Hochauflösende Schmelz-PCR für Komplement-Rezeptor 1 Länge Polymorphismus Genotypisierung: Ein innovatives Werkzeug für die Alzheimer-Krankheit Gen-Anfälligkeits-Assessment

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, Komplementrezeptor-1-Längenpolymorphismen für die Beurteilung der Anfälligkeit für Krankheiten, wie z.B. die Alzheimer-Krankheit, zu genotypisieren, um die Rolle von CR1-Isoformen in der Krankheitspathogenese besser zu verstehen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Neurowissenschaften zu beantworten, wie z. B. die Pathogenese der Alzheimer-Krankheit. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass keine frischen Blutproben erforderlich sind und sie einfacher, billiger, schneller und daher für größere Bevölkerungsgruppen anwendbar ist.

Die Idee zu dieser Methode kam uns, als wir die Herausforderungen bei der Durchführung von Western Blots hinsichtlich des Zeitaufwands und des Bedarfs an frischen Blutproben erkannten. Pipettieren Sie 20 Mikroliter Proteinase K in den Boden eines 1,5-Milliliter-Röhrchens. Geben Sie dann 200 Mikroliter Probe in das Röhrchen.

Geben Sie 200 Mikroliter Lysepuffer in die Probe. Mischen Sie durch Pulswirbeln für 15 Sekunden. Nach dem Mischen bei 56 Grad Celsius 10 Minuten im Wasserbad inkubieren.

Zentrifugieren Sie das 1,5-Milliliter-Röhrchen kurz, um die Tropfen von der Innenseite des Deckels zu entfernen. Geben Sie dann 100 Mikroliter Ethanol in die Probe. Mischen Sie erneut durch Pulswirbelwirbeln für 15 Sekunden, bevor Sie das Röhrchen wie zuvor kurz zentrifugieren.

Tragen Sie anschließend die Mischung vorsichtig in einem Zwei-Milliliter-Auffangröhrchen auf die Membransäule auf. Ohne den Rand zu benetzen, den Deckel schließen und eine Minute lang bei 6.000 G zentrifugieren. Legen Sie die Membransäule in ein sauberes Zwei-Milliliter-Sammelröhrchen und entsorgen Sie das Röhrchen mit dem Filtrat.

Öffnen Sie vorsichtig die Membransäule und fügen Sie 500 Mikroliter Waschpuffer eins hinzu, ohne den Rand zu benetzen. Schließen Sie die Kappe und zentrifugieren Sie eine Minute lang bei 6.000 Mal G. Legen Sie dann die Membransäule in ein sauberes Zwei-Milliliter-Sammelröhrchen und entsorgen Sie das Röhrchen mit dem Filtrat.

Nach vorsichtigem Öffnen der Membransäule 500 Mikroliter Waschpuffer zwei hinzufügen, ohne den Rand zu benetzen. Schließen Sie die Kappe und zentrifugieren Sie sie drei Minuten lang bei 20.000 Mal G. Legen Sie dann die Membransäule in ein neues Zwei-Milliliter-Sammelröhrchen und zentrifugieren Sie erneut.

Legen Sie die Membransäule nach der Zentrifugation in ein sauberes 1,5-Milliliter-Röhrchen und entsorgen Sie das Sammelröhrchen mit dem Filtrat. Öffnen Sie vorsichtig die Membransäule und fügen Sie 200 Mikroliter destilliertes Wasser hinzu. Die Säule wird fünf Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert, bevor sie eine Minute lang bei 6.000-facher G zentrifugiert.

Um das HRM-PCR-Protokoll durchzuführen, verdünnen Sie zunächst die DNA-Proben in 1,5-Milliliter-Röhrchen mit Wasser auf eine Konzentration von 10 Nanogramm pro Mikroliter. Als nächstes verdünnen Sie die aufgetauten Primerlösungen in 1,5-Milliliter-Röhrchen mit Wasser auf die gleiche Konzentration von sechs Mikromolaren. Tauen Sie die HRM-PCR-Kit-Lösungen auf und mischen Sie sie vorsichtig durch Vortexen, um die Rückgewinnung des gesamten Inhalts sicherzustellen.

Die drei Fläschchen mit der enzymatischen Mischung mit DNA-Bindungsfarbstoff, Magnesiumchlorid und Wasser in einer Mikrozentrifuge kurz drehen, bevor Sie sie öffnen. Verwenden Sie die Komponenten in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen bei Raumtemperatur, um den PCR-Mix für die 120-Mikroliter-Reaktion vorzubereiten, wie im Textprotokoll beschrieben. Vorsichtig durch Vortexen mischen.

Es ist wichtig, dass Sie mit Aufmerksamkeit und Anwendung nach den guten Praktiken in der Molekularbiologie arbeiten. Pipettieren Sie 19 Mikroliter der PCR-Mischung in jede Vertiefung einer weißen Multi-Well-Platte. Fügen Sie einen Mikroliter des konzentrationsangepassten DNA-Templates hinzu und verschließen Sie dann die weiße Multi-Well-Platte mit Siegelfolie.

Zentrifugieren Sie die weiße Multiwell-Platte eine Minute lang bei 1.500 mal G in einer Standard-Ausschwingzentrifuge, die einen Rotor für Multi-Well-Platten mit geeigneten Adaptern enthält. Legen Sie die weiße Multiwell-Platte in das HRM-PCR-Gerät ein. Starten Sie das HRM-PCR-Programm mit den PCR-Bedingungen, die im Textprotokoll zu finden sind.

Führen Sie nach der HRM-PCR-Reaktion eine HRM-Analyse durch, um den CR1-Längenpolymorphismus zu bestimmen, wie im Textprotokoll beschrieben. Die Fusionskurven wurden mit der Software nach dem hochauflösenden Schmelzen der PCR-abgeleiteten Amplikons aus der genomischen DNA von Probanden mit unterschiedlichen CR1-Isoformen analysiert. Das Ergebnis sind Kurven, die Probanden nach ihren allotypischen CR1-Expressionsphänotypen unterscheiden.

Wie die beiden Darstellungsmodi, die normalisierten und verschobenen Schmelzkurven und das Diagramm der normalisierten und temperaturverschobenen Differenz, zeigen, sind die Kurvenprofile entsprechend dem CR1-Stern drei, dem CR1-Stern einer Gruppe, dem CR1-Stern eins, der CR1-Stern zwei Gruppe, dem CR1 Stern einer Gruppe, der CR1 Stern zwei Gruppe und dem CR1 Stern zwei verteilt. CR1 Stern vier Gruppe. Diese Kurven entsprechen den CR1-Längenpolymorphismus-Allelen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie den CR1-Längenpolymorphismus anhand perfekter Kurven, die durch HRM-PCR erhalten wurden, einfach genotypisieren können.

Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, da Referenzproben von bereits bekannten CR1-Längengenotypen benötigt werden. Wenn diese Technik gemeistert wird, kann sie in vier Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Wenn Sie dieses Verfahren ausprobieren, ist es wichtig, daran zu denken, für jede DNA-Probe die gleiche Konzentration zu verwenden.

Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie die konische DNA-Sequenzierung durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B. die Entdeckung eines neuen bekannten privaten SNP. Nach dieser Entwicklung ebnet diese Technik den Weg für Forschungen auf dem Gebiet der Populationsgenetik, den Selektionsdruck von Krankheitserregern im CR1-Längenpolymorphismus zu erforschen. Obwohl diese Methode einen Einblick in die Anfälligkeit für die Pathogenese der Alzheimer-Krankheit geben kann, kann sie auch auf andere Studien zu Krankheiten wie systemischem Lupus erythematodes und Malaria angewendet werden.