Erkennung von passives Spender erythroiden Vorläuferzellen nach hämatopoetische Stammzell-Transplantation bei Patienten mit Hämoglobinopathien

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Chimärismus im Kontext der Stammzelltransplantation zu überwachen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Transplantationsbereich zu klären, beispielsweise die Einwanderung der hämatopoetischen Stammzelltransplantate bei Patienten mit Hämoglobinopathien. Der Hauptvorteil dieser Methode liegt darin, dass sie die zellbasierte Sortierung mittels Durchflusszytometrie, die Spalteninformationsanalyse sowie anschließend die Untersuchung kurzer Wiederholungssequenzen kombiniert, um die Proliferation und Differenzierung von Vorläuferzellen im erythroiden Kompartiment zu bewerten.

Die Bedeutung dieser Technik reicht über die Therapie der Transplantatabstoßung hinaus, da sie helfen kann, Patienten zu identifizieren, die anfällig für ein Wiederauftreten der Erkrankung sind, und anschließende immunmodulatorische Strategien einzuleiten. Darüber hinaus kann sie auch auf zukünftige klinische Studien, die Stammzellenforschung sowie die Planung von Hauttherapie-Studien angewendet werden. Eine visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da der Prozess schwer zu erlernen ist und von geschultem Personal durchgeführt werden muss.

Elisabeth Hoflehner, eine Technikerin in meinem Labor, wird dieses Verfahren demonstrieren. Erstellen Sie zunächst eine Einzelzell-Suspension der Knochenmarkprobe zur Fettfärbung. Dazu geben Sie das Knochenmark in einen Zellfilter und schrauben diesen auf ein Zentrifugenröhrchen.

Verwenden Sie den Spritzenkolben, um Gewebestücke durch das Netz zu pressen. Spülen Sie mit wenigen Millilitern Suspensionspuffer, um das gesamte Material zu sammeln. Geben Sie drei Milliliter Gradientenmedium in ein Zentrifugenröhrchen und schichten Sie vorsichtig die Einzelzell-Suspension darauf auf.

Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 550 G und 20 Grad Celsius für 30 Minuten, wobei die Beschleunigung auf neun und die Verzögerung auf null eingestellt ist. Entfernen Sie die obere Schicht, die Plasma und Thrombozyten enthält, mit der Pipette, und achten Sie darauf, die mononukleäre Zellschicht an der Grenzfläche ungestört zu lassen. Überführen Sie diese mononukleäre Zellschicht in ein Zentrifugenröhrchen.

Als Nächstes waschen Sie die Zellen mit 10 Milliliter Suspensionspuffer. Zentrifugieren Sie das Reagenzglas bei 250 ×g und vier Grad Celsius für fünf Minuten. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet durch Pipettieren in zwei Milliliter komplettem isokovs modifiziertem Dulbeccos Medium.

Um die Zellkonzentration mit einem Hämozytometer zu bestimmen, geben Sie 95 Mikroliter 2 %iger Trypanblaufärbung in eine 96-Loch-Platte. Fügen Sie fünf Mikroliter Zellsuspension hinzu, mischen Sie gründlich und inkubieren Sie kurz bei Raumtemperatur. Füllen Sie das Hämozytometer und betrachten Sie es unter dem Mikroskop.

Zählen Sie nur angefärbte lebensfähige Zellen. Anschließend zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 250 G und 25 Grad Celsius für 10 Minuten. Um den FC-Rezeptor zu blockieren, verwenden Sie 2,5 Mikrogramm Blocker pro 100 Mikroliter.

10 bis 15 Minuten auf Eis inkubieren. Die Kombination vorab titrierter monoklonaler Antikörper hinzufügen, die für das verwendete Volumen zur Färbung der Zellen geeignet ist. 20 Minuten bei vier Grad Celsius im Dunkeln inkubieren.

Waschen Sie die Zellen mit drei Milliliter Färbepuffer und zentrifugieren Sie anschließend. Nach der Einstellung der Zellkonzentration überführen Sie die Zellsuspension mittels Pipette durch einen 70-Mikroliter-Zellfilter in ein Standard-Rohr für die Durchflusszytometrie, um Aggregate zu entfernen. Richten Sie danach den Zellsorter und die Software gemäß den Herstelleranweisungen ein und optimieren Sie diese.

Richten Sie eine Vorlage ein, die ein bivariates Diagramm zur Darstellung des Vorwärtsstreulichts (FSC) und des Seitwärtsstreulichts (SSC) enthält. Um die interessierende Zellpopulation in den sichtbaren Bereich zu bringen, führen Sie die Zellen auf dem Sortiergerät und passen FSC und SSC an. Beginnen Sie mit der Aufzeichnung der Daten für das negative Kontrollröhrchen, danach erfassen Sie die Daten für jedes einzelne Färbekontrollröhrchen zur Kompensation und berechnen die Kompensation.

Anschließend brachten die experimentellen Proben auf ein bivariates FSC, SSC-Punktdiagramm ein, um sowohl lymphozytäre als auch myeloide Zellen einzuschließen. Durch den Vergleich der verschiedenen Signale von FSC wurden Doppelzellen und Aggregate ausgeschlossen. Danach visualisierten die Einzelzellen, die CD45 und CD36 exprimieren, in einem bivariaten Punktdiagramm.

CD45-positive Ereignisse repräsentieren Leukozyten und ihre Vorläuferzellen. CD45-negative und CD36-positive Ereignisse repräsentieren erythroide Vorläuferzellen. Um CD36-positive und CD45-positive Zellen zu definieren, verwenden Sie Gating-Tools und visualisieren Sie anschließend die CD45-positiven Ereignisse sowie ein weiteres Punktdiagramm, das die Parameter CD34 und SSC darstellt.

Verwenden Sie anschließend Gating-Tools, um die CD34-positiven Zellen oder Leukozyten-Progenitoren sowie die SSC-hoch Zellen oder myeloischen Zellen in verschiedenen Differenzierungsstadien zu definieren. Danach wählen Sie Gates für die Sortierung in externe Sammelröhrchen aus. Schließen Sie abschließend die Zellsortierung bei vier Grad Celsius durch, bis die gewünschte Anzahl an Zellen erreicht ist.

Verdünnen Sie die Zellen durch Zugabe von vollständigem IMDM-Medium, das mit humanem rekombinanten Erythropoietin (EPO) ergänzt wurde. Überführen Sie 300 Mikroliter der verdünnten Zellen in drei Milliliter H4434-Medium und inkubieren Sie unter Schütteln bei Raumtemperatur für fünf Minuten. Anschließend geben Sie jeweils ein Milliliter Zellsuspension in drei 35-Millimeter-Schalen.

Stellen Sie zwei der Kulturschalen zusammen mit einer dritten, mit Wasser gefüllten Schale, in eine 100-Millimeter-Platte. Kultivieren Sie diese Zellen 14 Tage lang in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C mit 5 % Kohlendioxid. Verwenden Sie ein invertiertes Mikroskop mit 40facher Vergrößerung und die mit einem Auswertungsraster markierte Kulturschale, um die Kolonien anhand ihrer Morphologie auszuwerten.

Klassifizieren Sie die koloniebildenden Einheiten oder CFU in multipotente Vorläuferzellen, granulozytär-monocytaire Vorläuferzellen, burstbildende erythroide Einheiten und koloniebildende erythroide Zellen. Zunächst werden die Zellen gemäß dem Textprotokoll aus dem Fax oder der CFU-Assay-Platte gewonnen und anschließend mit der DNA-Extraktion fortgefahren. Nach dem Zentrifugieren der Zellen verwenden Sie ein automatisiertes Gerät zur DNA-Isolierung aus Blut, um Nukleinsäure aus dem Pellet zu isolieren.

Messen Sie die DNA-Konzentration mithilfe eines Fluorometers. Bereiten Sie die Proben gemäß den Anweisungen des Herstellers vor und geben Sie die Probe anschließend in die Probenkammer des Fluorometers. Fügen Sie verdünnte DNA zu einer Mischung aus DNA-Polymerase, dem Primer-Set und der Reaktionsmischung hinzu, um eine PCR-Reaktion gemäß der Anleitung durchzuführen.

Schließen Sie prätransplantations-DNA von Spender und Empfänger sowie nukleasefreies Wasser als negative Kontrolle und 9947A als positive Kontrolle ein. Um die PCR-Ergebnisse zu analysieren, geben Sie 10 Mikroliter denaturierte DNA-Proben in die Vertiefungen einer 96-Loch-Reaktionsplatte. Versiegeln Sie die Platte, zentrifugieren Sie sie kurz und stellen Sie die Platte auf Eis.

Megakaryozyten-Erythrozyten-Progenitoren, klassifiziert als Population positiv für CD36 und negativ für das CD45-Antigen. Zusätzlich werden CT45-positive und CD34-positive Zellen als lymphoide myeloide Vorläuferzellen identifiziert sowie CD45-positive Zellen mit hohem SSC-Signal als reife myeloide Zellen. Die Reinheit der erythroiden Progenitorzellen nach der Sortierung betrug mehr als 85 %, und die Reinheit der myeloiden Zellen betrug mehr als 95 %. Knochenmarkzellen, die mittels CD34-spezifischer magnetischer Kügelchen separiert wurden, wurden 14 Tage lang kultiviert.

Einige dieser Zellen scheinen sich zu proliferieren, zu differenzieren und Kolonien zu bilden. Die Stimulation mit verschiedenen Konzentrationen von EPO erhöhte die Bildung deutlich roter erythroider Kolonien. Eine PCR-Analyse kurzer tandemrepetitiver Sequenzen (STRs), die spezifisch für die DNA von Empfänger und Spender sind, kann Chimärismus in Zellen nachweisen.

Diese Methode bestimmte erfolgreich die Menge an DNA des Empfängers im Vergleich zur DNA des Spenders in Zellen, die aus der Zellsortierung von Knochenmarkzellen sowie aus Zellen gewonnen wurden, die aus dem klonogenen Assay stammten. Sobald die Methode beherrscht ist, kann sie bei korrekter Durchführung innerhalb von vier Stunden durchgeführt werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig zu beachten, dass diese Technik standardisiert werden muss und von entsprechend geschultem Personal durchgeführt werden sollte.

Nach diesem Verfahren können verbleibende, vom Spender stammende erythroide Vorläuferzellen weiter analysiert werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise den selektiven Vorteil genetisch korrigierter erythroider Stammzellen. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik Forschern auf dem Gebiet der Stammzelltransplantation den Weg, um Proliferation und Differenzierung von Vorläuferzellen im erythroiden Kompartiment zu untersuchen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man das Engraftment nach einer Stammzelltransplantation bei Patienten mit Hämoglobinopathien überwacht.