Quantitative Lokalisierung eines Golgi-Proteins von Imaging Center der Fluoreszenz Masse

Das übergeordnete Ziel dieser bildgebenden Methode ist es, ein Golgi-Protein quantitativ mit Nanometer-Auflösung zu lokalisieren. Diese Methode kann helfen, die wichtigsten Fragen bei der Untersuchung des Golgi-Apparats zu beantworten, wie etwa die Organisation des Golgi und dessen Funktionsweise. Der Hauptvorteil dieser Methode besteht darin, dass sie ein herkömmliches Lichtmikroskop und Softwarewerkzeuge verwendet.

Zu Beginn kultivieren Sie HeLa-Zellen in einem T25-Kolben in DMEM, ergänzt mit 10 % FBS, und inkubieren Sie die Kultur bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Wenn die Zellen etwa 80 % Konfluenz erreichen, aspirieren Sie das Kulturmedium und geben Sie einen Milliliter 25 % Trypsin EDTA in die Flasche. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius für zwei Minuten.

Entferne die Zellen aus dem Inkubator und gib einen Milliliter vollständigen Mediums hinzu, um die Zellen vorsichtig von der Wand des Kolbens zu spülen. Übertragen Sie die abgetrennten Zellen in ein steriles Zentrifugationsrohr und drehen Sie das Rohr bei 500 g für zwei Minuten, um die Zellen zu pelletieren. Nach dem Aspirieren des Supernatanten verwenden Sie einen Milliliter vollständiges Medium, um das Zellpellet zu suspendieren.

Entfernen Sie das Medium aus dem Brunnen einer 24-Bohrloch-Platte, die eine sterilisierte Glasabdeckung enthält, und streuen Sie etwa 100.000 Zellen in den Brunnen. Verwende Complete Medium, um das Volumen des Brunnens auf 5 Milliliter aufzufüllen. Dann inkubiere die Platte bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid.

Wenn die Zellen eine 80%ige Konfluenz erreicht haben, verwenden Sie 80 Nanogramm GalT-mCherry und 320 Nanogramm TPST1-EGFP-Plasmid-DNA und Transfektionsreagenz, um die Zellen gemäß dem Protokoll des Herstellers zu transfektieren. Nach dem Inkubieren der Zellen für vier bis sechs Stunden wechseln Sie das Medium und bringen Sie die Zellen für 12 Stunden zurück in den Inkubator. Aspirieren Sie das Medium im Brunnen und fügen Sie 5 Milliliter 33-Mikroform-Nocodazol mit vollständigem Medium hinzu und inkubieren Sie die Zellen dann drei Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid.

Nach der Reinigung der Glasabdeckungen gemäß dem Textprotokoll verwenden Sie einmaliges PBS mit 1 Mikrogramm pro Mikroliter BSA, um 110 Nanometer mehrfarbige fluoreszierende Perlen 80-fach zu verdünnen. Kurz wirbeln Sie das Rohr, um die Perlenaggregate zu verteilen. Mit einer Pipettenspitze verteilen Sie 60 Mikroliter verdünnte Perlen auf einen sauberen Deckel.

Im Dunkeln legt man den Deckel in eine 35-Millimeter-Schale und deckt ihn mit Alufolie ab. Trockne den Deckel im Dunkeln in einem Desikator, der an eine Vakuumpumpe angeschlossen ist. Dann verwenden Sie 50 Mikroliter Montagemedium, um den Deckel auf einen Glasschlitten zu montieren.

Richtig saubere Abdeckungsschlitze sind unerlässlich, um fluoreszierende Ablagerungen zu beseitigen. Um mehrfarbige Perlen in grünen, roten und fernroten Kanälen zu fotografieren, erfassen Sie zu Beginn der Bildaufnahme 3D-Stapel von Bildern, wobei drei Abschnitte über und unter der besten Brennebene aufgenommen werden. Speichere die Stapel als TIFF-Dateien.

Um Golgi-Mini-Stacks abzubilden, verwenden Sie TPST1-EGFP und GalT-mCherry, die in fluoreszierend markierten Objektträgern transfiziert werden, um Zellen zu finden, die TPST1-EGFP und eine niedrige oder mittlere GalT-mCherry exprimieren. Wie gerade gezeigt werden Sie 3D-Bildstapel erwerben. Um die Bilder zu analysieren, öffnen Sie Bild J, wählen Sie Datei, Bild, Öffnen, um eine Reihe von Perlenbildern aus drei TIFF-Dateien zu öffnen.

Wählen Sie Bild, Stacks, Z Projekt, um drei aufeinanderfolgende Abschnitte um den am besten fokussierten Bereich im roten Kanal zu durchschneiden. Geben Sie die Sektionsnummer des Start- und Stopp-Schnitts ein und wählen Sie unter den Optionen des Projektionstyps die durchschnittliche Intensität aus. Zeichne Hintergrund-ROIs, die keine Perlen im Bild enthalten.

Dann prüfen Sie in Analyze, Set Measurements nur den mittleren Grauwert und die Standardabweichung oder SD. Führen Sie Analysieren, Messen aus, um die Hintergrundmittelintensität und Standardabweichung zu erhalten. Wählen Sie Prozess, Mathematik, Subtrahieren, um das Bild mit den entsprechenden Werten der Hintergrundmittelintensität plus sechsmal der Standardabweichung zu subtrahieren. Geben Sie dann den berechneten Wert ein, der diesem Kanal entspricht.

Wiederhole die Mittelung und Subtraktion für grüne und weit rote Kanal-Bildstapel, indem du denselben Start- und Stopp-Schnitt und denselben Hintergrund-ROI verwendest. Führen Sie die drei bearbeiteten Bilder mit Image, Color, Merge Channels zusammen, indem Sie Kanal R als rot, Kanal G als grün und Kanal B als blau auswählen. Starten Sie den ROI Manager, indem Sie Analysieren, Tools, ROI Manager auswählen.

Zeichne quadratische ROIs um einzelne Perlen. Füge dann den ROI im ROI-Manager hinzu, indem du auf der Tastatur T drückst. Unter Analysieren setze Maße und prüfe nur den Schwerpunkt.

Im ROI-Manager wählen Sie Kanal R aus und klicken Sie auf Messung, um die X- und Y-Koordinaten der Zentren der ROIs im Ergebnisfenster zu erhalten. Kopiere und füge die beiden Spalten in eine Tabelle ein. Erhalten Sie die Koordinaten der Zentren der ROIs für Kanal G und Kanal B. Speichern Sie die Tabelle als beads.csv.

In Bild J verwenden Sie Plugins, um die beiden Makros zu installieren, Makro-Golgi-ROI-Inspektion und Makroausgabe der drei Kanäle. Lösche den ROI Manager und das Ergebnisfenster. Öffnen Sie eine Reihe von Golgi-Mini-Stack-Bildern, bestehend aus drei TIFF-Dateien.

Erzeugen Sie abgezogene Hintergrundbilder, wie zuvor in diesem Video gezeigt, für spätere Nutzung. Dann dupliziere die Bilder. Unter Process Image Calculator addieren Sie die subtrahierten Hintergrundbilder von Kanal G, Kanal R und Kanal B.

Um das resultierende Bild unter Image, Anpassen, Schwelle zu wählen, wähle Set, um eins als niedrigste Schwellenstufe einzugeben. Unter Analysieren, Teilchen analysieren solltest du auch den Größenbereich für Pixel eingeben. Geben Sie 50 bis unendlich ein, prüfen Sie die Ausschließe an den Kanten und fügen Sie den Manager hinzu.

Als Nächstes verwenden Sie Bild, Farbe, Kanäle zusammenführen, um die drei zuvor generierten Hintergrundbilder zu verschmelzen, indem Sie Kanal R als rot, Kanal G als grün und Kanal B als blau auswählen. Führen Sie dann die Makro-Makro-Golgi-ROI-Inspektion aus, indem Sie Plugins, Makro, Golgi ROI-Inspektion auswählen. Es ist wichtig, so viele ROIs wie möglich auszuwählen, die einzelne Golgi-Mini-Stacks in einer Bildmenge enthalten.

Unter Analysieren setzen Sie Maße, prüfen Sie nur Fläche, mittleren Grauwert und Schwerpunkt. Erfassen Sie Daten, indem Sie das Makrowerkzeug starten und drei Kanäle ausführen. Kopieren Sie die Koordinaten der Zentren in eine Tabelle in der hier aufgeführten Reihenfolge.

Speichere dann die Tabelle als ministacks.csv. Fahren Sie mit der chromatischen Verschiebungskorrektur der Zentren und der Lokalisierungsquotienten- oder LQ-Berechnung gemäß dem Textprotokoll über. Das moderne Forschungslichtmikroskop, ausgestattet mit einer einfachen apochromatischen Linse, wie hier verwendet, zeigt minimale chromatische Verschiebung.

Eine genaue Betrachtung des mehrfarbigen Perlenbildes zeigt sie jedoch. Zentren der roten Fluoreszenz sind definiert als die wahren Positionen der Perlen. Die relativen chromatischen Verschiebungen von grüner und fernroter Fluoreszenz können durch Vektoren dargestellt werden.

Die chromatische Verschiebung innerhalb der Bildebene wird durch den grünen und blauen Vektor jeder Perle dargestellt. Wie hier dargestellt, reduziert die chromatische Verschiebungskorrektur die chromatische Verschiebung erheblich. In Säugetierzellen ist der Golgi-Komplex im perinuklearen Bereich aggregiert, der unter einem herkömmlichen optischen Mikroskop in der Regel nicht auflösbar ist.

Nach der Nocodazol-Behandlung verschwindet der perinukleäre Golgi-Komplex und Dutzende von Golgi-Mini-Stacks sammeln sich an den Austrittsstellen des endoplasmatischen Retikulums im gesamten Cytoplasma. Ein Beispielbild, das mit der in diesem Video gezeigten Bildanalyse erzeugt wurde, ist hier zu sehen. Mit dem Makro-Golgi-ROI-Inspektionstool wurden 40 ausgewählte Golgi-Mini-Stacks aufgelistet.

Nach Anwendung der drei Kriterien konnten 21 Golgi-Mini-Stacks für die Berechnung der LQs von TPST1-EGFP analysiert werden. Einmal gemeistert, kann diese Technik innerhalb einer Stunde nach der Fluoreszenzkennzeichnung durchgeführt werden. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Methode den Weg für Forscher, die den Golgi-Apparat untersuchen, um ein Golgi-Protein quantitativ mit einer Auflösung zu lokalisieren, die der der Immunelektronenmikroskopie entspricht.