Hochmultiplexed, Super-Auflösung Bildgebung von T-Zellen mit madSTORM

Das übergeordnete Ziel dieses Bildgebungsprotokolls besteht darin, mehrere Proteine in einer aktivierten T-Zelle mittels Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie sichtbar zu machen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der T-Zell-Aktivierung zu beantworten, beispielsweise bezüglich der Einzelmolekülverteilung von TCR- oder Mikrocluster-Bestandteilen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie eine höhere Multiplexfähigkeit ermöglicht, als dies mit derzeit verfügbaren supervidierten Lösungsmikroskopiemethoden erreicht wird.

Beginnen Sie damit, Antikörper direkt mit dem Alexa-647-Farbstoff zu konjugieren, indem Sie das Alexa-647-Antikörper-Markierungs-Kit gemäß der vom Hersteller bereitgestellten Markierungsanleitung verwenden. Zentrifugieren Sie die markierten Antikörper fünf Minuten bei 20.800 × g. Sammeln Sie nach der Zentrifugation den Überstand, um aggregierte Antikörper zu entfernen. Beschichten Sie anschließend A12-Deckglas-Kammern mit 250 µL 0,1 % Poly-L-Lysin für 15 Minuten.

Anschließend die Lösung abpipettieren, ohne zu spülen, und die Kammer 30 Minuten bei 65 Grad Celsius trocknen. Eine Verdünnung von 100 Nanometer fluoreszierenden Nanodiamanten oder FNDs in 1× PBS herstellen und verschiedene Verdünnungen testen, um sicherzustellen, dass in jedem Bildfeld ausreichend FNDs sichtbar sind. Die verdünnten FNDs eine Minute lang vortexen.

Als Nächstes wird das FND-Überstand 30 Sekunden bei hoher Leistungseinstellung beschallt. Der beschallte FND-Überstand wird 30 Minuten bei Raumtemperatur in einer mit Poly-L-Lysin beschichteten A12-Deckglas-Kammer inkubiert. Nach dem fünfmaligen Waschen der Kammer mit 1x PBS wird die mit FND beschichtete Kammer unter Verwendung einer 647 Nanometer Laseranregung am TURF-Mikroskop sichtbar gemacht.

Verwenden Sie ein 100x-Objektiv mit einem Bildfeld von 61 mal 61 Mikrometern. Bei geeigneter Verdünnung der FNDs sollten idealerweise vier bis zehn einzelne FNDs im Bildfeld sichtbar sein, wobei mindestens ein FND in jedem Quadranten des Aufnahmebereichs vorhanden sein sollte. Sobald die richtige Dichte an FNDs erreicht ist, geben Sie 250 Mikroliter Anti-CD3-Antikörper zu jedem Well hinzu.

Inkubieren Sie die Kammer eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius oder über Nacht bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie nach der Inkubation die Lösung aus den Vertiefungen und geben Sie 1x PBS für 30 Sekunden hinzu. Wiederholen Sie diesen Waschschritt fünfmal.

Zentrifugieren Sie ein Milliliter Jurkat-T-Zellen bei 800 × g für sechs Minuten. Jurkat-T-Zellen sollten vor der Zentrifugation idealerweise eine Konzentration von 0,5 bis eine Million Zellen pro Milliliter aufweisen. Resuspendieren Sie die Zellen in 300 Mikroliter 1x HBS-Lösung.

Unterdessen 150 Mikroliter 1x HBS-Lösung in jede Vertiefung der Kammer geben und 15 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Anschließend 50 Mikroliter der erneut suspendierten Jurkat-T-Zellen in jede Vertiefung geben und drei Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Danach 300 Mikroliter 4 % Paraformaldehyd zu jeder Vertiefung hinzufügen und 30 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren.

Nach dreimaligem Waschen mit 1x PBS die Zellen permeabilisieren, indem 250 Mikroliter einer 0,1 %igen Triton X-Lösung fünf Minuten bei Raumtemperatur hinzugefügt werden. Nach drei weiteren Waschschritten mit 1x PBS 250 Mikroliter einer 1 %igen Fischgelatine-Lösung pro Vertiefung 30 Minuten bei Raumtemperatur zugeben. Abschließend die Zellen dreimal erneut mit 1x PBS waschen.

Geben Sie 200 Mikroliter markierten Antikörper in einer Konzentration von 0,1 bis 0,5 Mikrogramm pro Milliliter zu den fixierten Zellen und inkubieren Sie eine Stunde bei Raumtemperatur. Nach dem fünfmaligen Waschen der Zellen mit 1x PBS fügen Sie ein Milliliter STORM-Puffer hinzu und bedecken die Kammer mit einem Glasdeckel, um eine Belichtung zu begrenzen. Verwenden Sie Klemmen auf dem Mikroskoptisch, um die Deckglas-Kammer in Position zu halten.

Dieser Schritt ist entscheidend für die großflächige Multiplex-Analyse, da dasselbe Sichtfeld nach mehreren Wäsche- und Inkubationsschritten erhalten bleiben muss. Suchen Sie im Turf-Modus mit geringer Laserleistung von 647 Nanometern eine angefärbte Zelle mit mindestens drei FNDs im Sichtfeld. Erhöhen Sie die Laserleistung bei 647 Nanometern und nehmen Sie die Bilder auf.

Typische Parameter finden sich im Textprotokoll. Waschen Sie die Zellen fünfmal mit 1x trisgepufferter Salzlösung oder 1x TBS. Anschließend ein Milliliter Elutionspuffer hinzufügen und eine Minute bei Raumtemperatur inkubieren.

Wiederholen Sie die Elution dreimal. Verwenden Sie die exakten Elutionsbedingungen und die für jeden Antikörper angegebene Anzahl an Elutionspuffern, um das Signal vollständig zu entfernen. Waschen Sie die Zellen anschließend dreimal mit 1x TBS und geben Sie ein Milliliter 1x PBS hinzu.

Eine korrekte Durchführung dieses Elutionsschritts führt zur Entfernung zuvor gebundener Antikörper und ermöglicht eine höhere Effizienz bei der nachfolgenden Antikörpermarkierung. Es ist wichtig, TBS für die Waschschritte zu verwenden, um die Ausfällung zwischen den Elutionsschritten zu minimieren. Photobleichen Sie die Zellen mithilfe eines 647-Nanometer-Lasers mit hoher Leistung und aktivieren Sie Alexa-647-Farbstoffe im dunklen Zustand durch einen 405-Nanometer-Laser mit zwei bis fünf Milliwatt.

Warten Sie, bis das gesamte verbleibende Signal des nicht eluierten Antikörpers durch Photobleichen entfernt ist. Dies dauert typischerweise zwei bis fünf Sekunden Laserbestrahlung. Nehmen Sie Probenbilder mit den STORM-Einstellungen nach Illusion und Photobleichen auf, um die Entfernung des Signals zu bestätigen.

Fügen Sie anschließend 250 Mikroliter 4 % Paraformaldehyd für 15 Minuten hinzu. Dies verhindert die rückgängige Vernetzung fixierter Moleküle in der Zelle. Waschen Sie die Zellen dreimal mit 1x PBS.

Wiederholen Sie diese Schritte für die sequenzielle Markierung mehrerer Zielstrukturen. Führen Sie abschließend die Driftkorrektur und die Ausrichtung der multiplexen Bildstapel wie im Textprotokoll beschrieben durch. Die sequenzielle Illusion- und Standing-Methode wurde verwendet, um das multiplexe MET-STORM-Bild von Mikroclustern und anderen Strukturen in einer aktivierten Jurkat-T-Zelle zu erzeugen.

Das endgültige MET-STORM-Bild wurde mithilfe der durchschnittlichen Fiducial-Korrektur und FND-Fiducial-Markern auf Drift und Ausrichtung korrigiert. Dargestellt sind hier Einzelmolekül-Lokalisierungsmikroskopiebilder eines einzelnen FND, lokalisiert in 30.000 Bildrahmen, vor und nach der Driftkorrektur mit durchschnittlicher Fiducial-Korrektur. Ebenso sind hier Einzelmolekül-Lokalisierungsmikroskopiebilder einer aktivierten Jurkat-T-Zelle gezeigt, die mit einem Antikörper gegen phosphoryliertes SLP76 und FND-Futusial-Markern gefärbt wurde, vor und nach der Driftkorrektur mit durchschnittlicher Futusial-Korrektur.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine multiplexe Super-Auflösungs-Aufnahme von Proteinen in einer aktivierten T-Zelle mittels MET STORM durchführt. Sobald diese Technik beherrscht ist, kann sie für jede Multiplex-Runde innerhalb von drei Stunden durchgeführt werden. Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die Probe an derselben Position auf dem Mikroskopständer zu belassen.

Dies kann mit Bühnenklemmen durchgeführt werden. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit unserem modifizierten STORM-Puffer äußerst gefährlich sein kann, und Vorsichtsmaßnahmen wie beispielsweise Atemschutzmasken und Schutzbrillen sollten stets getroffen werden, während dieses Verfahren durchgeführt wird.