Reprogrammierung primäre Fruchtwasser und Membrane Zellen zur Pluripotenz in Xeno-freien Bedingungen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, mittels episomaler Reprogrammierung effizient induzierte pluripotente Stammzellen aus zwei verschiedenen Arten von fetalen Stammzellen zu gewinnen. Diese Methode kann dazu beitragen, eine Quelle für pluripotente Stammzellen für das Tissue Engineering, die Modellierung von Krankheiten, die Grundlagenforschung oder Längsschnittstudien zu schaffen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Reprogrammierung und Reifung von iPSCs unter chemisch definierten Bedingungen abläuft und gleichzeitig frühzeitig für potenzielle pädiatrische zellbasierte Therapien zur Verfügung steht.

Dieses Verfahren wird von Steven McClellan, dem leitenden Prüfarzt, und mir demonstriert. Entnehmen Sie die Plazenta so bald wie möglich nach der Geburt. Schneiden Sie ein neun Quadratzentimeter großes Segment des Amnions ab und waschen Sie es in einem 50-Millimeter-Zentrifugenröhrchen mit 30 Millilitern PBS, das mit antibiotischer und antimykotischer Lösung ergänzt wird.

Entfernen Sie Blutgerinnsel von den Membranen und zerkleinern Sie die Membranen dann mit einem Paar feiner Skalpelle in einer sterilen 10-Zentimeter-Gewebekulturschale in feine Stücke. Verwenden Sie die Skalpellklingen, um die zerkleinerte Membrangewebemasse in ein Gewebedissoziationsröhrchen zu übertragen, das 4,7 Milliliter RPMI-1640 Medium enthält. Die Dissoziationsenzyme untermischen.

Montieren Sie den Schlauch auf den Gewebedissoziator und führen Sie das Programm h_tumor_01 aus. Dann inkubieren Sie das Röhrchen bei 37 Grad Celsius auf einer Schaukelplattform für 30 Minuten. Verdünnen Sie die Suspension weiter mit 35 Millilitern RPMI-1640 und tragen Sie sie auf ein 70-Mikron-Sieb auf, das über ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen gelegt wird.

Fünf Minuten lang bei 200 mal g bei Raumtemperatur zentrifugieren. Nachdem Sie den Überstand verworfen haben, resuspendieren Sie das Pellet in fünf Millilitern RPMI-1640 und zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer. Die Zellen werden in Zellclustern mit einer Dichte von etwa 10.000 Zellen pro Quadratzentimeter in Gewebekulturflaschen mit frisch zubereitetem AFMC-Medium ausgesät, das mit einer antibiotischen, antimykotischen Lösung ergänzt wird.

Ernten Sie Fruchtwasser mit niedriger Passagezahl und Membranstammzellen für die Reprogrammierung aus einem T75-Kolben, indem Sie dem Zellblatt zwei Milliliter Zellablösungsenzym hinzufügen. Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius für fünf bis acht Minuten. Nach einer Zentrifugation bei 200 mal g für 45 Minuten das Pellet in einem Milliliter PBS resuspendieren und gut mischen, um die Serumbestandteile wegzuspülen.

Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer. Stellen Sie dann die Zelldichte auf 100.000 Zellen pro Milliliter PBS ein und vervierfachen Sie sie nun in 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Legen Sie die Mikrozentrifugenröhrchen in Fünf-Milliliter-Polystyrolröhrchen, um die Zentrifugation in einem normalen Schwenkruder zu ermöglichen, und zentrifugieren Sie vier Minuten lang bei Raumtemperatur bei 200 mal g.

Nach dem Schleudern drehen Sie die Röhrchen um, entsorgen Sie den Überstand in einen Abfallbehälter und führen Sie dann einen zusätzlichen Zentrifugationsschritt bei 200 mal g für drei Minuten durch. Nach dem Schleudern die restliche Flüssigkeit vorsichtig mit einer 200-Mikroliter-Pipette aus den Röhrchen absaugen. Legen Sie die Transfektionsspitzen, das Röhrchen, den Resuspensionspuffer und den elektrolytischen Puffer in den Gewebekulturschrank.

Bewegen Sie das Transfektionsgerät in die Nähe, so dass seine Röhrenstation direkt in den Schrank gestellt werden kann. Füllen Sie ein Transfektionsröhrchen mit drei Millilitern Elektrolytpuffer und montieren Sie das Röhrchen in die Station, indem Sie es ganz in den Schlitz schieben. Zuvor vorbereitete Aliquots der Reprogrammierungsplasmidlösung werden aus dem bei minus 80 Grad Celsius warmen Lager entnommen und bei Raumtemperatur im Kulturschrank auftauen gelassen.

Stellen Sie die Transfektionsparameter am Gerät so ein, dass ein Impuls von 40 Millisekunden bei 950 Volt abgegeben wird. Resuspendieren Sie das Pellet mit 100.000 Zellen in 10 Mikrolitern Resuspensionspuffer. Geben Sie schnell 1/10 der Reprogrammierungsplasmidlösung zu den resuspendierten Zellen.

Montieren Sie die Transfektionsspitze auf die Transfektionspipette. Aspirieren Sie dann die Zellsuspension vorsichtig in die Transfektionsspitze, wobei die Bildung von Luftblasen zu vermeiden ist. Führen Sie die Transfektionspipette in das Transfektionsröhrchen ein.

Und drücken Sie die Starttaste auf dem Bildschirm am Transfektionsgerät. Warten Sie auf die Bildschirmmeldung über den Erfolg der Transfektion. Nehmen Sie dann sofort die Pipette aus dem Röhrchen.

Stoßen Sie die Suspension in eine Vertiefung der Zielplatten mit sechs Vertiefungen aus. Mischen Sie das Medium aus einer benachbarten Vertiefung ein und verteilen Sie die Suspension gleichmäßig auf beide Vertiefungen. Wiederholen Sie die Transfektion für jedes Mikrozentrifugenröhrchen mit Zellen.

Beginnen Sie mit der Zugabe von 30 Mikrolitern 0,5 millimolar EDTA und PBS zu fünf PCR-Röhrchen. Laden Sie dann eine Spitze auf eine 10-Mikroliter-Pipette, die auf zwei Mikroliter eingestellt ist. Halten Sie die Pipettenspitze schräg am Koloninrand und kratzen Sie vorsichtig und allmählich die gesamte Kolonie von der Oberfläche ab.

Aspirieren Sie sofort die gesamte Kolonie in die Pipettenspitze und überführen Sie sie in eines der vorbereiteten PCR-Röhrchen mit EDTA. Nachdem Sie den Vorgang mit vier anderen Völkern wiederholt haben, inkubieren Sie vier bis sechs Minuten lang bei Raumtemperatur. Verwenden Sie eine größere Pipettenspitze, um jede Zellsuspension vorsichtig auf und ab zu pipettieren, um die Kolonie in kleinere Klumpen zu zerlegen.

Vermeiden Sie die Erstellung einer einzelligen Suspension. Anschließend wird die Suspension direkt in die Zielvertiefung einer rekombinanten vitronectinbeschichteten 24-Well-Platte plattiert. Nachdem Sie den Vorgang für die verbleibenden Völker wiederholt haben, inkubieren Sie drei bis sechs Tage lang.

Nach vier bis sechs Tagen, wenn die Kolonien gewachsen und kompakt geworden sind, waschen Sie die Zellblätter mit 300 Mikrolitern 0,5 millimolar EDTA und aspirieren Sie sofort. Fügen Sie dann weitere 300 Mikroliter hinzu und inkubieren Sie fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Stellen Sie nach dem Aspirieren des EDTA eine Ein-Milliliter-Pipette auf die Kapazitätskapazität, montieren Sie sie auf eine Milliliterspitze mit breiter Bohrung und aspirieren Sie das E8-Medium aus der Zielvertiefung einer vitronectin-beschichteten Sechs-Well-Platte.

Spritzen Sie einen Strahl des Mediums in eine Vertiefung der Quellplatte, um die iPSC-Kultur abzuwaschen. Übertragen Sie dann die Suspension in die Zielvertiefung und pipettieren Sie mehrmals auf und ab, um die Kolonien in Klumpen von 20 bis 40 Zellen aufzuteilen. Stellen Sie nach dem Plattieren aller Zellen sicher, dass die Klumpen gleichmäßig verteilt sind, indem Sie die Platte leicht schaukeln und schütteln.

Dann wird die Platte wieder in den Inkubator geschoben, um die Klumpenhaftung und das Koloniewachstum zu gewährleisten. Die Fruchtwasser- und Membranstammzellen, die Ausgangszellen für die Reprogrammierung darstellen, weisen eine typische mesenchymale Morphologie auf, die länglich und phasenhell ist. Die Zellen erhalten epitheliale Eigenschaften, nachdem sie den Übergang vom Mesenchym zum Epithel durchlaufen haben, der zur Bildung von Kolonien mit kopfsteinpflasterartigen Zellen führt.

Diese Kolonien vermehren sich und erzeugen unregelmäßige zelluläre Massen von MET-Zellen. In den späteren Stadien der Reprogrammierung entstehen Kolonien vollständig reprogrammierter Zellen, individuell erkennbare Zellen mit genau definierten Grenzen. Diese vollständig reprogrammierten Zellen sind neben MET-Kolonien vorhanden, die zahlreicher sind.

Hier wird ein vollständig neu programmierter, isolierter, ausgereifter Klon gezeigt. Nach der iPSC-Derivation und -Reifung können sie einer detaillierten Charakterisierung unterzogen werden und die Differenzierung in eine Vielzahl von Zelltypen lenken. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit menschlichem Gewebe, das nicht auf das Vorhandensein von Krankheitserregern getestet wurde, äußerst gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie persönliche Schutzausrüstung und Arbeiten in der Biosicherheitswerkbank getroffen werden sollten.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Pluripotenz in fötalen Stammzellen induziert, welche Reagenzien und Geräte verwendet werden und wie man pluripotente Stammzellen routinemäßig kultiviert.