Elektrokrampftherapie Anfälle bei Ratten und Fraktionierung von ihren Hippocampi Beschlagnahme verursachten Veränderungen in den Proteinen der postsynaptischen Dichte prüfen

Elektrokrampftherapie Beschlagnahme (ECS) ist ein experimentellen Tiermodell der Elektrokrampftherapie für schwere Depressionen. ECS stimuliert weltweit Aktivität im Hippocampus, führt zu Synaptogenese und synaptische Plastizität. Hier beschreiben wir Methoden für ECS Induktion bei Ratten und subzellulären Fraktionierung von ihren Hippocampi, Beschlagnahme verursachten Veränderungen in synaptischen Proteine zu untersuchen.

Das übergeordnete Ziel der elektrokonvlusiven Anfallsinduktion und der anschließenden kleinskaligen Fraktionierung des Hippocampus ist es, die globale Anfallsaktivität im Rattengehirn zu induzieren und durch Anfallsaktivität induzierte Veränderungen von Proteinen in der postsynaptischen Dichte des Hippocampus zu untersuchen. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im neuronalen Prozess des Films zu beantworten, z. B. welche Snaptic-Proteine in bestimmten Gehirnregionen nach einem Anfall reguliert werden und ob eine solche Regulation zur Neuroplastizität beitragen kann. Der Hauptvorteil dieses Protokolls zur Induktion von Elektrokrampfanfällen besteht darin, dass wir eine lebendige Linderung der Gehirnaktivität des Gesetzesdons ohne neuronalen Tod induzieren können.

Das Verfahren wird von mir und Han Gil Jeong aus dem Labor von Dr. Hee Jung Chung demonstriert. Um diesen Vorgang zu beginnen, setzen Sie eine männliche Ratte in einen sauberen, leeren Käfig mit Deckel. Lassen Sie die Ratte 30 Minuten lang gewöhnen, dann stellen Sie den Impulsgenerator auf ECS-Induktion ein.

Bereiten Sie den Impulsgenerator vor, indem Sie die Reset-Taste drücken, und stellen Sie sicher, dass die Bereitschaftstaste leuchtet. Stellen Sie sicher, dass die Ohrclips nicht am Impulsgeber befestigt sind. Drücken Sie anschließend die Schocktaste einige Sekunden lang und stecken Sie dann die Ohrclips in den Impulsgenerator.

Befeuchten Sie in diesem Schritt die Ohrclips mit steriler Kochsalzlösung und stellen Sie sicher, dass sie gesättigt sind. Befeuchten Sie als Nächstes die Ohren der Ratte mit steriler Kochsalzlösung, indem Sie sie in mit Kochsalzlösung getränkte Gaze einwickeln. Sobald sie nass sind, entfernen Sie die Gaze.

Befestigen Sie die Clips an den Ohren mit einem Clip pro Ohr und positionieren Sie sie hinter dem Hauptknorpelband. Drücken Sie die Schocktaste für einige Sekunden und beobachten Sie den Anfall. Für den Schein, keine Anfallskontrolle, behandeln Sie die Ratte gleich, aber geben Sie den Strom nicht ab.

Wenn der Klonus beginnt, lösen Sie die Ohrclips und zeichnen Sie das Anfallsverhalten nach einer überarbeiteten Racine-Skala von eins bis fünf auf. Dazu gehören die Aufzucht mit viergliedrigem Klonus im vierten Stadium und das Aufziehen und Fallen mit viergliedrigem Klonus im fünften Stadium. Der Anfall sollte etwa 10 Sekunden dauern.

Zeichnen Sie die Dauer des Anfalls mit einem Timer auf. Bringen Sie die Ratte nach Beendigung des Anfalls in ihren Heimatkäfig zurück. Überwachen Sie die Ratte weitere fünf Minuten lang, um sicherzustellen, dass sie sich von den Anfällen erholt.

Bewahren Sie ihn einzeln im Käfig auf und bringen Sie den Käfig in den Aufwachraum zurück. Bei diesem Verfahren werden zwei Hippocampus von einer Ratte auf eine 30 Milometer große Gewebekulturschale gelegt und mit einer Schere in kleine Stücke zerkleinert. Danach werden die gehackten Hippocampi in einen manuellen Glashomogenisator umgefüllt und ein Milliliter eiskalter Homogenisierungspuffer hinzugefügt.

Geben Sie dann ein rundes Pezil in einen Glashomogenisator. Während der Glashomogenisator auf Eis steht, streichen Sie sanft und gleichmäßig auf dem Pezil auf und ab, 10 bis 15 Mal für eine Minute, bis kleine Stücke des Hippocampusgewebes verschwinden. Übertragen Sie dann den Homogenoten mit einer Ein-Milometer-Pipette in ein 1,7-Milometer-Mikrozentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie den Homogenoten bei 800 mal G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius, um den postnuklearen Überstand von dem Pellet zu trennen, das unlösliches Gewebe und Kerne enthält.

Übertragen Sie anschließend 50 Mikroliter und 950 Mikroliter der S1-Fraktion in zwei separate neue 1,7-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und lagern Sie diese Röhrchen auf Eis. Bewahren Sie auch das Pellet der P1-Fraktion auf Eis auf. Anschließend wird die 950-Mikroliter-S1-Fraktion 10 Minuten lang bei 13.800 G und vier Grad Celsius zentrifugiert, um den mit zytosolischen löslichen Proteinen angereicherten Überstand und das mit membrangebundenen Proteinen, einschließlich synaptosomaler Proteine, angereicherte Pellet zu trennen.

Die S2-Fraktion wird in eine neue 1,7-Milliliter-Mikrozentrifuge umgefüllt und auf Eis gelagert. Anschließend resuspendieren Sie das Pellet der P2-Fraktion in 498 Mikrolitern eiskaltem, gereinigtem Wasser. Fügen Sie zwei Mikroliter eines molaren Heepses hinzu, um eine Endkonzentration von vier millimolaren Heeps zu erreichen.

Die Suspension wird bei vier Grad Celsius unter Rühren 30 Minuten lang inkubiert. Lagern Sie die resuspendierte P2-Fraktion nach 30 Minuten auf Eis. In diesem Schritt wird die P2-Fraktion 20 Minuten lang bei 25.000 G und vier Grad Celsius zentrifugiert, um den lysierten Überstand und das lysierte Pellet zu trennen.

Die LS2-Fraktion wird in ein neues 1,7-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen umgefüllt und auf Eis gelagert. Dann resuspendieren Sie das LP1-Pellet in 250 Mikrolitern bei 50 Millimolaren Heeps, gemischt mit 250 Mikrolitern einem Prozent Reinigungsmittel und 1 X PBS. Die Suspension wird 15 Minuten lang bei vier Grad Celsius unter leichtem Rühren inkubiert.

Danach zentrifugieren Sie das resuspendierte LP1-Pellet 3 Stunden lang bei 25.000 G und vier Grad Celsius, um den Überstand der Nicht-PSD-Fraktion von dem Pellet der PSD-Fraktion zu trennen. Entfernen Sie den Überstand eines 1,7-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchens und resuspendieren Sie das PSD-Pellet in 100 Mikrolitern mit 50 Millimolaren Heeps. In dieser Abbildung zeigen die repräsentativen Western Blots die Proteinexpression der NMDA-rezeptiven Untereinheit GluN2B, des Ampa-Rezeptors, GluA2 und STEP 61 in den S2-, P2- und PSD-Fraktionen aus den Hippocampi von Ratten ohne Anfälle und Ratten, die ein akutes ECS erhielten.

Das zytoplasmatisch lösliche Protein alpha-Tubulin ist in der S2-Fraktion angereichert. Synaptophysin ist ein präsynaptisches Vesikelprotein und ist in der Rohmembran-P2-Fraktion, aber nicht in der PSD-Fraktion angereichert, während PSD-95 sowohl in der P2- als auch in der PSD-Fraktion angereichert ist. Hier ist die Quantifizierung von GluN2B und GluA2 in den P2- und PSD-Fraktionen drei und 24 Stunden nach akutem ECS dargestellt.

Die GluN2B- und GluA2-Expression in der P2-Fraktion wurde in der S2-Fraktion zu alpha-Tubulin normalisiert. In GluN2B und GluA2 war die Expression in der PSD-Fraktion auf PSD 95 normalisiert. Einmal gemeistert, kann diese Technik in fünf bis sechs Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Im Anschluss an dieses Verfahren kann eine Automasser-ähnliche Massenspektormetrie auf der Grundlage des Proteinmixes durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, welche anderen synaptischen Proteine durch ECS verändert werden. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der neurologischen Erkrankungen, um den zugrunde liegenden Mechanismus der synaptischen Dysfunktion zu erforschen, um Gesetzesverantwortung, die transformgenen Motoren neurologischer Erkrankungen, zu ermöglichen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man das ECS in Law-Dons induziert, eine Homogenisierung und PSD-Fraktionierung aus dem Hippocampus durchführt und Veränderungen von synaptischen Proteinen nach dem ECS untersucht.