Modifizierte terminale Restriktionsfragmentanalyse zur Quantifizierung der Telomerenlänge mittels In-Gel-Hybridisierung

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Länge der Telomere in eukaryotischen Zellen mit einer modifizierten Version eines Verfahrens zur Analyse von Telomerrestriktionsfragmenten zu bestimmen, das von den Ärzten Jerry W. Shay, Woodring Wright und Kollegen beschrieben wurde. Durch die Bereitstellung von Daten über die Telomerlänge kann das Verfahren Fragen zur Zellbiologie, Verhaltensmedizin, Epidemiologie und Infektionskrankheiten, zu den Auswirkungen von Alter, Stress, medikamentösen Behandlungen und Infektionen beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine direkte Messung der durchschnittlichen Telomerlänge in einer Vielzahl von Zellen in Kilobasen ermöglicht.

Die zu analysierenden genomischen DNA-Proben wurden unter Verwendung eines kommerziellen DNA-Extraktionskits aus Zellen extrahiert, wie im Textprotokoll beschrieben. Führen Sie den Verdau der genomischen DNA in einem Endvolumen von 20 bis 40 Mikrolitern durch. Kombinieren Sie in jedem Mikrozentrifugenröhrchen Folgendes:drei Mikrogramm genomische DNA; 10x DNA-Digest-Puffer; ein Mikroliter Rsa1-Restriktionsenzym; ein Mikroliter Hinf1-Restriktionsenzym; und steriles, deionisiertes Wasser bis zum endgültigen Volumen.

Kurz zentrifugieren, um sicherzustellen, dass sich alle Komponenten im Boden des Röhrchens befinden. Inkubieren Sie die Verdauung bei 37 Grad Celsius für mindestens 16 Stunden. Beginnen Sie dieses Verfahren mit der Herstellung einer 0,6%igen Agaroselösung, wie im Textprotokoll beschrieben.

Bereiten Sie das Gelelektrophoresesystem für den Gelguss vor. Befestigen Sie die Endanschnitte an der Gelgießschale. Sobald die Agarose-Gellösung auf 50 Grad Celsius abgekühlt ist, gießen Sie sie in die Gelgießschale, setzen Sie einen Kegel in das Gel ein und lassen Sie das Gel unbedeckt 45 Minuten lang bei Raumtemperatur aushärten.

Entfernen Sie die Endblenden von der Gießschale und entfernen Sie den Kamm aus dem Gel. Füllen Sie das Gelelektrophoresesystem mit Elektrophoresepuffer bis zur Fülllinie und stellen Sie sicher, dass das Gel vollständig in den Puffer eingetaucht ist. Beladen Sie die Vertiefungen des Gels mit den DNA-Proben, wobei zwischen den Proben eine leere Vertiefung verbleibt.

Geben Sie 10 Mikroliter einer DNA-Leiter in die Vertiefungen an den gegenüberliegenden Enden des Gels. Lassen Sie die Gelelektrophorese 30 Minuten lang bei 150 Volt laufen, um die DNA schnell in das Gel zu transportieren. Stellen Sie die Spannung nach 30 Minuten auf 57 Volt ein und lassen Sie sie 18 bis 24 Stunden lang laufen.

Nachdem das Gel 18 bis 24 Stunden lang gelaufen ist, schalten Sie die Elektrokosequelle aus und entfernen Sie die Gelgießschale mit dem Gel aus dem Elektroktrophoresepuffer. Scheibe der oberen rechten Ecke des Gels, um als Referenz für die Ausrichtung des Gels zu dienen. Schneide ein Stück Filterpapier auf eine Größe zu, die etwas größer als das Gel ist.

Legen Sie das Filterpapier auf das Gel in eine Gießschale und lassen Sie das Papier die überschüssige Lösung auf dem Gel aufsaugen. Entfernen Sie vorsichtig die Luftblasen zwischen dem Filterpapier und dem Gel, indem Sie eine Pipette als Rolle verwenden, um die Blasen durch die Seiten herauszudrücken. Entferne das Gel aus der Gießschale, indem du das Gel und das Filterpapier umdrehst, so dass sich das Papier unter dem Gel befindet.

Übertragen Sie das Gel mit dem Filterpapier in einen Geltrockner und decken Sie das Gel mit Plastikfolie ab. Entfernen Sie alle Luftblasen zwischen der Plastikfolie und dem Gel mit einer Pipette als Rolle. Trocknen Sie das Gel zwei Stunden lang bei 50 Grad Celsius.

Sobald das Gel getrocknet ist, entfernen Sie die Plastikfolie und geben Sie das Gel und das Filterpapier in eine Glasschale mit 250 Millilitern entionisiertem Wasser. Entfernen Sie vorsichtig das Filterpapier und inkubieren Sie das Gel 15 Minuten lang bei Raumtemperatur. Legen Sie das Gel auf ein 12 x 12 Zoll großes Nylonnetz.

Rollen Sie das Nylonnetz und das Gel zusammen und achten Sie darauf, dass das Gel nicht mit sich selbst in Berührung kommt. Lege das Netz und das Gel in ein Hybridisierungsröhrchen. Kombinieren Sie 100 Milliliter 5x SSC und 12 Mikroliter grün fluoreszierende Nukleinsäurefärbung und geben Sie sie in das Hybridisierungsröhrchen.

30 Minuten bei 42 Grad Celsius in einem Hybridisierungsofen mit Rotation inkubieren. Schützen Sie die Lösung vor Licht. Entfernen Sie nach 30 Minuten das Nylonnetz und das Gel aus dem Hybridisierungsschlauch.

Aufrollen und flach in eine Glasschale mit 250 Millilitern entionisiertem Wasser legen. Entfernen Sie vorsichtig das Nylonnetz. Bilden Sie das Gel mit einem Phosphorimager mit den angegebenen Einstellungen ab.

Bereiten Sie die radioaktive Telomersonde gemäß den Vorschriften der Einrichtung für den Umgang mit Radioaktivität vor. Kombinieren Sie im Mikrozentrifugenröhrchen Folgendes: zwei Mikroliter Telomersonde; 2,5 Mikroliter 10x Polynukleotidkinase-Reaktionspuffer; drei Mikroliter an ATP, das auf der Gammaphosphatgruppe mit P32 markiert ist; vier Mikroliter T4-Polynukleotidkinase; und DNase-freies, steriles, deionisiertes Wasser bis zu einem Endvolumen von 20 Mikrolitern. Zentrifugieren Sie das Röhrchen kurz.

Inkubieren Sie das Röhrchen eine Stunde lang in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius. Zentrifugieren Sie das Röhrchen kurz und inkubieren Sie es 20 Minuten lang bei 65 Grad Celsius, um die Reaktion zu stoppen. Die radioaktive Sondenlösung wird in eine vorbereitete G25-Chromatographiesäule geladen und zwei Minuten lang bei 700 g zentrifugiert.

Bewahren Sie das Filtrat auf, das die radioaktive Telomersonde enthält. Das Gel in eine Glasschale mit 250 Millilitern Denaturierungslösung geben und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Entfernen Sie die Denaturierungslösung und ersetzen Sie sie durch 250 Milliliter steriles, entionisiertes Wasser.

10 Minuten lang auf einem Orbitalschüttler bei Raumtemperatur inkubieren. Entfernen Sie das entionisierte Wasser. Durch 250 Milliliter Neutralisationslösung ersetzen und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.

Rollen Sie das Gel zu einem Nylonnetz und legen Sie es in das Hybridisierungsröhrchen. 20 Milliliter der Hybridisierungslösung zugeben und in einem Hybridisierungsofen bei 42 Grad Celsius 10 Minuten lang mit Rotation inkubieren. Entfernen Sie nach 10 Minuten die Hybridisierungslösung und ersetzen Sie sie durch 20 Milliliter frische Hybridisierungslösung.

Fügen Sie die gesamte Telomersonde hinzu und inkubieren Sie sie in einem Hybridisierungsofen bei 42 Grad Celsius mit Rotation über Nacht. Wenn die Hybridisierung mit der Telomersonde abgeschlossen ist, entfernen Sie das Gel und das Netz aus dem Hybridisierungsröhrchen und legen Sie es in eine Glasschale, die 250 Milliliter 2x SSC enthält. Rollen Sie das Nylonnetz aus und nehmen Sie es aus der Schale.

Stellen Sie die Glasschale auf einen Orbitalschüttler und inkubieren Sie sie 15 Minuten lang bei Raumtemperatur. Entfernen Sie die 2x SSC, ersetzen Sie sie durch 250 Milliliter 0,1x SSC plus 0,1%ige SDS-Lösung und inkubieren Sie sie 15 Minuten lang auf dem Orbitalschüttler bei Raumtemperatur. Entfernen Sie die 0,1x SSC plus 0,1 % SDS-Lösung.

Ersetzen Sie es durch 250 Milliliter 2x SSC und inkubieren Sie weitere 15 Minuten auf dem Orbitalschüttler. Entferne das Gel aus dem 2x SSC und wickle das Gel in Frischhaltefolie ein. Entferne alle Blasen und Lufteinschlüsse zwischen dem Gel und der Frischhaltefolie.

Geben Sie das Gel in eine Belichtungskassette mit einem Phosphorsieb und setzen Sie das Phosphorsieb über Nacht dem Gel aus. Verwenden Sie am nächsten Tag einen Phosphor-Imager, um den belichteten Phosphorschirm abzubilden. Die Phosphorbilder werden anschließend für die Quantifizierung der Telomerlänge verwendet, wie im Textprotokoll beschrieben.

Drei DNA-Konzentrationen, die aus einer immortalisierten menschlichen Vorhaut-Fibroblasten-Zelllinie und mononukleären Zellen des menschlichen peripheren Blutes isoliert wurden, wurden auf Telomerlänge analysiert. Dieses Phosphorbild des getrockneten Agerose-Gels, das mit grün fluoreszierender Nukleinsäurefärbung gefärbt wurde, zeigt die Position der DNA-Leiterbanden in den Spuren eins und acht. Der von der Oberseite des Gels gemessene Abstand zu jedem Molekulargewichtsstandard ist durch blaue Pfeile gekennzeichnet.

Nach der Hybridisierung mit einer Telomersonde erscheinen die Telomerbänder als Abstriche in jeder Spur. Für jede Fahrspur plus eine Hintergrundspur wurden Raster von 150 Boxen berechnet. Die ausgewählten Analysebereiche für jeden Probensatz werden angezeigt.

Für jeden Probensatz wurden separate Hintergrundspuren mit der Markierung B ausgewählt, um sicherzustellen, dass die Hintergrundintensitäten für jeden Probensatz ähnlich waren. Berechnungen der durchschnittlichen Telomerlänge zeigten eine höhere durchschnittliche Telomerlänge in der immortalisierten Zelllinie als in menschlichen mononukleären Zellen des peripheren Blutes. Diese Ergebnisse zeigen auch, dass die Menge an genomischer DNA, die in jeder Spur analysiert wird, entscheidend ist, um ein nachweisbares Signal nach der Hybridisierung zu erhalten.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in 12 Stunden verteilt auf 2 1/2 Tage durchgeführt werden, mit zwei Inkubationen über Nacht, wenn sie richtig durchgeführt wird. Wenn Sie dieses Verfahren ausprobieren, ist es wichtig, daran zu denken, mindestens drei Mikrogramm DNA für jede Probe zu verwenden und jede Probe in doppelter Ausführung zu messen. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet des Alterns, um Mechanismen zu erforschen, die für die Aufrechterhaltung der Telomerlänge bei verschiedenen Tierarten, einschließlich des Menschen, verantwortlich sind.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die durchschnittliche Länge der Telomere selbst direkt bestimmen können. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Radioaktivität extrem gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Laborkitteln und Handschuhen getroffen werden sollten.