Name: In-vitro- Ovulum Anbau für Live Cell Imaging der Zygote Polarisation und Embryo Musterung in Arabidopsis thaliana (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 41 s
Description: Lernen Sie die In-vitro-Ovulum-Anbaumethode für Live-Cell-Imaging von Zygote-Polarisation und Embryo-Musterung in Arabidopsis thaliana. Diese Technik ermöglicht die Visualisierung lebender Dynamiken während der Embryogenese.

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Mikroskopie in dieser Arbeit wurde durchgeführt an das Institut der transformativen Biomoleküle (WPI-ITbM) der Universität Nagoya und von Japan Advanced Plant Science Network unterstützt. Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse von der Japan Science and Technology Agency (ERATO Projekt, t.h. und M.U.) und der Japan Society zur Förderung der Wissenschaften: eine Beihilfe für die wissenschaftliche Forschung an innovativen Bereichen (Nos. JP24113514, JP26113710, JP15H05962 und JP15H05955 für M.U. und Nos. JP16H06465, JP16H06464 und JP16K21727 für T.H), eine Beihilfe für den wissenschaftlichen Nachwuchs (B, Nos. JP24770045 und JP26840093 für M.U.), und eine Beihilfe für anspruchsvolle Pionierforschung (No. JP16K14753 für M.U.).

1. Vorbereitung des Kulturmediums In vitro- Ovulum <ol><li>machen das flüssige Medium für die in-vitro- Kultur von Ovulum (&#34; N5T Medium &#34;) mit 1 X Nitsch basale Salzgemisch, 5 % (w/V) Trehalose Dihydrat, 0,05 % (w/V) 2-(N-Morpholino) Ethanesulfonic Säure (MES)-KOH (pH-Wert 5,8), und 1 X Gamborg &#39; s Vitamin Lösung.</li>
	<li>Einstellen den pH-Wert 5,8 mit KOH.</li>
	<li>Sterilisieren dem Medium durch Autoklavieren (121 ° C, 20 min) oder durch einen 0,22-µm-Filter filtern. 
	Hinweis: Das sterilisierte Medium kann bei 4 ° C für ca. 2-3 Monate gespeichert werden.</li>
</ol> 2. Vorbereitung des Geräts PDMS Micropillar Array <ol><li>schneiden die PDMS Micropillar Gerät durch ein Messer, Schere, passen in das Glasteil (14 mm φ) ein 35 mm Glasboden Teller oder Rasierklinge. 
	Hinweis: Das gesamte Verfahren der PDMS-Gerätekonstruktion ist in früheren Papiere 8 , 9 beschrieben und somit die Details sind hier weggelassen. Glasboden Gerichte mit kleineren Stückzahlen, z. B. 4-Brunnen oder 96-Well-Platten, können für kurzfristige Bildgebung ohne das Gerät verwendet werden.</li>
	<li>Sterilisation der Oberseite des Geräts PDMS unter UV-Licht für 15 min.</li>
	<li>PDMS Gerät durch quadratische Spitze Pinzette, und halten Sie es unter UV-Licht für 15 min auf die Unterseite zu sterilisieren.</li>
	<li>Übertragen die sterilisierte PDMS-Gerät in einer Kulturschale 35 mm und das N5T Medium hinzufügen, bis das Gerät vollständig in das Medium (ca. 5-7 mL) getränkt ist.</li>
	<li>Setzen Sie die Schale in eine Vakuumkammer und reduzieren Sie den Druck zu entgasen. Halten Sie für 3 h über Nacht, bis die Luft in das Gerät durch Medium ersetzt wird Staubsaugen. 
	Hinweis: Das Gerät kann durch Luftblasen unter einen starken Unterdruck abgenommen werden.</li>
	<li>Bringen Sie das Gerät aus der Schale, indem Sie es mit einer Pinzette quadratische Spitze halten und legte es auf ein Papiertuch, das zusätzliche Medium auf der Seite und unten entfernen. 
	Hinweis: das Medium im Micropillar-Array (Oberseite) sollte nicht entfernt werden, da dies für das Ovulum Anbau verwendet werden.</li>
	<li>Übertragen Sie das Gerät auf eine 76 mm x 26 mm Folie Glas, Gewährleistung den Micropillar Teil als die Oberseite zu halten und decken Sie das Gerät mit 35 mm Kultur Schale Deckel um das Medium vor dem Austrocknen während der folgenden Ovulum Extraktion zu verhindern.</li>
</ol> 3. Schote Dissektion und Ovulum Extraktion <ol><li>sterilisieren eine Nadel (0,40 mm G) und feinen Pinzette durch Abwischen mit 70 % Ethanol. Die Nadel ist leicht durch Anhängen an eine Spritze oder Holz-Stick behandelt.</li>
	<li>Der Blütenstand der Pflanze zu überprüfen, und wählen Sie die richtige Siliques für das Experiment. Die ca. 5 mm Siliques enthalten Zygoten, und 8-10 mm Siliques junge Kugelsternhaufen Embryonen.</li>
	<li>Verbrauchsteuern des Siliques mit Hilfe einer Pinzette und legen Sie sie auf doppelseitigem Klebeband auf das Glas der Folie 76 x 26 mm. Eine Schote enthält etwa 40-60 Samenanlagen und 3-4 Siliques (d. h. 120-240 Eizellen) sind ausreichend für ein Gerät.</li>
	<li>Öffnen Sie die Schote (Eierstock Wand) um zu sehen, die Eizellen im Inneren mit den sterilisierten Nadel und Pinzette unter einem Stereomikroskop. Nur die Eierstock Wand geschnitten, so dass die Eizellen nicht beschädigt werden.</li>
	<li>Übertragen die geöffneten Schote in das N5T Medium auf dem PDMS-Gerät (in Schritt 2.7 vorbereitet), und lassen Sie Ovula in das Medium mit der Nadel oder Pinzette.</li>
	<li>Setzen ein kleines Cover-Glas (18 x 18 mm) auf das PDMS-Gerät, drücken Sie die Eizellen in die Räume im Micropillar-Array.</li>
	<li>Das Deckglas abzunehmen, ziehen sie horizontal mit Fingern oder Pinzette, um zusätzliche Mittel zu entfernen.</li>
	<li>Der PDMS-Gerät umdrehen, legen Sie sie in eine 35 mm Glasboden Schale und leicht drücken Sie das Gerät durch Drücken der quadratische Spitze Pinzette, um es auf das Glas kleben.</li>
	<li>Pour N5T Medium sanft in den Glasboden Schale durch die mittlere Flasche umfüllen, bis das PDMS-Gerät komplett in das Medium eingeweicht wird, und versiegeln Sie die Schale mit Paraffin Film. 
	Hinweis: Das PDMS-Gerät kann recycelt werden, aber Geräte, die zu alt sind werden einfach losgelöst von den Glasboden. Darüber hinaus kann das Gerät schweben wenn es nicht völlig im Schritt 2.5 entgast ist oder das Medium ist zu schnell gegossen.</li>
</ol> <img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55975/55975fig2.jpg" /> Abbildung 2: Schematische Vorgehensweise zur Probenaufbereitung. 
Diese schematische Strömung entspricht Schritte 3,5 bis 4,1. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55975/55975fig2large.jpg" target="_blank"> Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
 4. Time-Lapse Imaging <ol><li>die Glasboden Gericht, das vorbereitet wurde in Schritt 3,9 auf einem inversen Mikroskop, und wählen Sie geeignete Eizellen zu konzentrieren auf. 
	Hinweis: Da die Eizellen im Stadium, Position und Richtung variieren, geeignete Eizellen gefunden werden sollte durch die Überprüfung ihrer Marker Fluoreszenz.</li>
	<li>Starten Sie den live-Imaging nach Angaben des Herstellers &#39; s Anweisungen des Mikroskops Systems. 
	Hinweis: Die Mikroskop-Ausrüstung und Parameter sind vielfältig, und so sollten die Benutzer wählen die richtigen Einstellungen, die dem Experiment Zweck passen. Als Beispiel, die Einstellungen in dieser Handschrift sind in Tabelle 1 aufgeführten.</li>
</ol> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"> <tbody><tr><td>Ausstattung/Einstellung</td> <td>Abbildung 3 (A) und ergänzende Videos 1 und 4</td> <td> Abbildung 3 (B) und ergänzende Video 2</td> <td>zusätzliche Video-3</td></tr> <tr><td>Mikroskop</td> <td>Laserscanning - Mikroskop (A1R MP) invertiert</td> <td>rotierende Festplatten konfokale inversen Mikroskop (CSU-W1)</td> <td> kastenförmigen invertiert confocal Mikroskop-System mit einer stabilen Inkubation Kammer (CV1000)</td></tr> <tr><td>Laser</td> <td>Femtosekundenlaser Puls Exklusivrepräsentation</td> <td>488 nm und 561 nm LD Laser</td> <td>488 nm und 561 nm LD Laser</td></tr> <tr><td>O Bjective Objektiv</td> <td>40 X Objektiv eintauchen in Wasser (NA = 1,15) mit Immersion Medium</td> <td>60 X Silikon-Öl-Immersion-Objektiv (NA = 1,30), montiert auf einem Piezo Fokustrieb</td> <td>40 X Objektiv (NA = 0,95)</td></tr> <tr><td>erkennen oder</td> <td>externen nicht descanned GaAsP PMT Detektor</td> <td>EMCCD Kamera</td> <td>EMCCD Kamera</td></tr> <tr><td>dichroitischen spiegeln</td> <td>DM495 und DM560</td> <td>DM488/561</td> <td>DM400-410/488/561</td></tr> <tr><td>Filter</td> < td > Bandpass-Filter; 534/30 nm und 578/105 nm</td> <td>Bandpass-Filter; 520/35 nm und 593/46 nm</td> <td>Bandpass-Filter; 520/50 nm und 617/73 nm</td></tr> <tr><td>Scheibe Achse</td> <td>31 Z-Stapel mit Abständen von 1 µm</td> <td>inter 17 Z-Stapel mit 3 µm Vals</td> <td>7 Z-Stapel mit Intervallen von 5 µm</td></tr> <tr><td>Zeitintervall</td> <td>20 min</td> <td>5 min</td> <td>10 min</td></tr></tbody></table> Tabelle 1: die Mikroskopsysteme und Einstellungen in diesem Manuskript verwendet. 
Die Mikroskope und Parameter sind vielfältig, und so sollte jeder Benutzer wählen das passende System für das Experiment.
<ol start="3"> <li>die erworbenen Bildsequenz zu überprüfen, und wandelt es in die allgemeine Film-Format wie AVI oder MOV für Präsentation. 
	Hinweis: Wenn die Mikroskop-Software die Bilder als Filmformat ausgeben kann, ist es möglich, die Bilder als TIF speichern und öffnen Sie sie dann in ImageJ, ein open Source Programm inspiriert von NIH Image, um den Dateityp zu ändern. ImageJ versehen ist: https://imagej.nih.gov/ij/. ImageJ kann auch verwendet werden, um ein Z-s zu machenFilm, wie die maximale Intensität Projektion, verstauen, wie beschrieben: https://imagej.net/Z-functions.</li>
</ol>

<ol><li>Natesh, S., Rau, M. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNatesh%2C+S+%22Embryology+of+Angiosperms%22">Embryology of Angiosperms</a>. Johri, B. M. , Springer. Berlin Heidelberg. 377-443 (1984).</li>
<li>Kranz, E., Lorz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+fertilisation+of+maize+by+single+egg+and+sperm+cell+protoplast+fusion+mediated+by+high+calcium+and+high+pH%5BTitle%5D)+AND+%22Zygote%22%5BJournal%5D)">In vitro fertilisation of maize by single egg and sperm cell protoplast fusion mediated by high calcium and high pH.</a> Zygote. 2 (2), 125-128 (1994).</li>
<li>Uchiumi, T., Uemura, I., Okamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+an+in+vitro+fertilization+system+in+rice+%28Oryza+sativa+L.%29%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Establishment of an in vitro fertilization system in rice (Oryza sativa L.).</a> Planta. 226 (3), 581-589 (2007).</li>
<li>Sun, M. X., Moscatelli, A., Yang, H. Y., Cresti, M. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s004970000063">In vitro double fertilization in Nicotiana tabacum (L.): the role of cell volume in cell fusion.</a> Sex Plant Rep. 13 (4), 225-229 (2001).</li>
<li>Tian, H. Q., Yuan, T., Russell, S. D. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s00497-004-0233-9">Relationship between double fertilization and the cell cycle in male and female gametes of tobacco.</a> Sex Plant Rep. 17 (5), 243-252 (2004).</li>
<li>Costa, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+cell-derived+peptides+regulate+early+embryo+patterning+in+flowering+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Central cell-derived peptides regulate early embryo patterning in flowering plants.</a> Science. 344 (6180), 168-172 (2014).</li>
<li>Sauer, M., Friml, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+culture+of+Arabidopsis+embryos+within+their+ovules%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">In vitro culture of Arabidopsis embryos within their ovules.</a> Plant J. 40 (5), 835-843 (2004).</li>
<li>Gooh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+imaging+and+optical+manipulation+of+Arabidopsis+early+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Live-cell imaging and optical manipulation of Arabidopsis early embryogenesis.</a> Dev Cell. 34 (2), 242-251 (2015).</li>
<li>Park, J., Kurihara, D., Higashiyama, T., Arata, H. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0925400513011015">Fabrication of microcage arrays to fix plant ovules for long-term live imaging and observation.</a> Sens Act B-Chem. 191, 178-185 (2014).</li>
<li>Kimata, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoskeleton+dynamics+control+the+first+asymmetric+cell+division+in+Arabidopsis+zygote%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cytoskeleton dynamics control the first asymmetric cell division in Arabidopsis zygote.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (49), 14157-14162 (2016).</li>
<li>Nambo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+of+Synthetic+Chemistry+and+Live-Cell+Imaging+Identified+a+Rapid+Cell+Division+Inhibitor+in+Tobacco+and+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Combination of Synthetic Chemistry and Live-Cell Imaging Identified a Rapid Cell Division Inhibitor in Tobacco and Arabidopsis thaliana.</a> Plant Cell Physiol. 57 (11), 2255-2268 (2016).</li>
<li>Mizuta, Y., Kurihara, D., Higashiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+with+longer+wavelength+excitation+in+intact+Arabidopsis+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Protoplasma%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging with longer wavelength excitation in intact Arabidopsis tissues.</a> Protoplasma. 252 (5), 1231-1240 (2015).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Dieses Manuskript stellt eine einfachen in Vitro Ovulum Anbau-Protokoll, die effizient für den Einsatz in live Cell Imaging Zygoten und Embryonen zu entwickeln ist.
Das Design des Geräts PDMS ggf. Optimierung nach dem Embryonalstadium. Das erste entwickelte Gerät war ein Microcage Array die Ausrichtung anpassen und die Position der Eizellen9zu fixieren, und dann ein Micropillar Gerät wurde gebaut, um Eizellen effizienter trap8. Darüber h...

Der Grundkörper Plan eines Organismus entwickelt sich aus einem einzelligen Zygote. Bei den meisten Blütenpflanzen erzeugt zygotic Division eine apikale und eine basale Zelle, die zu dem Shooting und Wurzel, bzw.1zu entwickeln. Daher ist es wichtig zu verstehen, wie der Pflanzenkörper in der Embryogenese gebildet wird, aber es wurde kein wirksames Instrument, um die Dynamik des lebendigen Zygoten und Embryonen direkt zu beobachten, weil sie tief in der Blüte entwickeln. Eine in-vitro- Befruchtung-Methode wurde in mehreren Monocot Arten, wie Mais und Reis etablierten2,3. Bei dieser Methode isolierten Spermien und Eizellen sind verschmolzen, elektrisch oder chemisch, und die generierten Zelle in eine fruchtbare Pflanze entwickeln kann. In Dicot Pflanzen ist jedoch keine in-vitro- Befruchtung Methode, die richtige Embryonen, vermutlich aufgrund der nicht synchronisierten Zellzyklus von männlichen und weiblichen Gameten4,5produzieren kann. Darüber hinaus spielt das Embryo umgebenden Gewebe (Endosperm) eine wichtige Rolle im Embryo Entwicklung6.
In einem Modell Dicot Arten, A. Thaliana, wurde eine in-vitro- Kultivierung Methode entwickelt, durch die Konzentration auf das ganze Ovulum, das den Embryo und Endosperm7enthält. Dieses System wurde erfolgreich verwendet, um die Auswirkungen der verschiedenen chemischen Reagenzien auf Embryogenese analysieren, aber es ist nicht geeignet für Zeitraffer-imaging, weil es eine geringe Überlebensrate hat. Daher wurde eine neuartige in-vitro- Ovulum Anbausystem entwickelt, um so früh wie die Zygote Bühne und fruchtbaren Pflanzen in einem hohen Verhältnis8zu produzieren. Nach verschiedenen Studien wurde festgestellt, dass Nitsch-Medium und Trehalose erheblich verbessert die Überlebensrate der Eizellen8. Da das Ovulum erweitert wird, wie es wächst und so häufig bewegt sich weg vom Feld der Beobachtung des Mikroskops, wurde darüber hinaus ein PDMS Gerät entwickelt, um das Ovulum im mittleren9zu beheben. Das PDMS-Gerät aktiviert die langfristige Imaging für 3-4 Tage, die ausreicht, um die Entwicklung von einer Zygote zu einem Herz-Bühne Embryo zu verfolgen. Mit dieser Methode wird es möglich, die Dynamik der Zygote Polarisation und Embryo-Strukturierung, nicht nur unter normalen Bedingungen, aber auch in Anwesenheit von chemische Inhibitoren oder in verschiedenen mutierten Hintergründe8,10 visualisieren ,11.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55975/55975fig1.jpg"> 
Abbildung 1: Schematische Darstellung der spezifischen fluoreszierenden Marker verwendet, um zu visualisieren Zygoten und Embryonen durch das Ovulum. Die Arabidopsis Zygote entwickelt sich ein Embryo in das Ovulum, die tief im Inneren der Blume erzeugt wird. In dieser in-Vitro -Anbausystem der Zygote und Embryo durch das Ovulum eingehalten werden, und so ist es wichtig, bestimmte fluoreszierende Marker zu verwenden, die nicht in anderen Ovulum Geweben ausgedrückt werden. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55975/55975fig1large.jpg" target="_blank">Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.</a>

<table><tbody><tr><td>Nitsch Basalsalzmischung</td><td>Duchefa</td><td>N0223</td><td></td></tr><tr><td>Trehalose-Dihydrat</td><td>Wako Pure Chemical</td><td>206-18455</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Dojindo</td><td>345-01625</td><td></td></tr><tr><td>Gamborg' s Vitaminlösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1019</td><td></td></tr><tr><td>35-mm-Schale mit Glasboden</td><td>Matsunami</td><td>Glas-D111300</td><td></td></tr><tr><td>35-mm-Kulturschale</td><td>Corning</td><td>430588</td><td></td></tr><tr><td>PDMS</td><td>Dow Corning Co.</td><td>Sylgard184</td><td></td></tr><tr><td>76 & 26 mm Gleitglas</td><td>Matsunami Glas</td><td>S1225</td><td></td></tr><tr><td>18 & 18 mm Gleitglas</td><td>Matsunami Glas</td><td>C018181</td><td></td></tr><tr><td>Nadel (Stärke 0,40 mm)</td><td>Terumo</td><td>NN-2719S</td><td></td></tr><tr><td>Immersion medium Immersol W 2010</td><td>Zeiss</td><td>444969-0000-000</td><td></td></tr><tr><td>A1R MP</td><td>Nikon</td><td>A1RsiMP(1080) Ti-E-TIRF</td><td></td></tr><tr><td>CSU-W1</td><td>Yokogawa Electric</td><td></td><td>Es handelt sich um eine kundenspezifische Ausrüstung, daher ist die Katalognummer nicht verfügbar.</td></tr><tr><td>CV1000</td><td>Yokogawa Elektro</td><td>CV1000-SP84</td><td></td></tr></tbody></table>

in-vitro- ovulum anbau für live cell imaging der zygote polarisation und embryo musterung in arabidopsis thaliana

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In den meisten Blütenpflanzen die Zygote und Embryo sind tief in das Gewebe der Mutter versteckt, und so es ist seit langem ein Rätsel wie sie dynamisch entwickeln; z. B. polarisiert wie die Zygote um Körperachse und wie der Embryo gibt verschiedene Zelle Schicksale während Orgel Bildung zu schaffen. Dieses Manuskript beschreibt eine in-vitro- Ovulum Kultur-Methode ausführen live Cell Imaging Zygoten und Embryonen von Arabidopsis Thalianazu entwickeln. Das optimierte Anbau Medium ermöglicht Zygoten oder frühen Embryonen bis zu fruchtbaren Pflanzen heranwachsen. Durch die Kombination mit einem poly(dimethylsiloxane) (PDMS) Micropillar Array Gerät, wird das Ovulum in das flüssige Medium in der gleichen Position gehalten. Diese Fixierung ist entscheidend für die gleichen Eizelle unter dem Mikroskop für mehrere Tage aus der zygotic Division Spätstadium Embryo zu beobachten. Das resultierende live-Cell Imaging kann verwendet werden, um die Echtzeit-Dynamik der Zygote Polarisation, wie nukleare Migration und Cytoskelett Neuordnung, und auch das Timing der Zellteilung und Zelle Schicksal Spezifikation beim Embryo Musterung zu überwachen. Darüber hinaus sind diese Ovulum Anbausystem mit Inhibitor Behandlungen, die Auswirkungen verschiedener Faktoren auf die Entwicklung des Embryos zu analysieren und mit optischen Manipulationen wie z. B. Laser-Unterbrechung, die Rolle der Zell-Zell-Kommunikation zu untersuchen kombinierbar.

Durch die Verwendung dieser Ovulum Anbausystem, kann diese Methode die lebendige Dynamik der Zygote Polarisation und Embryo Musterung zurückverfolgen. Dies ist eine Leistung, denn bisher gab es keine Technik zu visualisieren das Echtzeitverhalten der Zygote und Embryo, die tief in das Gewebe der Mutter versteckt sind. Abbildung 3A und ergänzenden Video 1 zeigen, dass die Mikrotubuli (MTs) in die junge Zygote als transversale Ring in der subap...

Dieses Manuskript beschreibt eine in-vitro- Ovulum Anbaumethode, die live Cell Imaging von Arabidopsis Zygoten und Embryonen ermöglicht. Diese Methode wird genutzt, um die intrazellulären Dynamik während der Zygote Polarisation und die Zelle Schicksal Spezifikation bei der Entwicklung von Embryonen zu visualisieren.

In-vitro- Ovulum Anbau für Live Cell Imaging der Zygote Polarisation und Embryo Musterung in Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Live-Cell-Bildgebung von Arabidopsis-Zygoten und -Embryonen zur Visualisierung der Dynamik ihrer Embryogenese zu ermöglichen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Pflanzenentwicklung zu beantworten, beispielsweise wie die Asymmetrie der Zygote und die Embryomorphologie entstehen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass wir die dynamischen Vorgänge der Zygotpolarisierung und der Embryomusterbildung in Echtzeit verfolgen können.Die visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die Vorbereitung mit dem Mikrosäulengerät und den Samenanlagen allein durch Text schwer zu erklären ist. Um das PDMS-Mikrosäulenarray-Gerät vorzubereiten, schneiden Sie das Gerät zunächst so zurecht, dass es in eine 35-Millimeter-Glasbodenkulturschale passt, und sterilisieren Sie die Ober- und Unterseite des Geräts jeweils einer 15-minütigen UV-Bestrahlung pro Seite. Nach der Sterilisation beider Seiten überführen Sie das PDMS-Gerät in eine neue 35-Millimeter-Kulturschale und geben fünf bis sieben Milliliter frisches N5T-Medium in die Schale, bis das Gerät vollständig bedeckt ist.Platzieren Sie die Schale dann in eine Vakuumkammer und verringern Sie den Druck, wobei das Gerät im Vakuum verbleibt, bis die gesamte Luft im Gerät durch Medium ersetzt wurde. Wenn das Gerät entgast ist, verwenden Sie kantige Pinzette, um das Gerät auf einem Stück Papiertuch abzutupfen, um überschüssiges Medium von den Seiten und der Unterseite zu entfernen. Anschließend platzieren Sie das Gerät auf einem 76 mal 26 Millimeter großen Objektträger und bedecken es mit einem 35-Millimeter-Kulturschalen-Deckel, um das Gerät hydratisiert zu halten.Bevor Sie mit der Dissektion beginnen, sterilisieren Sie eine Nadel mit 0,40 Millimeter Durchmesser und feine Pinzette mit 70 Prozent Ethanol. Überprüfen Sie anschließend den Blütenstand der Pflanze, um die geeigneten Schoten für das Experiment auszuwählen. Die etwa fünf Millimeter langen Schoten enthalten Zygoten, während die acht bis zehn Millimeter langen Schoten junge globuläre Embryonen enthalten.Übertragen Sie mit einer Pinzette drei bis vier interessierende Schoten auf ein Stück doppelseitiges Klebeband auf einem Objektträger mit den Maßen 76 mal 26 Millimeter. Danach bringen Sie den Objektträger unter ein Stereomikroskop und öffnen mit einer Nadel und der Pinzette die Fruchtwände. Übertragen Sie die geöffneten Schoten auf das Mikrosäulen-Array des PDMS-Geräts und geben Sie die Samenanlagen in das Medium frei.Danach ein 18 mal 18 Millimeter großes Deckglas auf das Gerät setzen, um die Samenanlagen in die Zwischenräume des Mikrosäulen-Arrays zu drücken. Sobald die Samenanlagen an ihrem Platz sind, das Deckglas mit einer Pinzette oder den Fingern horizontal vom Gerät abziehen, um überschüssiges Medium zu entfernen, und das Gerät verkehrt herum in eine neue 35-Millimeter-Glasboden-Dish überführen. Mit der Spitze der eckigen Pinzette das Gerät leicht auf den Boden der Dish drücken und frisches N5T-Medium in die Dish gießen, bis das Gerät vollständig bedeckt ist.Danach die Schale mit Parafilm verschließen. Für die Zeitrafferaufnahmen der Samenanlagen die Schale auf den Objekttisch eines invertierten Mikroskops übertragen und mithilfe der Marker-Fluoreszenz die für die Aufnahme geeigneten Samenanlagen auswählen. Sobald die optimalen Samenanlagen lokalisiert sind, die Live-Bildgebung der Proben gemäß den Empfehlungen des Herstellers beginnen.Dieses System zur Kultivierung von Samenanlagen ermöglicht die Verfolgung der lebenden Dynamik der Zygotpolarisation und der Embryomusterung. Beispielsweise lässt sich hier die Anreicherung von Mikrotubuli als quer verlaufender Ring beobachten, gefolgt von deren Umformung zu einem Spindelapparat. Anschließend teilen sich die embryonalen Zellen quartär und bilden eine radial symmetrische kugelige Struktur. Die Behandlung der kultivierten Embryosäcke mit einem Aktinpolymerisationsinhibitor hemmt jedoch die Migration der polaren Kerne, was zu einer symmetrischeren Teilung der Zygote führt und auf eine Rolle von Aktinfilamenten bei der Polarisation der Zygote hindeutet. Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie bei korrekter Durchführung innerhalb von zwei Stunden abgeschlossen werden. Im Anschluss an dieses Verfahren kann eine Laser-Disruption durchgeführt werden, um weitere Fragen zur Rolle der Zell-zu-Zell-Kommunikation bei der Embryonalanlage zu beantworten.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man enge Ereignisse während der Embryogenese visualisiert.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Wir beschreiben ein Protokoll mit Kammer-Objektträgern und Medien zu pflanzen Keimblätter für die konfokale Bildgebung der Epidermis über mehrere Tage der Entwicklung immobilisieren, zu dokumentieren stomatal Differenzierung. Fluorophor-markierte Proteine ​​können dynamisch durch Expression und subzelluläre Lokalisation verfolgt werden, das Verständnis ihrer möglichen Rollen bei der Zellteilung und Zelltyp-Differenzierung.

Langfristige, High-Resolution Konfokale Zeitraffer Bildgebung<em&gt; Arabidopsis Cotyledon</em&gt; Epidermis während der Keimung

Wir berichten über eine effiziente und einfache Methode, um Embryonen in frühen Stadien der Entwicklung Isolat...

Effiziente und schnelle Isolierung von Frühphasen-Embryonen aus<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Seeds

Wir bieten hier eine effiziente und zuverlässige Protokoll für die Immunfärbung, Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung, DNA-Färbung, gefolgt von quantitativen und hochauflösende Bildgebung in der whole-mount Arabidopsis thaliana Samenanlagen. Diese Methode wurde erfolgreich eingesetzt, um Chromatin-Modifikationen und Zellkernarchitektur zu analysieren.

Eine effiziente Methode zur quantitativen, Einzel-Zell-Analyse von Chromatin Modifikation und Reaktor Architektur in Whole-Mount-Samenanlagen in<em&gt; Arabidopsis</em

Das Ziel ist es, zu veranschaulichen, dass das Modell-Legumino Medicago truncatula leicht verwendet werden kann, um die Regulation der frühen Pflanzenembryogenese zu untersuchen, um das Nicht-Leguminosen-Modell von Arabidopsis zu ergänzen. Die Pod-Morphologie ist mit den Stadien der zygotischen Embryogenese verknüpft, und es wird auch ein Protokoll zur Entnahme von Embryonen mittels Gewebekultur zur Verfügung gestellt.

Protokolle für die Beschaffung Zygotic und somatischen Embryonen zur Untersuchung der Regulation der frühen Embryo-Entwicklung in der Modell-Hülsenfrucht<em&gt; Medicago truncatula</em

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Beobachtung der Embryogenese in Arabidopsis über Ovulum Abstand gefolgt von der Inspektion der Embryo Musterbildung unter dem Mikroskop.

Eine Methode zur Charakterisierung der Embryogenese in Arabidopsis

Wir zeigen eine Methode zur Bestimmung einer erfolgreichen oder fehlgeschlagenen Befruchtung auf Basis der Spermien-Kernmorphologie in Arabidopsis Doppelbefruchtung mit einem Epifluoreszenzmikroskop.

Bewertung des Düngezustands durch Rückverfolgung der Sperma-Kernmorphologie in Arabidopsis Doppeldüngung

Hier beschreiben wir eine Verbesserung der Semi-in-vitro (SIV) Methode zur Beobachtung der Pollenschlauchführung und -aufnahme bei Arabidopsis thaliana, die die Empfänglichkeit der Eizellen erhöht. Die Hochdurchsatz-SIV-cum-Septum-Methode kann mit Gametophyten-Markerlinien und genetisch kodierten Biosensoren gekoppelt werden, um den dynamischen Prozess der Befruchtung zu überwachen.

Live-Bildgebung der Arabidopsis-Pollensondenaufnahme und Doppelbefruchtung mit der Semi-In-vitro-Cum-Septum-Methode

Die Chromosomenbewegung während der meiotischen Prophase ist ein wenig verstandenes Phänomen, das für die Sporenbildung von grundlegender Bedeutung ist. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Erfassung, Analyse und Quantifizierung von Zentromerbewegungen während der meiotischen Prophase in männlichen Meiozyten von Arabidopsis thaliana .

Live-Imaging-Charakterisierung von Zentromerbewegungen während der männlichen meiotischen Prophase in Arabidopsis thaliana

Dieser Artikel beschreibt in vivo und in vitro Methoden zur Charakterisierung der thymusabsetzenden Vorläuferzellen durch die Analyse der Kinetik der Erzeugung, des Phänotyps und der Anzahl ihrer T-Zell-Nachkommen.

Charakterisierung von Thymic Einschwingzeit Vorläufern in der Mouse Embryo Verwendung<em&gt; In Vivo</em&gt; Und<em&gt; In-vitro-</em&gt; Assays

Die Abbildung des dynamischen Verhaltens von Organellen und anderen subzellulären Strukturen in vivo kann Aufschluss über ihre Funktion unter physiologischen und Krankheitsbedingungen geben. Hier stellen wir Methoden vor, mit denen zwei Organellen, Zentrosomen und Mitochondrien, genetisch markiert und ihre Dynamik in lebenden Zebrafischembryonen mittels Weitfeld- und Konfokalmikroskopie abgebildet werden können.

Imaging subzellulärer Strukturen in der Living Zebrafischembryo

Lernen Sie die In-vitro-Ovulum-Anbaumethode für Live-Cell-Imaging von Zygote-Polarisation und Embryo-Musterung in Arabidopsis thaliana. Diese Technik ermöglicht die Visualisierung lebender Dynamiken während der Embryogenese.

In-vitro- Ovulum Anbau für Live Cell Imaging der Zygote Polarisation und Embryo Musterung in Arabidopsis thaliana

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