch Biotinylierung Biotin oder Vitamin B7, früher bekannt als Vitamin H 6 , ist ein kleines wasserlösliches Molekül, das zur chemischen Modifizierung von reaktiven Amin-, Sulfhydryl- und Carboxylgruppen biologischer Moleküle verwendet werden kann. Die gegenwärtige Ernte von Zelloberflächen-Biotinylierungsreagenzien besteht hauptsächlich aus membranimpermenden sulfonierten N-Hydroxysuccinimid (Sulfo-NHS) -estern von Biotin oder seinen Derivaten, die so konstruiert sind, dass sie mit den Aminen reagieren, die an den Seitenketten von Lysinresten von Proteinen, die in Die Zelloberfläche, wenn diese unter basischen Bedingungen deprotoniert werden, was dazu führt, dass letztere eine Amidbindung mit dem Biotinrest 7 bildet . So können modifizierte, Zelloberflächenproteine ​​dann über die Verwendung von Avidin, einem 66 - 69 kDa tetrameren Protein, das eine große Affinität für Biotin besitzt, isoliert werden, wobei die Bindung an diese mit einer Dissoziationskonstante von etwa 10 &amp; supmin; &amp; sup5; &amp; supmin; &amp; sup5; Stärkste nichtkovalente Wechselwirkungen bekannt 8 </suP&gt; , 9 Eine Reihe von alternativen Verfahren zur Quantifizierung der Proteinexpression an der Zelloberfläche wurden in früheren Studien verwendet. Die Etikettierung von nichtpermeabilisierten Zellen unter Verwendung von fluoreszenzmarkierten Antikörpern, die für das interessierende Protein spezifisch sind, gefolgt von der Visualisierung über Fluoreszenzmikroskopie, ist zum Beispiel ein allgemein angewandter Ansatz, ist aber stark abhängig von der Verfügbarkeit von Antikörpern, die an extrazelluläre Epitope binden können. In jüngerer Zeit wurden auch Verfahren, die die Verwendung von chimären Proteinen mit pH-empfindlichen Fluorophoren einschließen, die auf saures Medium ausgesetzt sind, erfolgreich eingesetzt worden 10 . Jedoch beinhalten solche Assays gewöhnlich die exogene Expression dieser Konstrukte in Zelllinien, in denen das Protein von Interesse nicht nativ gefunden wird. Diese Ansätze sind dennoch in der Lage, wertvolle Informationen über die subzelluläre Lokalisierung und exozytische Route derZiel-Protein und sollte daher in Verbindung mit den hier beschriebenen biotinylierungsbasierten Ansätzen verwendet werden, wenn die Werkzeuge verfügbar sind. In einem typischen Biotinylierungsassay werden die Zellen zunächst gründlich in 4 ° C PBS gewaschen. Dadurch werden Spuren von Serumproteinen, die durch das Kulturmedium eingeführt werden, entfernt, wodurch sichergestellt wird, dass diese im nächsten Schritt keine überschüssigen Mengen an Biotin verbrauchen werden. Noch wichtiger ist, dass die Verringerung der Temperatur die Endozytose deutlich verlangsamt. Das Biotinylierungsreagenz wird dann zugegeben. Als nächstes werden die Zellen wieder gewaschen und dann mit einem Quenchpuffer, der entweder Glycin oder NH &amp; sub4; Cl enthält, inkubiert, wobei der Zweck darin besteht, alle verbleibenden Spuren von nicht umgesetztem Biotin zu inaktivieren. Die Zellen werden dann lysiert, wonach Agarose-immobilisiertes Streptavidin zugegeben wird, um die biotinylierten Proteine ​​auszufällen. Die Analyse wird üblicherweise über Western-Blotting durchgeführt, was die relative Zelloberflächen-Expression verschiedener pr ermöglichtOteins zu quantifizieren. Aufgrund der Basis dieses Assays eignet es sich nur für die Verwendung von Proteinen, die Teile aufweisen, die der extrazellulären Umgebung ausgesetzt sind. Multipass-Transmembranproteine, die wahrscheinlich eine Anzahl reaktiver Lysine innerhalb ihrer Schleifenregionen besitzen, sind für diese Methode am geeignetsten, während Single-Pass-Proteine ​​dazu neigen, weniger anfällig für biotinyliert zu sein. Auch in diesen Fällen besteht die Möglichkeit, dass Konformationsänderungen oder intermolekulare Wechselwirkungen bestimmte reaktive Stellen verschließen können, was zu einer niedrigeren als erwarteten Biotinylierungsausbeute führt. Bestimmung der Internalisierungsrate von Zelloberflächenproteinen durch Biotinylierung Die Prinzipien dieses Assays ähneln weitgehend denen der Zelloberflächen-Biotinylierung mit einer Anzahl von Ausnahmen, wobei die wichtigste davon die Verwendung von reversiblen Biotinylierungsreagenzien ist. Die Biotin-Gruppen (davon) besitzen disuLfide Bindungen, in ihren Strukturen, die anfällig für Reduktionsmittel sind; Dies wird ausgenutzt, um sicherzustellen, dass nur Zelloberflächenproteine, die während der Testphase in intrazelluläre Stellen aufgenommen wurden, biotinyliert bleiben. Ein Assay findet in der Regel auf folgende Weise statt. Die Zellen werden zuerst gewaschen und mit kalten Reagenzien biotinyliert, dann wird das Zellkulturmedium bei 37 ° C wieder eingeführt und die Zellen werden in den Inkubator zurückgeführt; Dies bewirkt, dass die markierten Zelloberflächenproteine ​​einer Endozytose unterliegen. Das Reduktionsmittel Glutathion, das die Membran nicht durchdringen kann, wird dann zugegeben, um die Disulfidbindungen der Biotinreste zu brechen, die an Proteinen gebunden sind, die auf der Zelloberfläche verbleiben. Schließlich werden die gebrochenen Disulfidbindungen mit Iodacetamid umgesetzt, wobei die labilen Thiolgruppen verbraucht werden und die Bindungen daran gehindert werden, sich zu reformieren. Wie zuvor werden die Zellen dann lysiert und die markierten Proteine ​​werden unter Verwendung von Streptavidin-Agarose ausgefällt. Die BeschränkungsscheibeIm vorangegangenen Abschnitt gelten auch hier wegen der Ähnlichkeiten, die zwischen den Methoden geteilt werden. Darüber hinaus lohnt es sich zu bedenken, dass die an diesem Assay beteiligten Temperaturverschiebungen die genaue Bestimmung verhindern, wieviel Protein für jedes Zeitintervall endozytiert wird, insbesondere bei schnell verinnerlichten oder schnell recyclierenden Proteinen. Der Assay liefert daher nur eine semiquantitative Schätzung der endozytischen Raten. Total interne Reflexions-Fluoreszenzmikroskopie kann verwendet werden, um die Aufnahme jedes geladenen Vesikels zu verfolgen und eine genauere Messung der Kinetik der Endozytose zu liefern. Es kann daher eine sehr nützliche Ergänzung zu diesem Assay liefern, vorausgesetzt, dass ein fluoreszenzmarkiertes chimäres Konstrukt des Proteins von Interesse verfügbar ist 11 .

<table><tbody><tr><td>Ammoniumchlorid (NH4Cl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A661-500</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647-50</td><td></td></tr><tr><td>Bromphenolblau</td><td>Bio-Rad</td><td>#1610404</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete Proteaseinhibitor Cocktail</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11697498001</td><td></td></tr><tr><td>Dinatriumethylendiamintetraacetatdihydrat ( EDTA)</td><td>Bio-Rad</td><td>#1610729</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Bio-Rad</td><td>#1610611</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Gibco/Thermo Fisher Scientific</td><td>11960-044</td><td></td></tr><tr><td>EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#21335</td><td></td></tr><tr><td>EZ-Link Sulfo-NHS-SS-Biotin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#21331</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Kälberserum (FBS)</td><td>Gibco/Thermo Fisher Scientific</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229-1</td><td></td></tr><tr><td>Glycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8898&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Jodacetamid</td><td>Bio-Rad</td><td>#163-2109</td><td></td></tr><tr><td>Laminin aus Engelbreth-Holm-Swarm Maussarkom-Basalmembran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td>Auftauen auf Eis.</td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Gibco/Thermo Fisher Scientific</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Monoklonaler Anti-&Beta;-Aktin-Antikörper für die Maus (AC-15)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5441</td><td></td></tr><tr><td>Monoklonaler Anti-&-Dystroglykan-Antikörper für die Maus (43DAG1/8D5)</td><td>Leica Biosystems</td><td>B-DG-CE</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Gibco/Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Peroxidase AffiniPure Donkey Anti-Maus IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>715-035-150</td><td></td></tr><tr><td>Peroxidase AffiniPure Ziege Anti-Kaninchen IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>111-035-045</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Gibco/Thermo Fisher Scientific</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Reduziertes Glutathion</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6529</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-500</td><td></td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfat (SDS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>862010&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxid (NaOH)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318-100</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin Agaroseharz</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#20347</td><td></td></tr><tr><td>Kaninchen polyklonaler Anti-AQP4-Antikörper</td><td>Alomon</td><td>AQP-004</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Base (Trizma-Base)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP153-1</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-500</td><td></td></tr></tbody></table>

bestimmung der zelloberflächenexpression und der endozytischen rate von proteinen in primären astrozytenkulturen unter verwendung von biotinylierung

Determining Cell-surface Expression and Endocytic Rate of Proteins in Primary Astrocyte Cultures Using Biotinylation

Zelloberflächenproteine ​​vermitteln eine Vielzahl von Funktionen. In vielen Fällen wird ihre Aktivität durch endozytische Prozesse reguliert, die ihre Niveaus an der Plasmamembran modulieren. Hier stellen wir detaillierte Protokolle für 2 Methoden vor, die das Studium solcher Prozesse erleichtern, die beide auf dem Prinzip der Biotinylierung von Zelloberflächenproteinen basieren. Die erste ist so konzipiert, dass sie die semi-quantitative Bestimmung der relativen Ebenen eines bestimmten Proteins an der Zelloberfläche ermöglicht. In ihr werden die Lysinreste der Plasmamembranproteine ​​der Zellen zunächst mit einer Biotineinheit markiert. Sobald die Zellen lysiert sind, können diese Proteine ​​dann spezifisch durch die Verwendung von Agarose-immobilisiertem Streptavidin ausgefällt werden, indem sie die natürliche Affinität der letzteren für Biotin ausnutzen. Die so isolierten Proteine ​​können dann über einen Standard-Western-Blotting-Ansatz analysiert werden. Die zweite Methode liefert ein Mittel zur Bestimmung der endozytischen Rate einer PartikelAr Zell-Oberfläche Ziel über einen Zeitraum von Zeit. Zelloberflächenproteine ​​werden zuerst mit einem Biotinderivat modifiziert, das eine spaltbare Disulfidbindung enthält. Die Zellen werden dann wieder auf normale Kulturbedingungen verschoben, was die endozytische Aufnahme eines Anteils an biotinylierten Proteinen bewirkt. Als nächstes werden die Disulfidbindungen von nicht internalisierten Biotin-Gruppen unter Verwendung des membranundurchlässigen Reduktionsmittels Glutathion reduziert. Über diesen Ansatz können damit endozytierte Proteine ​​mit hohem Spezifitätsgrad isoliert und quantifiziert werden.

Mit der Zelloberflächen-Biotinylierung zur Beurteilung der Plasmamembran-Expression von AQP4 in Astrozyten Laminin-behandelte Astrozytenkulturen und unbehandelte Kontrollzellen wurden unter Verwendung der beschriebenen Verfahren einer Zelloberflächen-Biotinylierung unterworfen. Biotinylierte Proteine ​​wurden mit Agarose-konjugiertem Streptavidin ausgefällt und dann über SDS-PAGE getrennt. Zelloberflächenfraktionen wurden für AQP4 und β-Dystroglycan (β-DG) als Zel...

Zwei biotinylierungsbasierte Verfahren zur Bestimmung der Zelloberflächenexpression und der endozytischen Rate von Proteinen, die an der Plasmamembran exprimiert werden, sind in diesem Bericht dargestellt.

Bestimmung der Zelloberflächenexpression und der endozytischen Rate von Proteinen in primären Astrozytenkulturen unter Verwendung von Biotinylierung

Cell-surface proteins mediate a wide array of functions. In many cases, their activity is regulated by endocytic processes that modulate their levels at ...

In diesem Video werden zwei Methoden vorgestellt: die Biotinylierung der Zelloberfläche und die Pulse-Chase-Biotinylierung. In der folgenden Demonstration verwenden wir Astrozyten. Dies sind die häufigsten Gliazelltypen im Gehirn, und sie exprimieren zufällig unser Protein der Untersuchung, Aquaporin-4.Die Methoden, die wir in dieser Arbeit verwenden, können auf viele verschiedene Zelltypen angewendet werden, darunter sowohl Zellen in Suspension als auch adhärente Zellen. Mithilfe dieser Techniken lässt sich die Expression und Internalisierung praktisch jedes transmembranen Proteins an der Zelloberfläche untersuchen, solange es eine für Biotin zugängliche extrazelluläre Domäne besitzt. Das übergeordnete Ziel dieses Zelloberflächen-Biotinylierungsassays besteht darin, die Auswirkungen von Laminin auf die Expression des wasserpermeablen Kanals Aquaporin-4 an der Plasmamembran von Astrozyten zu bestimmen.Um dieses Verfahren zu beginnen, nehmen Sie die Astrozytenkulturen aus dem Inkubator und entfernen das Medium durch Absaugen. Waschen Sie die Zellen dreimal mit vier Millilitern kaltem CM-PBS und stellen Sie die Schalen auf zerstoßenes Eis. Entfernen Sie das CM-PBS durch Absaugen und pipettieren Sie anschließend zwei Milliliter Biotin-Puffer in jedes Well. Kippen Sie die Petrischalen mehrmals vorsichtig hin und her, um eine vollständige Benetzung sicherzustellen, bevor Sie die Kulturen 30 Minuten lang auf Eis stellen. Danach entfernen Sie den Biotin-Puffer, ersetzen ihn durch vier Milliliter Puffer zur Reaktionsbeendigung und belassen die Kulturen weitere 10 Minuten auf Eis. Anschließend saugen Sie den Puffer ab und ersetzen ihn durch die gleiche Menge frischen Puffer zur Reaktionsbeendigung, bevor Sie die Kulturen weitere 10 Minuten auf Eis stehen lassen.Danach den Abtömpuffer verwerfen und die Zellen dreimal mit je vier Milliliter kaltem CM-PBS waschen. Anschließend die Zellen in ein Milliliter kaltes CM-PBS abkratzen und die Suspension in ein Mikrozentrifugenröhrchen überführen. Im nächsten Schritt die Zellen durch Zentrifugation bei 100 × g für drei Minuten in einer auf vier Grad Celsius gekühlten Mikrozentrifuge pelletieren.Danach die Überstände verwerfen und die Zellen in 500 Mikroliter Lysepuffer resuspendieren. Anschließend die Proben 30 Minuten auf Eis stellen und alle fünf Minuten verwirbeln. Danach das Lysat bei 14.000 × g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren, um detergenhaltige und lösliche Bestandteile zu pelletieren.Anschließend überführen Sie den Überstand in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen. Heben Sie 50 Mikroliter des Lysats auf und geben Sie 25 Mikroliter dreifach konzentrierten Lade-Puffer hinzu. Denaturieren Sie anschließend durch Erhitzen auf 95 Grad Celsius in einem Trockenbad.Dies ist die Eingabefraktion, die sowohl biotinylierte Zelloberflächenproteine als auch nicht-biotinylierte zytosolische Proteine enthält. Überführen Sie mithilfe einer abgeschnittenen Pipettenspitze 75 Mikroliter Streptavidin-Agarose-Perlen in das Lysat und inkubieren Sie drei Stunden bei vier Grad Celsius auf einem Schüttler. Anschließend pelletieren Sie die Streptavidin-Agarose-Perlen durch Zentrifugation bei 1.500 × g für 30 Sekunden bei vier Grad Celsius.Speichern Sie 50 Mikroliter des Überstandes und geben Sie 25 Mikroliter dreifacher Lade-Puffer hinzu. Anschließend denaturieren Sie die Probe bei 95 Grad Celsius in einem Wasserbad oder einem Heizblock. Dies stellt die intrazelluläre Fraktion dar und besteht hauptsächlich aus nicht biotinylierten zytosolischen Proteinen.Anschließend die pelletierten Kügelchen in einem Milliliter Waschpuffer resuspendieren und drei Minuten bei vier Grad Celsius schwenken. Die Kügelchen pelletieren und den Überstand verwerfen. Diesen Vorgang insgesamt vier weitere Male wiederholen, um die unspezifische Bindung nicht biotinylierter zytosolischer Proteine zu minimieren.Fügen Sie 50 Mikroliter Lade-Puffer hinzu, der mit Lysepuffer auf ein X verdünnt wurde. Lösen Sie Biotin und Streptavidin von den Kügelchen, indem Sie diese bei 95 Grad Celsius denaturieren. Dieser Bruchteil sollte ausschließlich biotinylierte Zelloberflächenproteine enthalten.Im Anschluss trennen Sie die Input-, Zelloberflächen- und intrazellulären Fraktionen mittels SDS-PAGE und analysieren sie durch Western-Blotting. Das Gesamtziel des Pulse-Chase-Biotinylierungsversuchs besteht darin, die ungefähre Internalisierungsrate von Aquaporin-4 in Astrozyten zu bestimmen. Entfernen Sie zunächst die Astrozytenkulturen aus dem Inkubator und aspirieren Sie das Medium.Anschließend die Zellen dreimal mit vier Milliliter kaltem CM-PBS waschen und die Schalen auf zerstoßenes Eis stellen. Den CM-PBS abziehen und dann drei Milliliter Biotin-Puffer in jede Schale pipettieren. Die Schalen einige Male vor und zurück kippen, um eine gleichmäßige Verteilung des Puffers sicherzustellen, und 30 Minuten auf Eis stehen lassen.Anschießend den Biotin-Puffer abpipettieren und durch fünf Milliliter warmes Medium ersetzen. Eine Kulturplatte 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius inkubieren und eine zweite Platte bei derselben Temperatur 30 Minuten lang. Eine weitere Platte als Null-Minuten-Probe bei vier Grad Celsius belassen.Am Ende der Inkubationszeit verwerfen Sie das Medium und waschen die Zellen dreimal mit vier Millilitern kaltem CM-PBS. Danach aspirieren Sie das CM-PBS und pipettieren sechs Milliliter Reduktionspuffer über die Zellen. Lassen Sie die Probe 15 Minuten auf Eis. Ersetzen Sie anschließend den Puffer durch sechs Milliliter frischen Reduktionspuffer und stellen Sie die Probe weitere 15 Minuten auf Eis.Dieser Schritt ist entscheidend, da das im Reduktionspuffer enthaltene Glutathion die an der Zelloberfläche verbliebenen Biotin-Moasen spaltet. Dadurch wird sichergestellt, dass nur internalisierte Proteine mit Biotin markiert werden. Danach entfernen Sie die Reduktionslösung und ersetzen sie durch sechs Milliliter Puffer zur Reaktionsbeendigung.Lassen Sie die Probe weitere 15 Minuten auf Eis stehen und wiederholen Sie den Abbruchschritt noch einmal. Entsorgen Sie dann den Abbruchpuffer und waschen Sie die Zellen dreimal mit vier Milliliter kaltem PBS. Aspirieren Sie das CM-PBS und lösen Sie die Zellen mit einem Zellabheber in ein Milliliter kaltes PBS ab. Überführen Sie die Suspension in ein Mikrozentrifugenröhrchen.Die Zellen durch Zentrifugation bei 100 g für drei Minuten pelletieren. Nach drei Minuten den Überstand verwerfen und die Zellen in 500 Mikroliter Lysepuffer resuspendieren. Die Probe 30 Minuten auf Eis stehen lassen und alle fünf Minuten vortexen.Zentrifugieren Sie das Lysat bei 14.000 g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius, um das Detergens und lösliche Bestandteile zu pelletieren. Überführen Sie dann das Überstand in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen. Heben Sie 50 Mikroliter dieses Lysats auf und geben Sie Laufpuffer hinzu.Anschließend werden die Zellen in einem Trockenbad bei 95 Grad Celsius denaturiert. Dies ist die Input-Fraktion, die sowohl biotinylierte endozytosierte Proteine als auch nicht-biotinylierte Proteine enth&auml;lt. Unter Verwendung einer abgeschnittenen Pipettenspitze werden 150 Mikroliter der Streptavidin-Agarose-Suspension zum Lysat gegeben und drei Stunden bei vier Grad Celsius auf einem Sch&uuml;ttler inkubiert.Nach drei Stunden pelletieren Sie die Streptavidin-Agarose-Kügelchen durch Zentrifugation bei 1.500 × g für 30 Sekunden bei vier Grad Celsius. Resuspendieren Sie die Kügelchen in einem Milliliter Waschpuffer und schwenken Sie sie drei Minuten lang bei vier Grad Celsius. Pelletieren Sie die Kügelchen und entfernen Sie den Überstand.Wiederholen Sie diesen Vorgang noch viermal, um die unspezifische Bindung nicht biotinylierter zytosolischer Proteine zu minimieren. Anschließend pelletieren Sie die Kügelchen durch Zentrifugation bei 1.500 × g für 30 Sekunden bei vier Grad Celsius. Entsorgen Sie den überstehenden Waschpuffer und geben Sie 50 Mikroliter eines 1×-Ladebuffers hinzu.Lösen Sie Biotin und Streptavidin von den Perlen durch Denaturierung bei 95 Grad Celsius. Dieser Bruchteil sollte nur internalisierte Zelloberflächenproteine enthalten. Trennen Sie anschließend die Input-, Zelloberflächen- und ungebundenen Fraktionen mittels SDS-PAGE und analysieren Sie sie durch Western Blotting.Hier werden die Zelloberflächen-, intrazellulären- und Gesamtfraktionen von unbehandelten Astrozyten sowie von Astrozyten, die mit 24 Nanomolar Laminin behandelt wurden, dargestellt, die auf Aquaporin-4 und Beta-Dystroglykan untersucht wurden. Dieses Histogramm veranschaulicht die Unterschiede in den Zelloberflächenspiegeln von Aquaporin-4 in unbehandelten und mit Laminin behandelten Astrozyten, normiert gegen Beta-Dystroglykan. In dieser Abbildung wurden die internalisierten Proteinfraktionen, die zu den Zeitpunkten null, 15 und 30 Minuten gesammelt wurden, auf Aquaporin-4 analysiert.Und dieses Histogramm fasst die Internalisierung von Aquaporin-4 für vier unabhängige Experimente zusammen, normiert auf die Werte des Zeitpunkts null Minuten. Der Sternchenwert zeigt eine statistisch signifikante Zunahme der Menge an Aquaporin-4 an, die zwischen 15 und 30 Minuten endozytiert wurde. Wenn Glutathion verwendet wird, um die Disulfidbindung im spaltbaren Biotin-Analogon zu brechen, wird der Beitrag von Aquaporin-4 an der Zelloberfläche zum biotinylierten Anteil stark verringert.Es ergibt sich ein deutlicher Unterschied zwischen den Proben der Nullminute und der 15. Minute. Wenn dieser Schritt weggelassen wird, macht das Signal aus dem Pool der Zelloberfläche die Unterscheidung zwischen den beiden Zeitpunkten unerkennbar. Nach Durchführung dieses Verfahrens könnten andere Methoden wie Immunfluoreszenz und TIRF-Mikroskopie angewendet werden, um weitere Fragen zu beantworten, beispielsweise zur physikalischen Transportbewegung des Cargos.

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Regulierte Endozytose regelt die Zelloberflächenexpression Ebenen der Mehrheit der Membranproteinen. Hier nutzen wir reduzierbar, Membran impermeante Biotinylierungsreagenzien die endocytischen Rate der Dopamin-Transporter (DAT), ein polytoper Membranprotein zu messen. Das Verfahren ermöglicht eine einfache Methode zur Messung der Endozytose von den meisten Plasmamembranproteinen.

Mess-Plasmamembranprotein endocytischen Preise von Reversible Biotinylierung

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Isolierung von zelloberflächen- und intrazellulären Proteinen aus einer Astrozytenkultur

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Bestimmung der Zelloberflächenexpression und der endozytischen Rate von Proteinen in primären Astrozytenkulturen unter Verwendung von Biotinylierung (Video) | JoVE Journal

Bestimmung der Zelloberflächenexpression und der endozytischen Rate von Proteinen in primären Astrozytenkulturen unter Verwendung von Biotinylierung

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