Reprogrammierung primäre Fruchtwasser und Membrane Zellen zur Pluripotenz in Xeno-freien Bedingungen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, induzierte pluripotente Stammzellen mithilfe einer episomalen Reprogrammierung aus zwei verschiedenen Arten von fetalen Stammzellen effizient zu gewinnen. Diese Methode kann dazu beitragen, eine Quelle für pluripotente Stammzellen für Gewebezüchtung, Krankheitsmodellierung, Grundlagenforschung oder Längsschnittstudien bereitzustellen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass die Reprogrammierung und die Reifung der iPSCs unter chemisch definierten Bedingungen erfolgen und somit frühzeitig für potenzielle zellbasierte Therapien im pädiatrischen Bereich zur Verfügung stehen.

Dieses Verfahren wird Steven McClellan, der leitende Wissenschaftler, und ich demonstrieren. Gewinnen Sie Plazenten so bald wie möglich nach der Geburt. Schneiden Sie ein neun Quadratzentimeter großes Segment des Amnions aus und waschen Sie es in einem 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen mit 30 Milliliter PBS, ergänzt mit antibiotischer und antimykotischer Lösung.

Entfernen Sie Blutgerinnsel von den Membranen und zerkleinern Sie die Membranen mit einem Paar feiner Skalpelle in einer sterilen 10-Zentimeter-Zellkulturschale zu feinen Stücken. Überführen Sie die zerkleinerte Membrangewebsmasse mit den Skalpellklingen in ein Gewebeverdauungsrohr, das 4,7 Milliliter RPMI-1640-Medium enthält. Geben Sie die Verdauungsenzyme hinzu und mischen Sie gut.

Befestigen Sie das Röhrchen am Gewebe-Disaggregator und führen Sie das Programm h_tumor_01 aus. Inkubieren Sie anschließend das Röhrchen 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius auf einer schwingenden Plattform. Verdünnen Sie die Suspension anschließend weiter mit 35 Milliliter RPMI-1640 und geben Sie sie auf einen 70-Mikrometer-Filter, der über ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen gestellt ist.

Zentrifugieren Sie fünf Minuten bei 200 × g bei Raumtemperatur. Nach dem Entsorgen des Überstandes das Pellet in fünf Milliliter RPMI-1640 resuspendieren und die Zellen mit einem Hämozytometer zählen. Die Zellen in Zellclustern mit einer Dichte von etwa 10.000 Zellen pro Quadratzentimeter in Zellkulturgefäße mit frisch zubereitetem AFMC-Medium, das mit Antibiotikum und Antimykotikum ergänzt ist, ausplattieren.

Gewinnen Sie Stammzellen aus Fruchtwasser und Fruchtblase mit niedriger Passagezahl zur Reprogrammierung aus einem T75-Fläschchen, indem Sie zwei Milliliter Enzym zur Zellablösung auf den Zellrasen geben. Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius für fünf bis acht Minuten. Nach der Zentrifugation bei 200 × g für 45 Minuten resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter PBS und mischen gründlich, um Serumkomponenten zu entfernen.

Zählen Sie die Zellen mithilfe eines Hämozytometers. Anschließend stellen Sie die Zelldichte auf 100.000 Zellen pro Milliliter PBS ein und verteilen die Suspension gleichmäßig auf 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Stellen Sie die Mikrozentrifugenröhrchen in 5-Milliliter-Polystyrolröhrchen, um die Zentrifugation in einem herkömmlichen Schwenkrotor zu ermöglichen, und zentrifugieren Sie vier Minuten lang bei 200 × g und Raumtemperatur.

Nach dem Zentrifugieren drehen Sie die Röhrchen um und entsorgen Sie den Überstand in einen Abfallbehälter. Führen Sie anschließend einen weiteren Zentrifugationsschritt bei 200 × g für drei Minuten durch. Nach dem Zentrifugieren verwenden Sie eine 200-Mikroliter-Pipette, um die restliche Flüssigkeit vorsichtig aus den Röhrchen zu aspirieren. Stellen Sie Transfektionspipettenspitzen, Röhrchen, Resuspendierpuffer und elektrolytischen Puffer in den Zellkulturwerkbank ein.

Bewegen Sie das Transfektionsgerät so nah heran, dass seine Röhrchenstation direkt in den Schrank gestellt werden kann. Füllen Sie ein Transfektionsröhrchen mit drei Milliliter Elektrolytpuffer und setzen Sie das Röhrchen in die Station ein, indem Sie es vollständig in den Schlitz schieben. Entnehmen Sie zuvor vorbereitete Aliquote der Reprogrammierungs-Plasmidlösung aus der Lagerung bei minus 80 Grad Celsius und lassen Sie sie bei Raumtemperatur im Kulturschrank auftauen.

Stellen Sie die Transfektionsparameter am Gerät so ein, dass ein Impuls von 40 Millisekunden bei 950 Volt abgegeben wird. Resuspendieren Sie das Pellet, das 100.000 Zellen enthält, in 10 Mikroliter Resuspensionspuffer. Geben Sie schnell 1/10 der Reprogrammierungs-Plasmidlösung zu den resuspendierten Zellen hinzu.

Befestigen Sie die Transfektionsspitze an der Transfektionspipette. Saugen Sie dann die Zellsuspension vorsichtig in die Transfektionsspitze auf, wobei die Bildung von Luftblasen vermieden werden sollte. Führen Sie die Transfektionspipette in das Transfektionsröhrchen ein.

Drücken Sie die Starttaste auf dem Bildschirm des Transfektionsgeräts. Warten Sie auf die Bildschirmmeldung zur erfolgreichen Durchführung der Transfektion. Entfernen Sie dann sofort die Pipette aus dem Reaktionsgefäß.

Bringen Sie die Suspension in ein Loch der Ziel-6-Loch-Platten aus. Mischen Sie sie mit dem Medium aus einem benachbarten Loch und verteilen Sie die Suspension gleichmäßig auf beide Löcher. Wiederholen Sie die Transfektion für jedes Mikrozentrifugenröhrchen mit Zellen.

Beginnen Sie damit, 30 Mikroliter einer 0,5 Millimolar EDTA-Lösung und PBS zu fünf PCR-Röhrchen hinzuzufügen. Danach setzen Sie eine Spitze auf eine 10-Mikroliter-Pipette, die auf zwei Mikroliter eingestellt ist. Halten Sie die Pipettenspitze schräg am Rand der Kolonie und kratzen Sie vorsichtig und allmählich die gesamte Kolonie von der Oberfläche ab.

Aspirieren Sie sofort die gesamte Kolonie in die Pipettenspitze und überführen Sie sie in eines der vorbereiteten PCR-Röhrchen mit EDTA. Wiederholen Sie den Vorgang mit vier weiteren Kolonien und inkubieren Sie anschließend vier bis sechs Minuten bei Raumtemperatur. Verwenden Sie eine größere Pipettenspitze, um jede Zellsuspension vorsichtig mehrmals auf- und abzupipettieren, um die Kolonie in kleinere Zellhaufen aufzubrechen.

Vermeiden Sie die Herstellung einer Einzelzell-Suspension. Anschließend die Suspension direkt in die Zielmulde einer mit rekombinantem Vitronectin beschichteten 24-Loch-Platte geben. Nach Wiederholung des Vorgangs für die verbleibenden Kolonien drei bis sechs Tage inkubieren.

Nach vier bis sechs Tagen, wenn die Kolonien gewachsen und kompakt geworden sind, waschen Sie die Zellschichten mit 300 Mikrolitern 0,5 Millimolar EDTA und aspirieren Sie diese sofort. Anschließend fügen Sie weitere 300 Mikroliter hinzu und inkubieren fünf Minuten bei Raumtemperatur. Nach dem Absaugen des EDTA stellen Sie eine Ein-Milliliter-Pipette auf maximale Kapazität ein, setzen eine Ein-Milliliter-Weitbohrspitze auf und aspirieren E8-Medium aus dem Zielbrunnen einer mit Vitronectin beschichteten Sechs-Well-Platte.

Spritzen Sie einen Strahl des Mediums auf eine Vertiefung der Quellplatte, um die iPSC-Kultur abzuwaschen. Überführen Sie dann die Suspension in die Zielvertiefung und pipettieren Sie mehrmals auf und ab, um die Kolonien in Klumpen von 20 bis 40 Zellen zu zerlegen. Stellen Sie nach dem Ansäen aller Zellen sicher, dass die Klumpen gleichmäßig verteilt sind, indem Sie die Platte vorsichtig schaukeln und schütteln.

Bringen Sie die Platte anschließend zur Anheftung der Zellklumpen und zum Koloniewachstum in den Inkubator zurück. Die Stammzellen aus Fruchtwasser und Fruchtblase, die als Ausgangszellen für die Reprogrammierung dienen, weisen eine typische mesenchymale Morphologie auf, die gestreckt und phasenhell ist. Die Zellen erwerben epitheliale Eigenschaften, nachdem sie den mesenchymal-epithelialen Übergang durchlaufen haben, was zur Bildung von Kolonien mit kieselsteinartigen Zellen führt.

Diese Kolonien proliferieren und bilden unregelmäßige zelluläre Verbände aus MET-Zellen. In den späteren Stadien der Reprogrammierung entstehen Kolonien vollständig reprogrammierter Zellen, die einzeln erkennbar sind und klar definierte Grenzen aufweisen. Diese vollständig reprogrammierten Zellen liegen neben zahlreicheren MET-Kolonien vor.

Hier ist ein vollständig reprogrammierter, isolierter, ausgereifter Klon dargestellt. Nach der Herleitung und Reifung von iPSCs können diese einer detaillierten Charakterisierung unterzogen und gezielt zur Differenzierung in eine Vielzahl von Zelltypen angeregt werden. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit menschlichem Gewebe, das nicht auf das Vorhandensein von Krankheitserregern getestet wurde, äußerst gefährlich sein kann, und dass stets Vorsichtsmaßnahmen wie der Einsatz persönlicher Schutzausrüstung sowie die Arbeit im Biosicherheitswerkbank getroffen werden sollten, während dieses Verfahren durchgeführt wird.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Pluripotenz in fötalen Stammzellen induziert, welche Reagenzien und Geräte verwendet werden müssen und wie man pluripotente Stammzellen routinemäßig kultiviert.