MRNA Interactome Capture aus Pflanzenprotoplasten

Das übergeordnete Ziel dieser optimierten mRNA-Interaktom-Erfassung ist es, ein mRNA-gebundenes Proteom aus Pflanzenzellen zu isolieren und zu identifizieren. Diese Methode wird auf mesophile Protoplasten von Arabidopsis thaliana angewendet, einen Zelltyp, der als vielseitiges Werkzeug in verschiedenen zellulären Assays verwendet wird. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der posttranskriptionellen Genregulationsimplantate zu beantworten, wie z.B. die Entdeckung und das Verständnis der Rolle von pflanzlichen Botenstoffen, RNA-bindenden Proteinen.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie einen Pflanzenboten auf einem gebundenen Proteom direkt aus der physiologischen Umgebung isolieren und identifizieren kann. Diese Methode kann also Einblicke in das Boten-RNA-gebundene Protein aus mesophilen Protoplasten der Aribidopsis-Blätter geben. Es kann auch auf andere Systeme wie Protoplasten oder Gewebe anderer Pflanzen angewendet werden.

Die Idee zu dieser Methode hatten wir, als wir feststellten, dass sie erfolgreich auf Hefe- und Säugetierzelllinien angewendet wurde. Arabidopsis-Blatt-Mesophilen-Protoplasten für zwei verschiedene Proben isolieren, wie im Textprotokoll beschrieben. Bewahren Sie die Kontrollprobe, die nicht UV-vernetzt ist, oder die Nicht-CL-Probe auf Eis auf.

Die zu vernetzende Protoplastensuspension oder CL-Probe wird in eine große Petrischale gegeben. Geben Sie 30 Milliliter eiskalte MMG-Lösung in die Schale, um die Oberfläche zu bedecken und die Zellen durch sanftes Pipettieren zu verteilen. Decken Sie die Petrischale mit Aluminiumfolie ab, wenn sie zum UV-Vernetzungsgerät transportiert wird.

Legen Sie die geöffnete Petrischale sofort in ein UV-Vernetzungsgerät. Achten Sie darauf, dass der Abstand zwischen der Schale und der UV-Lampe acht Zentimeter beträgt, und bestrahlen Sie die Probe dann eine Minute lang. Danach aliquotieren Sie die Protoplastensuspension aus der Petrischale schnell in zwei neue 50-Milliliter-Röhrchen mit rundem Boden.

Waschen Sie den Boden der Schale mit weiteren fünf Millilitern der eiskalten MMG-Lösung, um den Rest der Protoplasten aufzufangen. Teilen Sie die Suspension auf die beiden Rohre auf. Als nächstes zentrifugieren Sie das Nicht-CL-Röhrchen und zwei CL-Probenröhrchen bei 100-facher g bei vier Grad Celsius für fünf Minuten.

Nachdem Sie den Überstand entsorgt haben, legen Sie das Röhrchen mit dem Nicht-CL-Pellet wieder auf Eis. Geben Sie 10 Milliliter eiskalte MMG-Lösung in jedes CL-Probenröhrchen und schütteln Sie die Röhrchen vorsichtig, um die Pellets wieder zu suspendieren. Nachdem die beiden Proben in einem 50-Milliliter-Röhrchen mit rundem Boden kombiniert wurden, zentrifugieren Sie fünf Minuten lang bei 100 mal g bei vier Grad Celsius.

Nachdem Sie den Überstand entsorgt haben, bewahren Sie das Pellet auf Eis auf. Geben Sie dann neun Milliliter eiskalten Lyse-Bindungspuffer zu den Zellpellets jeder Probe. Lysieren Sie die Protoplasten, indem Sie etwa zwanzig Mal auf und ab pipettieren, bis die Lösung eine homogene hellgrüne Farbe hat.

Zur Homogenisierung wird das Protoplastenlysat zweimal mit einer schmalen Nadel durch eine 50-Milliliter-Glasspritze geleitet und anschließend zehn Minuten lang auf Eis inkubiert. Frieren Sie die Proben in flüssigem Stickstoff ein und lagern Sie sie bis zu drei Wochen bei minus 80 Grad Celsius. Nachdem Sie das Röhrchen mit gefrorenem Protoplastenlysat bei Raumtemperatur aufgetaut haben, halten Sie das Röhrchen auf Eis.

Aliquotieren Sie 1,8 Milliliter oligo-d(T)magnetische Kügelchen in sechs neue Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit rundem Boden, die auf Eis gestellt werden. Waschen Sie die Perlensuspension in jedem Röhrchen mit 600 Mikrolitern Lysebindungspuffer, indem Sie kurz auf und ab pipettieren und die Kügelchen zwei Minuten lang vorsichtig auf einem Rotator drehen. Bewahren Sie die Perlen auf Eis auf.

Legen Sie dann alle sechs Röhrchen mit den Kügelchen für mindestens drei Minuten in ein Magnetgestell, um genügend Zeit für die vollständige magnetische Erfassung zu haben. Wenn die Kügelchen vollständig eingefangen sind, wird die Suspension klar. Verwerfen Sie dann den Überstand aus allen sechs Röhrchen und aliquotieren Sie sofort neun Milliliter Protoplastlysat in sie.

Mischen Sie die Kügelchen durch Pipettieren mit Lysat, bis die Suspension braun und homogen erscheint. Inkubieren Sie die Röhrchen eine Stunde lang bei vier Grad Celsius bei sanfter Rotation. Legen Sie die Röhrchen nach der Inkubation für drei Minuten wieder in das Magnetgestell.

Wenn alle Kügelchen an der Seite der Röhrchen aufgefangen sind, sammeln Sie den Überstand mit dem Protoplastenlysat in sechs neuen Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit rundem Boden. Geben Sie als Nächstes 1,5 Milliliter eiskalten Waschpuffer in jedes Röhrchen mit den Kügelchen und resuspendieren Sie die Kügelchen durch Pipettieren. Legen Sie die Röhrchen nach einer Minute sanfter Drehung für drei Minuten wieder in das Magnetgestell.

Entsorgen Sie den Überstand und wiederholen Sie diesen Waschschritt einmal. Wiederholen Sie mit 1,5 Millilitern eiskaltem Waschpuffer zwei den gleichen Waschvorgang zweimal. Wenn die mRNPs effizient aus dem Protoplastenlysat isoliert wurden, sollte in der CL-Probe ein Halo um das Bead-Pellet sichtbar sein.

Zum Schluss wiederholen Sie den Waschvorgang einmal mit 1,5 Millilitern eiskaltem Salzpuffer. Geben Sie nach dem Waschen 500 Mikroliter Elutionspuffer in jedes Röhrchen und suspendieren Sie die Kügelchen vorsichtig durch Pipettieren. Inkubieren Sie drei Minuten lang bei 50 Grad Celsius, um die Poly-A-Schwanz-RNAs freizusetzen.

Hängen Sie die Kügelchen vorsichtig wieder auf, indem Sie sie einmal pipettieren, und legen Sie die Röhrchen wieder für fünf Minuten bei vier Grad Celsius in das Magnetrack. Übertragen und kombinieren Sie die Eluenten aus allen sechs Röhrchen in ein 15-Milliliter-Röhrchen mit konischem Boden, das auf Eis gestellt wird. Dabei erhalten Sie etwa drei Millimeter des Eluenten.

Die Qualität und Quantität der RNA kann sofort mit einem Spektralphotometer bestimmt werden. Bereiten Sie die Oligo-d(T)-Kügelchen für die Wiederverwendung vor, indem Sie sie zweimal mit einem Milliliter eiskaltem Elutionspuffer waschen. Waschen Sie sie danach mit einem Milliliter eiskaltem Lyse-Bindungspuffer, um die Salzkonzentration wieder auf 500 Millimolar einzustellen.

Verwenden Sie diese gewaschenen Oligo-d(T)-Kügelchen, um die Bindungs-, Wasch- und Elutionsvorgänge für zwei weitere Runden zu wiederholen. Dadurch werden die Poly-A-Schwanz-RNAs aus dem Protoplastenlysat abgebaut und es ergeben insgesamt neun Millimeter Eluent für jede Probe. Perlen können maximal dreimal gelagert und für ein anderes Experiment verwendet werden.

Um die RNA auf ihre Qualität zu testen, verdauen Sie die UV-vernetzten Proteine mit Proteinase-K-Lösung gemäß dem Textprotokoll. Reinigen Sie dann die RNA mit dem RNA-Aufreinigungskit, um alle verbleibenden Verunreinigungen zu entfernen. Nach der Aufreinigung sind die Proben bereit für den RNA-Qualitätstest mittels qRT-PCR.

Beginnen Sie mit der Behandlung von acht Millilitern jeder Probe mit 100 Einheiten RNAse Cocktail, der RNAse A und RNAse T1 enthält. Nach kurzem Vortexen inkubieren Sie die Proben eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius. Um mRNA-bindende Proteine (mRBPs) zu konzentrieren, filtern Sie die Proben mit Zentrifugalfiltereinheiten. Jede Probe ergibt 75 Mikroliter mit zwei Mikrogramm Protein.

Für die Langzeitlagerung frieren Sie die Proben bei minus 80 Grad Celsius ein. Um ein SDS-Page-Gel zu verwenden, mischen Sie 25 Mikroliter jeder konzentrierten Probe mit 15 Mikrolitern 2X Ladefarbstoff und erhitzen Sie die Proben fünf Minuten lang bei 95 Grad Celsius. Laden Sie die Proben in einen Proteinmarker auf ein SDS-Seitengel mit einem fünfprozentigen Stapelgel und einem zwölfprozentigen Auflösungsgel.

Waschen Sie das Gel anschließend zweimal fünf Minuten lang pro Waschgang mit Reinstwasser. Verwende ein handelsübliches Silberfärbeset, um das Gel zu färben. Wenn die ausreichende Anzahl von Ausgangsprotoplasten verwendet wurde, werden die Proteinbanden innerhalb von fünf Minuten angezeigt.

Um die mRBPs weiter zu testen, reinigen Sie die Peptide aus einem zweiten 1D-Page-Gel, wie im Textprotokoll erklärt. Diese gereinigten Peptide können nun durch Nano-Umkehrphasen-Flüssigkeitschromatographie, Massenspektrometrie sowie qualitative und quantitative Proteomik analysiert werden. Nach der Oligo-d(T)bead-Erfassung zeigte die qRT-PCR signifikant höhere Spiegel an Polyubiquitin 10-Referenz-mRNA im Vergleich zu 18S rRNA.

Da Oligo-d(T)-Kügelchen nur an Poly-A-Schwanz-RNA binden, deutet dies darauf hin, dass mRNAs im Eluenten angereichert sind. Die Erfassung von mRBPs durch Oligo-d(T)-Kügelchen wird weiter durch ein silbergefärbtes SDS-Page-Gel untersucht. Das Gel zeigt eine signifikant höhere Proteinmenge in der UV-vernetzten CL-Probe im Vergleich zur unvernetzten Nicht-CL-Probe.

Die Dauer der UV-Bestrahlung kann die Effizienz der Vernetzung beeinflussen. Dieses silbergebeizte SDS-Page-Gel bestätigt, dass eine oder drei Minuten UV-Bestrahlung die optimale Bedingung mit den stärksten Bandenintensitäten sind. Insgesamt wurden 325 Proteine durch quantitative Proteomik-Analyse identifiziert.

225 dieser Proteine lagen unter dem Signifikanzniveau, da für jedes Protein nur geringe Peptide vorhanden waren und die Peptidintensitäten sehr variierten. Da sie jedoch alle nur in CL-Proben qualitativ nachgewiesen wurden, wurden sie alle als positive Ergebnisse gewertet. Diese 325 Proteine wurden weiter in drei Kategorien eingeteilt: ribosomale Proteine, Haupt-RBPs und Kandidaten-RBPs.

Den RBPs fehlen konventionelle RNA-Bindungsdomänen und die meisten ihrer Rollen wurden nicht validiert, was auf mögliche neue Funktionen bei der RNA-Regulation hindeutet. Einmal gemeistert, kann diese Technik in einer Woche durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der molekularen Regulationswege in Pflanzen, um das genomweite Boten-RNA-gebundene Proteom in Zellen und Geweben von Dikotyledonen und Monokotyledonen zu erforschen.