Eine Filtrations-basierte Methode zur Herstellung von hochwertigen Nuklei aus vernetzten Skelettmuskeln für Chromatin-Immunpräzipitation

Das übergeordnete Ziel dieses experimentellen Verfahrens ist es, die Präparation hochwertiger Zellkerne aus vernetzten Skelettmuskeln zu ermöglichen, die dann für Chromatin-Immunpräzipitationsstudien verwendet werden können. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Muskel- und zirkadianen Bereich zu beantworten, wie z. B. genomische Studien mit Muskelgeweben und -zellen in zirkadianen oder anderen zeitkritischen Kontexten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine sofortige Vernetzung von Proben ermöglicht und das filtrationsbasierte Verfahren zuverlässig durchgeführt werden kann, um hochwertige Zellkerne mit minimaler Myofibrillenkontamination zu isolieren.

Obwohl diese Methode Einblicke in die Skelettmuskulatur geben kann, kann sie auch auf andere Systeme wie Herz- und glatte Muskeln angewendet werden. Wiegen und zerkleinern Sie die Skelettmuskulatur der hinteren Gliedmaßen, die von etwa 20 Wochen alten schwarzen C57-Mäusen isoliert wurde, in eiskalter, phosphatgepufferter Kochsalzlösung, wie zuvor beschrieben. Legen Sie das gehackte Skelettmuskelgewebe in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen mit 10 Millilitern PBS auf Eis.

Zentrifugieren Sie die Probe dann bei 300 mal g bei vier Grad Celsius für fünf Minuten. Entfernen Sie vorsichtig den PBS-Überstand durch Aspiration. Schätzen Sie das Pelletvolumen in jedem 50-Milliliter-Rohr, indem Sie Referenzröhrchen mit einem, zwei, drei und vier Millilitern Wasser verwenden.

Fügen Sie sieben Volumen eiskaltes 1%iges Formaldehyd und PBS hinzu und homogenisieren Sie die Proben auf Eis mit einem Sondengewebehomogenisator. Als nächstes vernetzen Sie die Probe, indem Sie sie 10 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren. Die Vernetzungsreaktion wird durch Zugabe von einem molaren Glycin auf eine Endkonzentration von 0,125 molar gestillt, gefolgt von einer fünfminütigen Inkubation bei Raumtemperatur.

Nach dem Zentrifugieren der Probe bei 3.000 g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius wird der Überstand durch Aspiration entfernt. Spülen Sie das Pellet aus, indem Sie es in 10 Millilitern eiskaltem Basenpuffer resuspendieren, der frisch hinzugefügte Proteasehemmer enthält. Die Probe wird erneut zentrifugiert und der Überstand vorsichtig durch Aspiration entfernt.

Dann resuspendieren Sie das Pellet in sechs Millilitern Lysepuffer, der frisch hinzugefügte Proteasehemmer enthält. Die Probe wird in einen vorgekühlten 15-Milliliter-Dounce-Homogenisator umgefüllt und 10 Minuten auf Eis inkubiert. Homogenisieren Sie jede Probe auf Eis mit 15 langsamen Hüben mit einem losen Stößel, gefolgt von 15 Hüben mit einem festen Stößel, um die Zellkerne freizusetzen.

Die folgenden Filtrationsschritte sind der Schlüssel zur Isolierung hochwertiger Zellkerne. Das Homogenat durch ein Zellsieb filtrieren und mit vier Millilitern Lysepuffer spülen. Zentrifugieren Sie dann die Proben bei 1.000 mal g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius.

Das Pellet in fünf Millilitern eiskaltem Basenpuffer resuspendieren und 10 Mal mit einem festen Stößel dämpfen, um die Kerne freizusetzen. Filtrieren Sie dann die Suspension durch ein Zellsieb und spülen Sie das Röhrchen mit zwei Millilitern Basenpuffer und filtrieren Sie erneut. Wiederholen Sie die Filtration mit Zellsieben mit allmählich reduzierter Porengröße.

Zum Schluss zentrifugieren Sie bei 1.000 mal g bei vier Grad Celsius für 10 Minuten. Entfernen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Pellet in 500 Mikrolitern Basenpuffer, bevor Sie es erneut zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand und lagern Sie das Pellet bei minus 80 Grad Celsius.

Tauen Sie die Proben in 500 Mikrolitern SDS-Lysepuffer auf und resuspendieren Sie sie durch sanftes Pipettieren. Übertragen Sie die DNA-Suspension der Kerne in ein Glasfläschchen auf Eis. Die Wahl der richtigen Beschallungsplattform und -bedingungen ist entscheidend für die Chromatinvorbereitung aus isolierten Zellkernen.

Führen Sie die Beschallung mit fokussierten Ausbrüchen akustischer Ultraschallenergie von einem scheibenförmigen Wandler unter Verwendung der im Textprotokoll beschriebenen Einstellungen durch. Übertragen Sie das beschallte Chromatin in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen. Dann zentrifugieren Sie 15 Minuten lang bei 12.000 g und überführen den Überstand in ein neues Röhrchen.

Als nächstes werden 50 Mikroliter der beschallten Probe in ein neues 1,5-Milliliter-Röhrchen für die Rückvernetzung über Nacht bei 65 Grad Celsius überführt. Die Entnahme der DNA-Proben wird im folgenden Abschnitt beschrieben. Nach Auswertung der Beschallung und Quantifizierung, wie im Textprotokoll beschrieben, aliquotiert das aufgetaute Chromatin auf etwa 100 bis 120 Mikrogramm pro Röhrchen.

Verdünnen Sie dann das Chromatin eins bis 10 mit Immunpräzipitationspuffer. Als nächstes fügen Sie 40 Mikroliter einer 50%igen Aufschlämmung BSA-vorblockierter Protein-HE-Agarose oder IgY-Kügelchen hinzu und inkubieren Sie drei Stunden lang bei vier Grad Celsius auf einem Rotator. Nachdem Sie die Probe 10 Minuten lang bei 1.000 g Probe zentrifugiert haben, wird der Überstand vorsichtig in neue Röhrchen überführt.

Fügen Sie dann Antikörper in einer Menge von einem Mikrogramm Antikörper pro 25 bis 100 Mikrogramm Chromatin-DNA hinzu. Über Nacht sanft bei vier Grad Celsius und ca. 15 U/min drehen. Fügen Sie dann 10 Mikroliter BSA-vorblockiertes Protein, HE, Agarose oder IgY-Kügelchen hinzu und mischen Sie.

Drehen Sie die Perlensuspension zwei Stunden lang im Kühlraum. Waschen Sie die Kügelchen anschließend mit RIPA-Puffer, gefolgt von Puffer mit hohem Salzgehalt, Lithiumchloridpuffer und Tris EDTA, wie im Textprotokoll beschrieben. Nach dem Waschen eluieren Sie die DNA aus den Kügelchen, indem Sie zuerst eine Minute lang bei 1.000 g zentrifugieren und den Überstand vorsichtig entfernen.

Resuspendieren Sie die Kügelchen mit 50 Mikrolitern Elutionspuffer. Dann 10 Minuten bei 65 Grad Celsius inkubieren. Nach der Inkubation fünf Minuten lang bei 12.000 g zentrifugieren.

Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie weitere 50 Mikroliter Elutionspuffer hinzu, bevor Sie erneut fünf Minuten lang bei 12.000 g zentrifugieren. Das endgültige Elutionsvolumen beträgt 100 Mikroliter. Um die Vernetzung umzukehren und eine DNA-Elution durchzuführen, inkubieren Sie das eluierte Chromatin zunächst über Nacht bei 65 Grad Celsius.

Fügen Sie dann einen Mikroliter RNase A hinzu, bevor Sie 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius inkubieren. Anschließend mit acht Mikrolitern 10 Milligramm pro Milliliter Protease K für 30 Minuten bei 55 Grad Celsius inkubieren. Ernten Sie die DNA mit einem PCR-Cleanup-Kit mit einem Elutionsvolumen von 50 Mikrolitern gemäß dem Protokoll des Herstellers.

Analysieren Sie abschließend die Profile durch Echtzeit-QPCR, wie zuvor beschrieben. Die sequentielle Filtration entfernte effektiv Gewebereste. Zum Vergleich werden hier repräsentative Bilder von Proben nach der Erstfiltration und nach der Serienfiltration gezeigt.

Die progressive Chromatinzerkleinerung durch 10 Zyklen der Beschallung wird durch das Ausführen eines Agarosegels nachgewiesen. 10 Zyklen der Beschallung mit dem verdauten Chromatin führten zu einer DNA von etwa 500 Basenpaaren. Hier sind repräsentative QPCR-Ergebnisse für B-Männchen mit Skelettmuskelproben von Mäusen gezeigt, die an ZT6 und ZT18 gesammelt wurden.

Die Analyse der Elemente der Ddp-Positionen auf dem Ddp-Gen zeigte, dass die Bindung in Übereinstimmung mit früheren Ergebnissen bei etwa ZT6 ihren Höhepunkt erreicht. Einmal gemeistert, kann die Präparation der Zellkerne in fünf bis sechs Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die filtrationsbasierten Methoden zur Reinigung hochwertiger Zellkerne und Chromatin-DNA aus vernetztem Muskelgewebe einsetzen können.

Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, die Proben auf Eis oder in einem Kühlraum aufzubewahren und die Probenaliquote für die mikroskopische Überprüfung vor und nach den Filtrationsschritten aufzubewahren. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für die Forscher auf dem Gebiet der Muskel- und Genomik, um die zirkadiane oder zeitkritische Dynamik der Chromatin-Protein-Interaktion in verschiedenen Muskelgeweben zu erforschen. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie die chIP-Sequenzierung durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B. die Suche nach Mustern der Transkriptionsfaktorbindung im Muskelgewebe.