Name: Chondrogene Pelletbildung aus Cord Blut-induzierten induzierten pluripotenten Stammzellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 10 s
Description: Lernen Sie die Chondrogenese von iPS-Zellen aus Nabelschnurblut für die Knorpelregeneration. Dieses Protokoll ermöglicht die Herstellung chondrogener Pellets für Krankheitsmodelle und Arzneimittelscreening.

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Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss aus dem Korea Healthcare Technology F &amp; E Projekt, Ministerium für Gesundheit, Wohlfahrt &amp; Familie, Republik Korea (HI16C2177) unterstützt.

Dieses Protokoll wurde vom institutionellen Überprüfungsausschuss der katholischen Universität von Korea (KC12TISI0861) genehmigt. CBMCs, die für die Umprogrammierung verwendet wurden, wurden direkt von der Cord Blood Bank des Seoul St. Mary&#39;s Hospital erhalten. 1. Chondrogene Differenzierung von iPSCs <ol><li> CBMC-iPSC Generation <ol><li> Generiere CBMC-hiPSCs mit dem in unserer vorherigen Arbeit gezeigten Protokoll 23 . </li><li> Sammle die Blutzellen in einem 15 ml konischen Röhrchen und zähle sie mit einem Hämocytometer. </li><li> 3 x 10 5 Zellen vorbereiten und 5 min bei 515 xg und RT zentrifugieren. Verwerfen Sie den Überstand durch Absaugen und resuspendieren die Zellen in 0,5 ml Blutzellmedium. </li><li> Übertragen Sie die Zellen auf eine Vertiefung einer nicht beschichteten 24-Well-Platte und fügen Sie die Sendai-Virus-Mischung hinzu, nach den Empfehlungen des Herstellers. </li><li> Zentrifugieren Sie die Platte für 30 min bei 1.150 xg und 30 ° C. </li><li> AchternEr zentrifugieren, die Zellen über Nacht (O / N) bei 37 ° C in 5% CO 2 inkubieren. </li><li> Am nächsten Tag übertragen Sie die transduzierten Zellen in eine Matrix-beschichtete Quelle. Zentrifugieren Sie die Platte bei 1.150 xg für 30 min bei 30 ° C. </li><li> Nach der Zentrifugation den Überstand entfernen, 1 ml iPSC-Medium zugeben und die Zellen O / N bei 37 ° C in 5% CO 2 aufbewahren. </li><li> Halten Sie die angehefteten Zellen bei 37 ° C und 5% CO 2 . Ändern Sie das Medium täglich und ersetzen Sie es mit frischem iPSC-Medium. ANMERKUNG: Kolonien erscheinen am Tag 14-21 nach der Transduktion. </li></ol></li><li> EB-Erzeugung <ol><li> Halten Sie die HIPSCs bei 37 ° C und 5% CO 2 . Ändern Sie das Medium täglich und ersetzen Sie es mit frischem Essential 8 (E8) Medium. </li><li> 2 x 10 6 hiPSCs in einer vitronectinbeschichteten, 100-mm-Schale in E8-Medium vorbereiten. </li><li> Das E8-Medium aus der Kulturschale nehmen und mit steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) waschen. </li><li> Hinzufügen 1Ml 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) gelöst und bei 37 ° C und 5% CO 2 für 2 min inkubiert. </li><li> Die Zellen mit 3 ml E8-Medium ernten und in ein neues 15-ml-Kegelrohr überführen. Die Zellen bei 250 xg bei Raumtemperatur (RT) für 2 min zentrifugieren. </li><li> Ansaugen des Überstandes, ohne das Zellpellet zu stören und die Zellen in 5 ml E8-Medium zu resuspendieren. </li><li> Zählen Sie die Zellen mit einem Hämocytometer und bereiten 2 x 10 6 Zellen für jede 100 mm Petrischale vor. Die vorbereiteten Zellen in einer 10-ml-Mischung aus E8- und EB-Medium (1: 1) mit 10 μM Rho-assoziiertem Kinase (ROCK) -Inhibitor resuspendieren. </li><li> Inkubieren der Zellen O / N für die Aggregation bei 37 ° C und 5% CO 2 . </li><li> Am nächsten Tag ernten Sie die aggregierten EBs durch Pipettieren. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 250 xg für 1 min. Den Überstand entfernen und die EBs in 10 ml frischem E8-Medium resuspendieren. </li><li> Vergrößere die erzeugten EBs für 5 Tage, tägliche Änderungen mit fresH E8 mittel. Zur weiteren Reifung wechseln Sie das Kulturmedium auf E7-Medium. Halten Sie die EBs bei 37 ° C und 5% CO 2 für weitere 5 Tage, wobei täglich mittlere Veränderungen mit frischem E7-Medium durchgeführt werden. HINWEIS: E7-Medium ist E8-Medium ohne FGF2. </li></ol></li><li> Auswuchszell-Induktion von EBs <ol><li> Füge 6 ml 1% ige Gelatine zu einer 100-mm-Schale hinzu und inkubiere bei 37 ° C und 5% CO 2 für 30 min. </li><li> Entfernen Sie die Gelatine und trocknen Sie die Schale für 2-3 Stunden vor Gebrauch. </li><li> Übertragen Sie die EBs auf ein 50-ml-Kegelrohr. Lassen Sie die EBs auf den Boden des konischen Rohres absetzen. Entfernen Sie den Überstand, ohne die EBs zu stören. </li><li> Die EBs in 10 ml Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM) mit 20% fötalem Rinderserum (FBS) resuspendieren. Übertragen Sie die EBs auf die Gelatine-beschichtete, 100-mm-Schale. 10 μM ROCK-Inhibitor hinzufügen. </li><li> Inkubieren und pflegen die Zellen bei 37 ° C und 5% CO 2 für 7 Tage. Ändere michDium jeden zweiten Tag ohne Zugabe von ROCK-Inhibitor. </li></ol></li><li> Chondrogene Pelletbildung <ol><li> Das Kulturmedium aus der Schale einatmen und die Zellen dreimal mit PBS waschen. </li><li> 1 ml 1 mM EDTA auftragen und bei 37 ° C und 5% CO 2 für 2 min inkubieren. </li><li> Die Zellen mit 5 ml DMEM mit 20% FBS ernten und in ein neues 15-ml-Kegelrohr überführen. </li><li> Die Zellen für 2 min bei 250 xg und RT zentrifugieren. Den Überstand verwerfen und das Pellet in 10 ml DMEM mit 20% FBS resuspendieren. </li><li> Filter und entsorgen Sie die Zellklumpen mit einem 40 μm Zellsieb und ernten Sie die einzelnen Zellen. Zähle die einzelnen Zellen mit einem Hämocytometer. </li><li> Die Zellen für 2 min bei 250 xg und RT zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand und säen Sie 3 x 10 5 Zellen pro Pellet in einem 15 ml konischen Röhrchen mit 300 μl chondrogenem Differenzierungsmedium (CDM). </li><li> Zur Pelletbildung zentrifugieren die Zellen für 5 min bei680 xg und RT. ANMERKUNG: Pellets werden in 15 ml konischen Rohren während der Differenzierung der chondrogenen Pellets gehalten. </li><li> Inkubieren der Zellen über Nacht bei 37 ° C und 5% CO 2 . </li><li> Ändern Sie das CDM alle 2-3 Tage. Innerhalb von 3 Tagen werden Pellets abgeflachte, sphäroidische Morphologien aufweisen. Halten Sie die Pellets für 21 Tage bei 37 ° C und 5% CO 2 . </li></ol></li></ol> 2. Chondrogene Pelletcharakterisierung durch Färbung <ol><li> Chondrogene Einbettung <ol><li> Vor dem Einbetten, Vorbereiten und Schmelzen von Paraffin bei 58 ° C. </li><li> Fixieren Sie die Pellets in 1 ml 4% Paraformaldehyd für 2 h bei RT in einem 1,5 ml-Röhrchen. Achtung: Paraformaldehyd ist hochgiftig. Vermeiden Sie Kontakt mit Augen, Haut oder Schleimhäuten. Minimieren Sie die Belichtung und vermeiden Sie das Einatmen bei der Vorbereitung. </li><li> Legen Sie eine Schicht Gaze auf die Kassette und übertragen Sie die festen Pellets mit einer Pipette. Decken Sie das Pellet durch FaltenE gauze und den Kassettendeckel schließen. </li><li> Die Dehydratation in 100 ml 70% igem Ethanol (EtOH) zweimal, jeweils 10 min, einleiten. Dehydrieren der Pellets durch aufeinanderfolgende 10-minütige Waschungen in 80% und 95% EtOH. </li><li> Übertragen Sie die Pellets auf 100% EtOH für 10 min. Wiederholen Sie dreimal mit frischem EtOH. </li><li> Zur &quot;Klärung&quot; wird die Lösung für eine 100 ml, 1: 1 Mischung aus EtOH und Xylol ausgetauscht, gefolgt von einem 1: 2-Gemisch aus EtOH und Xylol für jeweils 10 min. Das restliche EtOH durch zweimaliges Inkubieren der Pellets in 100% Xylol, jeweils 10 min, abkühlen lassen. </li><li> Zur Paraffininfiltration inkubieren die Pellets in aufeinanderfolgenden Xylol- und Paraffingemischen. Führen Sie den gesamten Paraffin-Infiltrationsprozess bei 58 ° C durch. Inkubieren Sie die Pellets in 100 ml einer 2: 1 Mischung aus Xylol und Paraffin für 30 min. </li><li> Austausch der Lösung für 100 ml einer 1: 1 Mischung aus Xylol und Paraffin und inkubieren für 30 min. </li><li> Austausch der Lösung für 100 ml einer 1: 2-Mischung aus Xylol und Paraffin und inkubieren für 30 min. </li><li> Für die endgültige Infiltration, übertragen Sie die Pellets auf das erste Bad von 100% Paraffin und inkubieren für 2 h. </li><li> Übertragen Sie die Pellets auf das zweite Bad von 100% Paraffin und inkubieren Sie O / N bei 58 ° C. </li><li> Am nächsten Tag transportiere man die Pellets sanft mit einer Pinzette in eine Form. Fügen Sie Paraffin der Form aus dem Paraffinspender hinzu. Das Paraffin für 30 min bei 4 ° C festigen. </li><li> Die Abschnitte auf 7 μm schneiden und die Abschnitte auf die Folie überführen. Lassen Sie die Objektträger über Nacht trocknen und lagern Sie die Folien auf RT, bis sie gebrauchsfertig sind. </li></ol></li><li> Folienvorbereitung <ol><li> Deparaffinieren Sie die Objektträger, indem Sie sie durch 100 ml von 100%, 90%, 80% und 70% EtOH nacheinander für jeweils 5 min bewegen. </li><li> Legen Sie die Objektträger in ein Glasgefäß und spülen Sie mit Leitungswasser für 5 min. </li></ol></li><li> Alcian blaue Färbung <ol><li> Inkubieren Sie die Objektträger in 50 ml einer 1% alcianblauen Lösung für 30 min. NICHTE: Alcianblau wird in 3% iger Essigsäurelösung verdünnt. Den pH-Wert mit Acetinsäure auf 2,5 einstellen. </li><li> Legen Sie die Objektträger in ein Glasglas und spülen Sie mit Leitungswasser für 2 min. </li><li> Spülen Sie die Folien in deionisiertem Wasser (DW) und Gegenfärbung mit nuklearer schneller roter Lösung für 2 min. </li><li> Legen Sie die Objektträger in ein Glasgefäß und spülen Sie mit Leitungswasser für 1 min. </li><li> 2.3.5) Um die Folien in Schritt 2.6 zu dehydrieren und zu montieren, </li></ol></li><li> Toluidin-Blau-Färbung <ol><li> Inkubieren von Objektträgern in 50 ml Toluidinblau-Lösung für 4 min. </li><li> Legen Sie die Objektträger in ein Glasgefäß und spülen Sie mit Leitungswasser für 5 min. </li><li> Fahren Sie mit der Entwässerung und Montage der Folien in Schritt 2.6 fort. </li></ol></li><li> Immunhistochemische Färbung <ol><li> Inkubieren Sie die Objektträger in 3% H 2 O 2 für 15 min für endogene Peroxidase-Blockierung. </li><li> Tragen Sie 200 μl Primärantikörper (anti-COL1A1 und -COL2A1), verdünnt 1: 100 in Tris-bu(TBS), enthaltend 1% Rinderserumalbumin (BSA) und 5% normales Ziegenserum (NGS) zu den Objektträgern und inkubieren O / N bei 4 ° C. </li><li> Am nächsten Tag legen Sie die Objektträger in ein Glasgefäß und waschen sie mit 50 ml TBS, die 0,1% Polysorbat 20 (TBST) dreimal für jeweils 5 min enthält. </li><li> Tragen Sie 200 μl Sekundärantikörper (Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG-Antikörper, verdünnt 1: 200 in TBS mit 1% BSA und 5% NGS) auf die Objektträger und inkubieren bei RT für 40 min. </li><li> Legen Sie die Objektträger in ein Glasgefäß und waschen Sie sie dreimal mit 50 ml, jeweils 5 min. </li><li> Zur Signalverstärkung die HRP-konjugierte Streptavidin-Lösung auf die Objektträger auftragen und 10 min inkubieren. </li><li> Legen Sie die Objektträger in ein Glasgefäß und waschen Sie sie dreimal mit 50 ml, jeweils 5 min. </li><li> Die DAB-Peroxidase-Substratlösung mischen, 200 μl Lösung auf jede Folie auftragen und 1 min inkubieren. </li><li> Legen Sie die Objektträger in ein Glasgefäß und spülen Sie mit Leitungswasser für 5 min. </li><li> GegenschlagMit Mayers Hämatoxylin für 1 min. </li><li> Waschen Sie die Folien mit DW. </li><li> Fahren Sie mit der Entwässerung und Montage der Folien in Schritt 2.6 fort. </li></ol></li><li> Dehydrierung und Montage <ol><li> Dehydrieren Sie die Objektträger, indem Sie sie nacheinander durch 100 ml 70%, 80%, 90% und 100% EtOH, jeweils 30 s, bewegen. </li><li> Tauchen Sie die Folien in zwei Änderungen von Xylol für jeweils 1 min. </li><li> Fügen Sie 50 μl Montagelösung zu den Deckgläsern hinzu und legen Sie die Folien auf die Oberseite. </li></ol></li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Dieses Protokoll hat erfolgreich HIPSCs von CBMCs generiert. Wir programmierten CBMCs zu hiPSCs unter Verwendung eines Sendai Virusvektors, der Yamanaka Faktoren enthält 24 . Drei Fälle wurden in der Differenzierung verwendet, und alle Experimente erzeugten erfolgreich chondrogene Pellets unter Verwendung dieses Protokolls. Zahlreiche Studien haben Protokolle für die Differenzierung von hiPSCs in Chondrozyten 25 , 26 , <sup cla...

Die Verwendung von hiPSCs stellt eine neue Strategie für Arzneimittel-Screening und mechanistische Studien verschiedener Krankheiten dar. Aus einer regenerativen Perspektive sind hiPSCs auch eine potentielle Quelle für den Ersatz von beschädigten Geweben, die eine begrenzte Heilfähigkeit aufweisen, wie z.B. Gelenkknorpel 1 , 2 . Die Regeneration des nativen Knorpelknorpels ist seit Jahrzehnten eine Herausforderung. Gelenkknorpel ist ein weiches, weißes Gewebe, das das Ende der Knochen beschichtet und sie vor Reibung schützt. Allerdings hat es begrenzte regenerative Fähigkeit, wenn beschädigt, die Selbst-Reparatur fast unmöglich macht. Daher ist die Forschung über die Knorpelregeneration seit mehreren Jahrzehnten im Gange. Bisher wurde in vitro die Differenzierung in die chondrogene Linie üblicherweise mit BMSCs oder nativen Chondrozyten durchgeführt, die aus dem Kniegelenk isoliert wurden 3 . Fällig tO ihr chondrogenes Potenzial, BMSCs und native Chondrozyten haben zahlreiche Verdienste, die ihre Verwendung in der Chondrogenese unterstützen. Wegen ihrer begrenzten Ausdehnung und ihres instabilen Phänotyps stehen diese Zellen jedoch vor einer Einschränkung bei der Rekonstruktion von Gelenkknorpeldefekten. Unter in vitro- Kulturbedingungen neigen diese Zellen dazu, ihre eigenen Eigenschaften nach 3-4 Passagen zu verlieren, was schließlich ihre Differenzierungsfähigkeit beeinflusst 4 . Auch bei nativen Chondrozyten ist bei der Gewinnung dieser Zellen eine zusätzliche Schädigung des Kniegelenks unvermeidlich. Im Gegensatz zu BMSCs oder nativen Chondrozyten können sich hiPSCs in vitro unendlich erweitern. Mit den richtigen Kulturbedingungen haben hiPSCs ein großes Potenzial als Ersatzquelle für die chondrogene Differenzierung. Allerdings ist es schwierig, die intrinsischen Eigenschaften von hiPSCs 5 zu ändern. Darüber hinaus dauert es mehrere komplizierte in vitro stePs, um das Schicksal von hiPSCs auf einen bestimmten Zelltyp zu lenken. Trotz dieser Komplikationen wird die Verwendung von hiPSCs aufgrund ihrer hohen Selbsterneuerungsfähigkeiten und ihrer Fähigkeit, in zielgerichtete Zellen, einschließlich Chondrozyten, zu differenzieren, noch empfohlen. Die chondrogene Differenzierung erfolgt üblicherweise mit dreidimensionalen Kultursystemen wie der Pelletkultur oder der Mikromassenkultur unter Verwendung von MSC-ähnlichen Progenitorzellen. Bei der Verwendung von hiPSCs unterscheidet sich das Protokoll zur Erstellung von MSC-ähnlichen Progenitorzellen von den vorhandenen Protokollen. Einige Gruppen verwenden eine Monolayer-Kultur von hiPSCs, um den Phänotyp direkt in MSC-ähnliche Zellen umzuwandeln 7 . Allerdings verwenden die meisten Studien EBs, um Auswuchszellen zu erzeugen, die den MSCs 8 , 9 , 10 , 11 ähneln. Verschiedene Arten von Wachstumsfaktoren werden verwendet, um Chondroge zu induzierenNesis Normalerweise werden BMP- und TGF &amp; bgr; -Familie-Proteine ​​allein oder in Kombination verwendet. Die Differenzierung wurde auch mit anderen Faktoren wie GDF5, FGF2 und IGF1 12 , 13 , 14 , 15 induziert. Es wurde gezeigt, dass TGFβ1 die Chondrogenese dosisabhängig in MSCs 16 stimuliert. Im Vergleich zum anderen Isotyp induziert TGF &amp; bgr; 3, TGF &amp; bgr; 1 die Chondrogenese durch Erhöhung der Mortochymal-Zellkondensation vor dem Knorpel. TGF &amp; bgr; 3 induziert die Chondrogenese durch signifikante Erhöhung der mesenchymalen Zellproliferation 17 . Allerdings wird TGFβ3 häufiger von Forschern als TGFβ1 7 , 10 , 18 , 19 verwendet. BMP2 verstärkt die Expression von Genen, die mit den chondrogenen Matrixkomponenten im Menschen zusammenhängenArtikuläre Chondrozyten unter in vitro Bedingungen 20 . BMP2 erhöht die Expression von Genen, die für die Knorpelbildung in MSCs in Kombination mit TGFβ-Proteinen kritisch sind. Es wurde auch gezeigt, dass BMP2 die Wirkung von TGF &amp; bgr; 3 durch die Smad- und MAPK-Wege 22 synergistisch verstärkt. In dieser Studie wurden CBMC-hiPSCs in EBs unter Verwendung von EB-Medium in einer Petrischale mit geringer Anlagerung aggregiert. Auswuchszellen wurden durch Anbringen der EBs an eine mit Gelatine beschichtete Schale induziert. Die chondrogene Differenzierung unter Verwendung von Auswuchszellen wurde durch Pelletkultur durchgeführt. Die Behandlung mit sowohl BMP2 als auch TGFβ3 kondensierte erfolgreich die Zellen und induzierte extrazelluläre Matrix (ECM) Protein-Akkumulation für die chondrogene Pelletbildung. Diese Studie schlägt ein einfaches, aber effizientes chondrogenes Differenzierungsprotokoll unter Verwendung von CBMC-hiPSCs vor.

<table><tbody><tr><td>Plasticware</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 mm Schale</td><td>TPP</td><td>93100</td><td></td></tr><tr><td>6-Well-Platte</td><td>TPP</td><td>92006</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Cornical Tube</td><td>SPL</td><td>50050</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Cornical Tube</td><td>SPL</td><td>50015</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Einwegpipette</td><td>Falcon</td><td>7551</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Einwegpipette</td><td>Falcon</td><td>7543</td><td></td></tr><tr><td>12-Well-Platte</td><td>TPP</td><td>92012</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalognummer</td><td>Beschreibung</td></tr><tr><td>E8 Medium Materialien</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12, HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>11330-057</td><td>E8 Medium (500 mL)</td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat</td><td>Life Technologies</td><td>25080-094</td><td>E8 Medium (Konz.: 543 &mu; g/mL)</td></tr><tr><td>Natriumselenit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5261</td><td>E8 Medium&nbsp; (Konz.: 14 ng/mL)</td></tr><tr><td>Humanes Transfferin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T3705</td><td>E8 Medium (Konz.: 10.7 &mu; g/mL)</td></tr><tr><td>Basic FGF2</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>E8 Medium&nbsp; (Konz.: 100 ng/mL)</td></tr><tr><td>Human Insulin</td><td>Life Technologies</td><td>12585-014</td><td>E8 Medium (Conc.: 20 &mu; g/mL)</td></tr><tr><td>Menschliches TGF&beta; 1</td><td>Peprotech</td><td>100-21</td><td>E8 Medium (Konzentration: 2 ng/ml)</td></tr><tr><td>Ascorbinsäure</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8960</td><td>E8 Medium (Konz.: 64 &mu; g/mL)</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Vitronectin</td><td>Life Technologies</td><td>A14700</td><td></td></tr><tr><td>ROCK Inhibitor</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Y0503</td><td></td></tr><tr><td>Name<</td><td>strong>Company<</td><td>strong>Katalognummer</td><td>Beschreibung</td></tr><tr><td>Quality Control Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>18 mm Deckglas</td><td>Superior</td><td>HSU-0111580</td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformaldyhyde</td><td>Tech & Innovation</td><td>BPP-9004</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>BIOSESANG</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserum Albumin</td><td>Vector Lab</td><td>SP-5050</td><td></td></tr><tr><td>Anti-SSEA4 Antikörper</td><td>Millipore</td><td>MAB4304</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Oct4 Antikörper</td><td>Santa Cruz</td><td>SC9081</td><td></td></tr><tr><td>Anti-TRA-1-60 Antikörper</td><td>Millipore</td><td>MAB4360</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Sox2 Antikörper</td><td>Biolegend</td><td>630801</td><td></td></tr><tr><td>Anti-TRA-1-81 Antikörper</td><td>Millipore</td><td>MAB4381</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Klf4 Antikörper</td><td>Abcam</td><td>ab151733</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Ziege Anti-Maus IgG (H+L) Antikörper</td><td>Molekulare Sonde</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Ziege Anti-Kaninchen IgG (H+L) Antikörper</td><td>Molekulare Sonde</td><td>A11037</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Molecular Probe</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold Antifading-Reagenz</td><td>Invitrogen</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformaldyhyde</td><td>Tech & Innovation</td><td>BPP-9004</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>BIOSESANG</td><td>T1027</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserum Albumin</td><td>Vector Lab</td><td>SP-5050</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Kollagen II Antikörper</td><td>abcam&nbsp;</td><td>ab34712</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Alcian blue</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3157-10G</td><td></td></tr><tr><td>Fast Green</td><td>FCF Sigma Aldrich</td><td>F7252-25G</td><td></td></tr><tr><td>Safranin O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>090m0039v</td><td></td></tr><tr><td>Nuclear fast red</td><td>Americanmastertech</td><td>STNFR100&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Xylol</td><td>Duksan</td><td>115&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Duksan</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Mayer's Hämatoxylin-Lösung</td><td>wako pure chemical industries</td><td>LAK7534</td><td></td></tr><tr><td>DAP</td><td>VECTOR LABORATORIES</td><td>SK-4100</td><td></td></tr><tr><td>Objektträgerglas, beschichtet</td><td>Hyun il Lab-Mate</td><td>HMA-S9914</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596-018</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma Aldrich</td><td>366919</td><td></td></tr><tr><td>Isoprypylalkohol</td><td>Millipore</td><td>109634</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Duksan</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>RevertAid Erststrang-cDNA-Synthesekit</td><td>Thermo Scientfic</td><td>K1622</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalognummer</td><td> Beschreibung</td></tr><tr><td>Chondrogene Differenzierungsmaterialien</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11885</td><td>Chondroggene Medienkomponente (500 mL)</td></tr><tr><td>Penicilin Streptomycin</td><td>Life Technologies</td><td>P4333</td><td>Chondroggene Medienkomponente (Konz.: 1%)</td></tr><tr><td>Ascorbinsäure</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8960</td><td>Chondroggene Medienkomponente (Konz.: 64 &mu; g/mL)&nbsp;</td></tr><tr><td>MEM Lösung für nicht-essentielle Aminosäuren (100x)</td><td>Life Technologies</td><td>11140-050</td><td>Chondroggene Medienkomponente (Konz.: 100 mM)</td></tr><tr><td>rhBMP-2</td><td>R& D</td><td>355-BM-050</td><td>Chondroggene Medienkomponente (Konzentration:100 ng/ml)</td></tr><tr><td>Rekombinante Hman TGF-beta3</td><td>R& D</td><td>243-B3-002</td><td>Chondroggene Medienkomponente (Konzentration: 10 ng/ml)</td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement Life</td><td>Technologies</td><td>10828-028</td><td>Chondrogene Medienkomponente (Konzentration: 1%)</td></tr><tr><td>ITS+ Premix</td><td>BD</td><td>354352</td><td>Chondrogene Medienkomponente (Konzentration: 1%)</td></tr><tr><td>Dexamethason-Wasserlöslich</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2915-100MG</td><td>Chondroggene Medienkomponente (Conc.:10-7 M)</td></tr><tr><td>GlutaMAX Supplement</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td>Chondroggene Medienkomponente (Conc.: 1%)</td></tr><tr><td>Natriumpyruvatlösung</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S8636</td><td>Chondroggene Medienkomponente (Conc.: 1%)</td></tr><tr><td>L-Prolin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5607-25G</td><td>Chondrogene Medien Komponente (40 &mu; g/ml)</td></tr></tbody></table>

chondrogene pelletbildung aus cord blut-induzierten induzierten pluripotenten stammzellen

Chondrogenic Pellet Formation from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Der menschliche Knorpelknorpel fehlt die Fähigkeit, sich selbst zu reparieren. Knorpeldegeneration wird also nicht durch kurative, sondern durch konservative Behandlungen behandelt. Derzeit werden Anstrengungen unternommen, um beschädigten Knorpel mit ex vivo expandierten Chondrozyten oder Knochenmark-abgeleiteten mesenchymalen Stammzellen (BMSCs) zu regenerieren. Die eingeschränkte Lebensfähigkeit und Instabilität dieser Zellen begrenzen jedoch ihre Anwendung bei der Knorpelrekonstruktion. Menschliche induzierte pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) haben wissenschaftliche Aufmerksamkeit als neue Alternative für regenerative Anwendungen erhalten. Mit unbegrenzter Selbsterneuerungsfähigkeit und Multipotenz wurden hiPSCs als neue Ersatzzellenquelle für die Knorpelreparatur hervorgehoben. Allerdings ist die Erlangung einer hohen Menge an hochwertigen chondrogenen Pellets eine große Herausforderung für ihre klinische Anwendung. In dieser Studie verwendeten wir Embryoidkörper (EB) -geleitete Auswuchszellen für die chondrogene Differenzierung. Die erfolgreiche Chondrogenese wurde durch PCR undD-Färbung mit alcianblauem, Toluidinblau und Antikörpern gegen Kollagenarten I und II (COL1A1 bzw. COL2A1). Wir bieten eine detaillierte Methode zur Differenzierung von Nervenblutmononukleären Zellen-abgeleiteten iPSCs (CBMC-hiPSCs) in chondrogene Pellets.

In dieser Studie erzeugten wir chondrogene Pellets aus CBMC-hiPSCs, indem sie Auswuchszellen aus EBs induzierten. Die chondrogene Differenzierung wurde mit CBMC-hiPSCs mit bestätigter hoher Pluripotenz induziert 11 . Ein einfaches Schema unseres Protokolls ist in Fig. 1A gezeigt . Vor der Differenzierung wurden iPSC-Kolonien erweitert (Abbildung 1B ). Die erweiterten iPSCs wurden als EBs zusammengesetzt, ...

Hier schlagen wir ein Protokoll für die chondrogene Differenzierung von Nervenblut mononuklearen Zell-abgeleiteten menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen vor.

Chondrogene Pelletbildung aus Cord Blut-induzierten induzierten pluripotenten Stammzellen

Human articular cartilage lacks the ability to repair itself. Cartilage degeneration is thus treated not by curative but by conservative treatments. ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, chondrogene Pellets aus induzierten pluripotenten Stammzellen aus Nabelschnurblut herzustellen. Mit diesem Protokoll können wir eine vergleichsweise große Menge chondrogener Pellets erzeugen. Die hergestellten chondrogenen Pellets können für Studien oder Krankheitsmodellierungen, Wirkstoffscreenings und die translationale Forschung verwendet werden, um unser Verständnis der Natur des Knorpelgewebes zu vertiefen.Der menschliche Knorpel wies im vergangenen Jahr eine verzögerte Reparatur auf. Daher muss die Knorpeldegeneration durch eine konservative Behandlung therapiert werden. Aufgrund ihrer unbegrenzten Selbsterneuerungsfähigkeit und Multipotenz wurden humane iPSCs als neue Ersatzzellquelle für die Knorpelreparatur hervorgehoben.Den Ablauf demonstrieren Eugene Nam und Arie Alice Ream, Doktoranden aus meinem Labor. Beginnen Sie das Protokoll, indem Sie Blutzellen in einem kegelförmigen 15-Milliliter-Röhrchen sammeln und mit einem Hämozytometer zählen. Bereiten Sie dreimal 10 hoch 5 Zellen vor und zentrifugieren Sie diese fünf Minuten lang bei 515 × g bei Raumtemperatur.Entfernen Sie den Überstand durch Absaugen und resuspendieren Sie die Zellen in 0,5 Milliliter Blutzellmedium. Überführen Sie anschließend die Zellen in eine Vertiefung einer nicht beschichteten 24-Loch-Platte, und geben Sie die Sendai-Virus-Mischung gemäß den Empfehlungen des Herstellers hinzu. Zentrifugieren Sie die Platte 30 Minuten bei 1.150 × g und 30 °C.Nach der Zentrifugation die Zellen über Nacht inkubieren. Am nächsten Tag die Transudat-Zellen in eine mit Matrix codierte Vertiefung überführen. Die Platte zentrifugieren.Nach der Zentrifugation wird der Überstand entfernt, ein Milliliter iPSC-Medium zugegeben und die Zellen kultiviert. Das Medium wird täglich gewechselt und durch frisches iPSC-Medium ersetzt. Die humanen induzierten pluripotenten Stammzellen, oder HIPSCs, werden so kultiviert.Wechseln Sie das Medium täglich und ersetzen Sie es durch frisches Essential Eight oder E8-Medium. Bereiten Sie zwei Mal 10 hoch 6 HIPSCs in einem mit Vitronectin beschichteten 100-Milliliter-Gefäß mit E8-Medium vor. Entfernen Sie danach das E8-Medium aus der Kulturschale und waschen Sie die Zellen mit steriler, phosphatgepufferter Kochsalzlösung oder PBS. Fügen Sie ein Milliliter einer millimolaren EDTA-Lösung hinzu und inkubieren Sie die Petrischale zwei Minuten lang. Danach gewinnen Sie die Zellen mit drei Milliliter E8-Medium und überführen sie in ein neues kegelförmiges 15-Milliliter-Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Zellen bei Raumtemperatur mit 250 × g für zwei Minuten.Den Überstand abpipettieren, ohne das Zellpallet zu stören, und die Zellen in fünf Milliliter E8-Medium resuspendieren. Nach der Bestimmung der Zellanzahl mit einem Hämozytometer zwei mal 10 hoch 6 Zellen für jede 100-Millimeter-Petri-Schale vorbereiten. Die vorbereiteten Zellen in 10 Milliliter einer 1:1-Mischung aus E8- und EB-Medium mit 10 Mikromolar ROCK-Inhibitor (row associated kinase inhibitor) resuspendieren.Die Zellen über Nacht zur Aggregation inkubieren. Am folgenden Tag die aggregierten EBs durch Pipettieren gewinnen. Den Überstand entfernen und die EBs in 10 Milliliter frischem E8-Medium resuspendieren.Vergrößern Sie die erzeugten EBs fünf Tage lang, wobei täglich ein Mediumwechsel mit frischem E8-Medium durchgeführt wird. Für eine weitere Reifung wechseln Sie das Kulturmedium auf E7-Medium. Kultivieren Sie die EBs weitere fünf Tage bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid, wobei täglich ein Mediumwechsel mit frischem E7-Medium erfolgt.Geben Sie sechs Milliliter 1 % Gelatine in eine 100 Millimeter große Petrischale und inkubieren Sie die Schale 30 Minuten lang. Entfernen Sie die Gelatine und trocknen Sie die Schale vor der Verwendung zwei bis drei Stunden vollständig aus. Überführen Sie die EBs in ein 50-Milliliter-Konischglas.Lassen Sie die EBs auf den Boden des kegelförmigen Reagenzglases absinken. Entfernen Sie die Überstände, ohne die EBs zu stören. Anschließend resuspendieren Sie die EBs in 10 Milliliter vorgewärmtem Shilbecco's modifiziertem Equals Medium oder DMEM mit 20 % fetalem Bulking-Serum oder FBS.Überführen Sie die EBs in die Gelatine-beschichtete 100-Millimeter-Schale. Geben Sie 10 µM Rock-Inhibitor hinzu. Inkubieren und kultivieren Sie die Zellen sieben Tage lang.Wechseln Sie das Medium jeden zweiten Tag, ohne den Rock-Inhibitor hinzuzufügen. Aspirieren Sie das Kulturmedium aus der Schale. Geben Sie sofort ein Milliliter eines millimolaren EDTA auf die Schale und inkubieren Sie die Zellen zwei Minuten lang.Anschließend die Zellen mit fünf Milliliter DMEM mit 20 % FBS gewinnen und in ein neues 15-Milliliter-Konischgefäß überführen. Die Zellen zwei Minuten bei 250 × g bei Raumtemperatur zentrifugieren. Den Überstand verwerfen und das Pellet in 10 Milliliter DMEM mit 20 % FBS resuspendieren.Filtern und verwerfen Sie die Zellklumpen mithilfe eines 40-Mikrometer-Zellsiebs und gewinnen Sie die Einzelzellen. Zählen Sie die Einzelzellen mit einem Hämozytometer. Zentrifugieren Sie die Zellen.Entfernen Sie den Überstand und säen Sie jeweils drei mal 10 hoch 5 Zellen pro Pellet in einem 15-Milliliter-Konischgefäß mit 300 Mikroliter chondrogener Differenzierungsmedium oder CDM aus. Zentrifugieren Sie die Zellen zur Pelletbildung und inkubieren Sie sie über Nacht. Innerhalb von drei Tagen zeigen die Pellets eine abgeflachte sphäroidale Morphologie.Die Pellets 21 Tage lang aufbewahren. Vor dem Einbetten Paraffin bei 58 Grad Celsius vorbereiten und schmelzen. Die Pellets in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen für zwei Stunden bei Raumtemperatur in einem Milliliter 4 % Paraformaldehyd fixieren.Legen Sie eine Schicht Gaze in die Kassette und übertragen Sie die fixierten Pellets mit einer Pipette. Bedecken Sie das Pellet, indem Sie die Gaze umfalten und den Kassettendeckel schließen. Beginnen Sie die Dehydrierung in 100 Milliliter 70%igem Ethanol.Trocknen Sie die Pellets durch sukzessive abschließende Waschungen in 80 % und 95 % Ethanol. Überführen Sie die Pellets in 100 % Ethanol für 10 Minuten. Zum Klären tauschen Sie die Lösung gegen eine 100-Milliliter-Mischung aus Ethanol und Xylol im Verhältnis 1:1 für 10 Minuten aus. Anschließend wird die eins zu eins-Lösung durch ein Gemisch aus Ethanol und Xylol im Verhältnis eins zu zwei für 10 Minuten ersetzt. Das verbleibende Ethanol wird entfernt, indem die Pellets in 100 % Xylol inkubiert werden. Zur Paraffin-Durchtränkung werden die Pellets in aufeinanderfolgenden Gemischen aus Xylol und Paraffin inkubiert.Führen Sie den gesamten Paraffineintragungsprozess bei 58 Grad Celsius durch. Inkubieren Sie die Pellets in 100 Milliliter einer zwei zu eins-Mischung aus Xylol und Paraffin für 30 Minuten. Danach tauschen Sie die Lösung gegen 100 Milliliter einer eins zu eins-Mischung aus Xylol und Paraffin aus und inkubieren erneut für 30 Minuten.Danach die Lösung durch 100 Milliliter einer ein- zu zweiteiligen Mischung aus Xylol und Paraffin ersetzen und 30 Minuten lang inkubieren. Für die endgültige Infiltration die Pellets in das erste Bad mit 100 % Paraffin überführen und das Pellet zwei Stunden lang inkubieren. Die Pellets in das zweite Bad mit 100 % Paraffin überführen und über Nacht bei 58 Grad Celsius inkubieren.Am nächsten Tag die Pellets vorsichtig mit einer Pinzette auf eine Form übertragen. Paraffin aus dem Paraffinspender zur Form hinzufügen. Das Paraffin 30 Minuten bei vier Grad Celsius verfestigen lassen.Schneiden Sie die Schnitte auf sieben Mikrometer und überführen Sie die Schnitte auf den Objektträger. Lassen Sie die Objektträger über Nacht trocknen und lagern Sie sie bei Raumtemperatur, bis sie zur Verwendung bereit sind. Vor der Differenzierung wurden iPSC-Kolonien erweitert.Die expandierten iPSCs wurden als EBs zusammengefasst, um die Differenzierung einzuleiten. Die erzeugten EBs wurden auf mit Gelatine beschichteten Schalen angeheftet, um auswachsende Zellen zu induzieren. Nach 21 Tagen der Differenzierung wurden kleine, perlenförmige chondrogene Aggregate erhalten und für weitere Charakterisierungen verwendet.Die Qualität der chondrogenen Pellets wurde am Tag 21 histologisch bewertet, wobei BMSC-chondrogene Pellets als positiver Kontrollansatz dienten. Die Anreicherung von ECM-Proteinen, die von den differenzierten Chondrozyten sezerniert wurden, wurde mittels Alcian-Blau- und Toluidinblau-Färbung nachgewiesen. Chondrogene Pellets, die aus CDMC-iPS-Zellen generiert wurden, wiesen einen höheren COL2A1-Ausdruck auf als Pellets, die aus CBMSC-iPS-Zellen abgeleitet waren.Die Expression von Kollagen Typ I, einem Marker für fibrotisches Knorpelgewebe, war in CBMC HIPSC-abgeleiteten Pellets niedriger im Vergleich zur Expression von COL2A1. Die Genexpression von knorpelspezifischen extrazellulären Matrixproteinen in chondrogenen Pellets am Tag 21 wurde mittels Echtzeit-PCR bestätigt. Die Aggrecan-Expression von CBMC HIPSC-abgeleiteten Pellets war vergleichbar mit der von BMSC-abgeleiteten Pellets.Wir haben eine detaillierte Methode zur Differenzierung von aus Nabelschnurblut-Monozyten gewonnenen iPSCs in chondrogene Pellets beschrieben. Wenn man die Technik einmal beherrscht, kann sie bei korrekter Durchführung innerhalb von zwei Monaten durchgeführt werden. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man chondrogene Pellets aus iPSCs erzeugt.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Mechanischer Stress kann die chondrogene Differenzierung von Stammzellen induzieren und bietet damit einen potentiellen therapeutischen Ansatz für die Reparatur von gestörtem Knorpel. Wir stellen ein Protokoll vor, um die chondrogene Differenzierung von aus Fett gewonnenen Stammzellen (ASCs) mit Hilfe der Zentrifugalgravitation (CG) zu induzieren. Die CG-induzierte Hochregulierung von SOX9 führt zur Entwicklung chondrogener Phänotypen.

Chondrogene Differenzierung Induktion von Fettgewebe gewonnene Stammzellen durch Zentrifugalkraft Gravity

Chondrogenese aus Stammzellen erfordert Feinabstimmung der Kulturbedingungen. Hier präsentieren wir einen magnetischen Ansatz für Zellen Kondensation, ein wesentlicher Schritt Chondrogenese zu initiieren. Darüber hinaus zeigen wir, dass dynamische Reifung in einem Bioreaktor mechanische Stimulation auf die Zellkonstrukte und verbessert knorpelige extrazelluläre Matrixproduktion gilt.

3D Magnetic Stem Cell Aggregation und Bioreactor Ausreifung für Knorpelregeneration

Hier stellen wir ein Protokoll für die Präparation der menschlichen Nabelschnur (UC) und fetaler placenta Probe in Kord Belages (CL), Wharton-Sulze (WJ), Cord-Plazenta-Übergang (CPJ) und fetale Plazenta (FP) für die Isolierung und Charakterisierung von mesenchymalen Stromazellen (MSCs), um die Explantation Kultur-Technik.

Isolierung und Charakterisierung von mesenchymalen Stromazellen aus Nabelschnur und Fetal Placenta

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Unterscheidung von Chondrozyten aus periphere Blut-abgeleiteten menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen

Wir schlagen eine Protokoll, die zeigt, wie man differenzieren induzierten pluripotenten Stammzellen abgeleitet Keratinozyten und Fibroblasten und generieren eine organoide 3D Haut mit diesen Keratinozyten und Fibroblasten. Dieses Protokoll enthält einen zusätzlichen Schritt einem humanisierten Mäuse-Modell zu erzeugen. Die hier vorgestellten Technik verbessert die dermatologische Forschung.

Generation von 3D Haut organoide aus Cord Blood-abgeleitete induzierte pluripotente Stammzellen

Die Knochentherapie über endochondrale Ossifikation durch Implantation von künstlichem Knorpelgewebe aus mesenchymalen Stammzellen hat das Potenzial, die Nachteile konventioneller Therapien zu umgehen. Hyaluronsäure-Hydrogele sind wirksam bei der Skalierung gleichmäßig differenzierter Knorpeltransplantate sowie bei der Schaffung von integriertem Knochen mit Vaskularisierung zwischen fusionierten Transplantaten in vivo.

Integrierte Knochenbildung durch in vivo ennochondrale Ossifikation mit mesenchymalen Stammzellen

Dieses Protokoll beschreibt und vergleicht zwei repräsentative Methoden zur Differenzierung von hiPSCs in mesenchymale Stromazellen (MSCs). Die Monolayer-Methode zeichnet sich durch geringere Kosten, einfachere Bedienung und leichtere osteogene Differenzierung aus. Die Methode der Embryoidkörper (EBs) zeichnet sich durch einen geringeren Zeitaufwand aus.

Vergleich zweier repräsentativer Methoden zur Differenzierung humaner induzierter pluripotenter Stammzellen in mesenchymale Stromazellen

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung von Chondrozyten, Fibronektin-Adhäsionsassay-abgeleiteten Chondroprogenitoren (FAA-CPs) und migratorischen Chondroprogenitoren (MCPs) aus menschlichem Gelenkknorpel. Es umfasst enzymatischen Verdau, Fibronektin-Adhäsion und migrationsbasierte Assays zur Isolierung und Charakterisierung dieser Zellen.

Isolierung von Chondrozyten und Chondroprogenitoren mittels Fibronektin-Adhäsions- und Migrationsassay

Diese Studie beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von chondrozytären Sphäroiden, indem Zellen unter Verwendung der Schwerkraft unter Bedingungen mit geringer Adhäsion zu Sphäroiden aggregiert werden, gefolgt von der Kultivierung der resultierenden Sphäroide in Mini-Bioreaktoren.

Erzeugung von Sphäroiden aus verschiedenen Chondrozyten unter Verwendung von niedrigadhäsiven Bedingungen unter Schwerkraft und selbstgemachten Mini-Bioreaktoren

Dendritischen Dornen von Pyramidenneuronen sind die Websites der meisten Synapsen im Gehirn von Säugetieren Kortex. Diese Methode beschreibt ein 3D-quantitative Analyse der Wirbelsäule Morphologien in der menschlichen kortikalen Pyramiden glutamatergen Neuronen aus induzierten pluripotenten Stammzellen abgeleitet.

Dreidimensionale Quantifizierung der dendritischen Dornen von Pyramidenzellen aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen

Lernen Sie die Chondrogenese von iPS-Zellen aus Nabelschnurblut für die Knorpelregeneration. Dieses Protokoll ermöglicht die Herstellung chondrogener Pellets für Krankheitsmodelle und Arzneimittelscreening.

Chondrogene Pelletbildung aus Cord Blut-induzierten induzierten pluripotenten Stammzellen

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