Name: Intrasplenic Transplantation von Leberzellen nach teilweiser Hepatektomie in NOD. SCID-Mäuse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 24 s
Description: Erfahren Sie die intrasplenische Transplantation von Hepatozyten nach partieller Hepatektomie bei NOD.SCID-Mäusen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Zelleinwanderung und Proliferation bei zellbasierten Lebertherapien.

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Diese Arbeit wurde durch den Kern Grant erhielt von der Abteilung Biotechnologie, Regierung von Indien, dem nationalen Institut für Immunologie, Neu-Delhi unterstützt. Dr. Bhattacharjee aktuelle Adresse ist die Abteilung für Gastroenterologie, Hepatologie und Ernährung, Kinder Hospital Los Angeles.

Verfahren vorgestellt, die in diesem Protokoll wurden von der institutionellen Tier-Ethik-Kommission des nationalen Institut für Immunologie, Neu-Delhi genehmigt. Die serielle Nummer der Genehmigung ist OIEA #319/13.
Hinweis: Es gibt exzellente Ressourcen auf allgemeine Chirurgie Verfahren20 und spezifische Protokolle für Nager Chirurgie21. Für diejenigen, die tierischen Operation zum ersten Mal empfiehlt es sich ausgiebig üben chirurgische Eingriffe auf Attrappen vor Inbetriebnahme auf Tiere.
1. Vorbereitung
<ol><li>Halten Sie vor dem Experiment sterile Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) "oder" saline bereit.</li>
	<li>Montieren Sie eine Chirurgie-Kit mit Schere, gezahnte Pinzette Gewebe Zange, Baumwolle, Wattestäbchen, Nylonfäden und verschiedenen Mikro Nadelhalter. Autoklaven der Chirurgie-Kit. Besondere Sorgfalt sollte wenn ein immungeschwächter NICKEN. SCID-Maus wird in das Protokoll aufgenommen.</li>
	<li>Führen Sie das komplette experimentelle Verfahren, von der Vorbereitung bis zum Ende der Operation, in der Bio-Sicherheit Klasse I Schrank.</li>
	<li>Wiegen Sie ein NICKEN. SCID-Maus von ca. 6-8 Wochen vor der Operation. Mäuse mit einem Gewicht zwischen 14-18 g sind in dieser Studie verwendet.</li>
	<li>Rasur der oberen Mittel- und Hypochonder Bauchregion der Maus mit dem Haarschneidegerät. Gelten Sie Haare entfernen Creme gleichmäßig in der gesamten Region mit einem Spatel die abgeschnittenen Haare vollständig zu entfernen. Entfernen Sie die Haare vorsichtig mit Hilfe eines sterilen feuchten Baumwolltuch nach 2-5 Minuten.</li>
	<li>Platzieren Sie den Mauszeiger in der Kammer Isoflurane und schalte das Ventil der Sauerstoffflasche. Pflegen Sie die Sauerstoffzufuhr zum Preis von 4 L/min und Isofluran Verdampfung bei 4 %, Anästhesie zu induzieren.<ol>
<li>Stellen Sie sicher, dass die Maus richtig durch sanfte Zeh kneifen betäubt worden ist.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Legen Sie eine Operation Board innerhalb eines Biosafety Kabinett. Legen Sie das Tier auf dem Chirurgie-Brett, so dass der ventrale Teil der Maus nach oben zeigt und der vordere Teil der Maus sich im Inneren der Nase Kegel Isoflurane und Sauerstoff angeschlossen befindet.</li>
	<li>Isofluran Verdampfung auf 2 % zu reduzieren, und während des chirurgischen Verfahrens zu erhalten.</li>
	<li>Desinfizieren Sie die Haut von der Maus und durch Abwischen mit 70 % igem Ethanol getränkten sterilen Baumwolle zu sterilisieren.</li>
</ol>2. chirurgische Verfahren
<ol><li>
Partielle Hepatektomie
	<ol>
<li>Quereinschnitt von etwa 1 cm in der Haut direkt unter dem Brustbein, senkrecht an den Xiphoid Prozeß und Parallel zu den Brustkorb mit Hilfe der geraden OP Schere vornehmen.</li>
		<li>Trennen Sie vorsichtig die Haut mit der Bauchmuskel-Schicht in der Nähe der eingeritzten mit Pinzette oder sterilen angefeuchteten Wattestäbchen zu unterscheiden zwischen Haut und Bauchmuskulatur Schicht angebracht. Genießen Sie die intradermale Region mit PBS mit sterilen Wattestäbchen um Austrocknung zu entgehen.</li>
		<li>Setzen Sie Bereich der linke Lappen glatt durch eine quer Schnitt durch die Peritonealdialyse Schicht direkt unter dem Xiphoid aus. Verwenden Sie zwei angefeuchteten Wattestäbchen zu entlarven und heben Sie den linken Leberlappen.</li>
		<li>Platzieren Sie ein Wattestäbchen auf der Bauch-Seite des Schnitts, und legen Sie ein weiteres Wattetupfer auf die Membranseite. Vorsichtig drücken Sie die Spitze in Richtung der Membran platziert und geben Sie einen gleitenden Push durch die andere Spitze, heben Sie den linken Leberlappen.</li>
		<li>Stecke einen Nylonfaden mit einer Schleife durch die angehobene linke Lappen und schieben Sie die Schlaufe in Richtung zur Unterseite des linken Lappens in der Nähe der Hilum mit Hilfe der Mikro-Pinzetten oder Baumwolle-Tipps. Drücken Sie die Fadenschlinge Nylon vorsichtig an der Basis des linken Lappens.</li>
		<li>Binden Sie die beiden Enden der Nylonfaden über den oberen Teil der linken Lappen mit einem Mikrochirurgie Nadelhalter und Mikro Zange. Machen Sie zwei zusätzliche Knoten auf der anderen Seite.</li>
		<li>Der gebundene Lappen mit Hilfe der Schere zu sezieren. Versuchen Sie nicht, sehr nah an das Gewinde schneiden. Für den Fall, dass der Vorgang länger als 5 Minuten dauert, halten Sie die Bauchhöhle und die Organe feucht mit sterilen PBS, Austrocknung durch Flüssigkeitsverlust zu vermeiden.</li>
		<li>Nähen Sie das Peritoneum kontinuierliche näht mit einer 4: 0 Catgut Naht. Schließen Sie anschließend die Haut durch diskontinuierliche vernähen so schnell wie möglich.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Stammzelltransplantation Hinweis: Die GLP mit dem Ausdruck ihrer Hepatozyten wurden isoliert von transgenen Mäusen GFP (C57BL/6-Tg (UBC-GFP) 30 Scha/J), nach dem Verfahren von Lee Et al.beschrieben. 22 und Shen Et Al. 23 Hepatozyten-ähnliche Zellen (NeoHep) der menschlichen Ursprungs unterschieden von Monozyten24 dienten auch zur Transplantation. Jedoch können auch Zellen aus anderen Quellen im Protokoll verwendet werden.<ol>
<li>0,2 Millionen lebensfähige Zellen in rund 50 µL der Iscoves geändert Dulbecco Medium (IMDM) auszusetzen, und in einer 1 mL Insulin Spritze begrenzt mit 30 G Nadel Aspirieren. Halten Sie die Spritze kalt, indem es auf Eis.</li>
		<li>Platzieren Sie den Mauszeiger in einer Weise, die der linken seitliche Teil in Richtung der Person, die die Operation nach oben zeigt. Identifizieren der Milz Gegend und quer sezieren die Haut in der Nähe der Hypochonder Region, gefolgt von einen kurzen Schnitt durch die Peritonealdialyse Schicht nur um die Milz zu entlarven.</li>
		<li>Heben Sie die Milz und halten Sie es außerhalb der Hohlraum mit Hilfe von zwei PBS Wattestäbchen angefeuchtet.</li>
		<li>Festhalten Sie die Milz mit zwei Wattestäbchen vorsichtig mit einer Hand, und legen Sie die Nadel der Spritze genau senkrecht zur Milz. Sanft die Milz durchbohren und schieben Sie die Nadel sehr langsam innen; die Nadel sollte nicht tiefer als 2 mm erhalten.</li>
		<li>Drücken Sie den Kolben der Spritze langsam um die Zellen in der Milz zu injizieren. Nach der Transplantation die Nadel der Spritze stabil zu halten und langsam von der Milz, Blutung zu vermeiden oder Verlust von Zellen zu entfernen.</li>
		<li>Nach dem Platzieren der Milz wieder in die Bauchhöhle mit dem Wattestäbchen, schließen Sie die Peritonealdialyse Schicht durch kontinuierliche Vernähen mit einem 4: 0 Catgut Naht. Nähen Sie die Haut diskontinuierlich mit der selben Naht. Vermeiden Sie die Verwendung von Wunde Clips zum Verschließen der Haut; Stattdessen schließen sie durch einen 4: 0-Naht. Die Wunde Clips schränken die natürliche Bewegung der Maus, und oft Clips locker und schnell herauskommen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. postoperative Pflege
<ol><li>Wischen Sie nach dem Schließen der Haut, die Umgebung der beiden Naht Standorte mit Jod-Lösung (Betadine) mit einem sterilen Wattetupfer.</li>
	<li>Eine Dosis von Antibiotika Cefotaxim zu injizieren, da 600 mg/kg (in der Regel 12 mg Cefotaxim in 100 µL der Saline/Maus) intraperitoneal des Körpergewichts mit 1 mL Spritze.</li>
	<li>Geben Sie tägliche Dosen von Schmerzmittel Meloxicam als 1 mg/kg Körpergewicht (in der Regel 12 µg Meloxicam in 100 µL der Saline/Maus), um das Tier intraperitoneal, für bis zu drei Tage nach der Operation.</li>
	<li>Stoppen Sie nach Beendigung der Operation wird der Gasstrom Isofluran zu und platzieren Sie den Mauszeiger wieder zurück in die individuell belüfteten Käfig.</li>
</ol>4. Euthanization und Charakterisierungen
<ol><li>Nach der experimentellen Endpunkte (1 Tag und 10 Tage nach der Operation) einschläfern Sie die Mäuse nach den institutionellen Tierethik-Richtlinien.</li>
	<li>Sammeln Sie Blut durch die Tiere, Punktion der okulären terminal Plexus unheilbar Blutungen.</li>
	<li>Serum aus dem Blut zu isolieren.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Partielle Hepatektomie ist eine etablierte Methode zur Untersuchung Leberregeneration und übermäßige Hepatektomie wird berichtet, dass der AHF-Modell zu imitieren. Tiermodelle der AHF gehören Nagetiere, insbesondere Mäuse, das am besten untersuchte Modell. Um eine Schädigung der Leber-Modell bei Mäusen bis zu einer 70 % Hepatektomie zu erhalten wurde mit einer guten überleben Rate25,26gemeldet. Aber nackt und andere immungeschwächte Maus, eine 70 % Hepatektomie w...

Als Alternative zur gesamten Organ-Transplantation zur Behandlung von Patienten mit schweren Lebererkrankungen wird derzeit Hepatozyten Transplantation vorgeschlagen. Es wird vermutet, dass es Patienten auf ganze Organ Transplantation1überbrücken kann. Neben der allogenen Hepatozyten2werden xenogenen Hepatozyten3 und Hepatozyten abgeleitet von Stammzellen4 auch in Tiermodellen untersucht. In diesem Zusammenhang, das Homing und Engraftment ist Potenzial der transplantierten Zellen des Empfängers ein wichtiges Kriterium für zellbasierte Therapie im akuten Leberversagen (AHF).
Für die Untersuchung der Transplantation von Leberzellen oder Hepatozyten-wie Zellen5, entsteht AHF in einem Tiermodell durch chirurgische6 oder pharmakologische7 Verfahren durch die Transplantation von Zellen. Zu Tiermodell AHF durch pharmakologische Reagenzien, viele Hepatotoxins wie Paracetamol9, Carbon Titantetrachlorid10, Thioacetamide11, d-Galactosamin8, Concanavalin A12, Lipopolysaccharid13 , etc.., verwendet wurden. Aus dieser Liste jedes Reagenz erzeugt einen eindeutigen Satz von Funktionen für AHF, aber leider keinen einzigen Reagenz imitiert menschliche AHF. Darüber hinaus die AHF induziert durch Hepatotoxins dauert eine lange Zeit, die Tiere unter Dauerstress setzt, und reproduzierbare Ergebnisse sind schwer zu bekommen.
Auf der anderen Seite die chirurgische Verfahren der partiellen Hepatektomie (PHx) ist Geschick abhängig, und reproduzierbare Ergebnisse sind leicht zu beschaffen, nach der Entwicklung der erforderlichen Fähigkeiten. AHF durch einen chirurgischen Eingriff allein zu induzieren, ist die Resektion von mehr als 70 % der Leber erforderlich; jedoch verpflanzt weniger als eine 70 % Hepatektomie noch genutzt werden kann, um Studie Engraftment und Proliferation von Zellen in der Leber für die Analyse ihrer therapeutischen Kapazität bei Leberschäden14. Die Transplantation von Leberzellen wurden durchgeführt Post Hepatektomie durch das Peritoneum15, Tail Vene16, Lebervene17oder die Milz-18. Derzeit Lebervene Infusion und intrasplenic Transplantation von Leberzellen das bevorzugte Verfahren, da sie leichter zu reproduzieren.
In diesem Papier haben wir ein Verfahren für eine 30 % teilweise Hepatektomie in NOD beschrieben. SCID (NICKEN. CB17-Prkdcscid/J) Mäuse, in denen die linken Leberlappen herausgeschnitten. Es folgt durch Transplantation von 0,2 Millionen GFP mit dem Ausdruck ihrer Maus (C57BL/6-Tg (UBC-GFP) 30Scha/J) Hepatozyten sowie menschlichen Ursprungs NeoHep19 in der Milz. Dieses Verfahren führt zu Engraftment der transplantierten Zellen in der Leber. Dieses Verfahren ist die wenigsten invasive und minimal schmerzhaft Technik.

<table><tbody><tr><td>Gasanästhesiesystem</td><td>Ugo Basile; Italien</td><td>211000</td><td></td></tr><tr><td>Waage</td><td>Goldtech ; Indien</td><td></td><td>Lokale Beschaffung</td></tr><tr><td>Biologische Sicherheitswerkbank (Klasse I)</td><td>Kartos international; &nbsp; Indien</td><td></td><td>Lokale Beschaffung</td></tr><tr><td>Haarschneider</td><td>Panasonic ; &nbsp; Japan&nbsp;</td><td>ER-GY10&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Gerade bedienbare Schere mit scharfen/scharfen Klingen</td><td>Major Ssurgeonicals; Indien</td><td></td><td>Lokale</td></tr><tr><td>Beschaffungszange mit Verzahnung</td><td>Große Chirurgie; Indien</td><td></td><td>Lokale Beschaffung</td></tr><tr><td>Mikro-Nadelhalter&nbsp; gerade & gebogen&nbsp;</td><td>Mercian ; &nbsp; England&nbsp;</td><td>BS-13-8</td><td></td></tr><tr><td>1 ml Insulinspritze mit 30G *5/16 Nadeln&nbsp;</td><td>Dispo Van; Indien</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 ml Spritze mit 26 G * 1/2 Nadel</td><td>BD ; USA&nbsp;</td><td>REF 303060</td><td></td></tr><tr><td>Nylonfäden&nbsp; &nbsp;</td><td>mächtig; Indien</td><td></td> <td>(1-0) Lokale Beschaffung</td></tr><tr><td>MERSUTURES 4-0 Sterilisiertes chirurgisches Nadelnahtmaterial</td><td>Ethicon, Johnson & Ltd. Johnson, Indien</td><td>NW 5047</td><td></td></tr><tr><td>TRUGUT 76 cm 4-0 resorbierbares chirurgisches Nahtmaterial</td><td>Nähte Indien Pvt. Ltd; Indien</td><td>SN 5048</td><td>Sterilisierte chirurgische Nadelnaht Catgut Chrom-Wattestäbchen</td></tr><tr><td></td><td>Reine Tupfer Pvt Ltd ; &nbsp; Indien</td><td></td><td>Lokale Beschaffung</td></tr><tr><td>Chirurgisches Klebeband</td><td>3M Indien ; Indien</td><td>1530-1</td><td>Mikroporen-Operationsband-Mikrotom</td></tr><tr><td></td><td>Histo-Line Laboratories, Italien</td><td>MRS3500</td><td></td></tr><tr><td>Shandon Cryotome E Kryostat</td><td>Thermo Electron Corporation ; Konfokales</td> Laser-Scanning-Mikroskop in den USA <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Carl Zeiss ; Deutschland&nbsp;</td><td>LSM 510 META</td><td></td></tr><tr><td>Hellfeldmikroskop</td><td>Olympus, Japan</td><td>LX51</td><td></td></tr><tr><td>Automatisiertes Analysegerät</td><td>Tulip, Alto Santracruz, Indien</td><td>Screen Maaster 3000</td><td>Biochemisches Analysegerät für Leberfunktionstest</td></tr><tr><td>Durchflusszytometer</td><td>BD ; USA&nbsp;</td><td>BD FACSverse</td><td>Beurteilung des Vorhandenseins von Zellen nach der Transplantation</td></tr><tr><td>Veet Haarentfernungscreme&nbsp;</td><td>Reckitt Benckiser , Indien</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FORANE</td><td>Abbott ; US-Isofluran</td><td></td><td>USP 99,9%&nbsp;</td></tr><tr><td>Taxim</td><td>AlKem ; Indien</td><td></td><td>Cefotaxim-Natrium-Injektion</td></tr><tr><td>Povidon-Jod-Lösung&nbsp;</td><td>Win-Medicare; &nbsp; Indien</td><td></td><td>Betadin</td></tr><tr><td>, Paraformaldehyd,</td><td>Himedia; Indien</td><td>GRM 3660</td><td></td></tr><tr><td>Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)</td><td>Life Technologien, Thermo Fisher wissenschaftlich ; US</td><td>12200-036</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma ; US</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek</td><td>Sakura; US</td><td>25608-930</td><td>O.C.T. Compound</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Himedia; Indien</td><td>MB 097</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Albumin Ziege Polyklonal</td><td>Thermo Scientific, Pierce, USA</td><td>PA126081</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Connexin 32/GJB1 Polyklonal</td><td>abcam, UK</td><td>ab64609-500</td><td></td></tr><tr><td>AntiGFP Kaninchen polyklonal&nbsp;</td><td>Biotechnologie in Santa Cruz; US</td><td>SC 8334</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Esel Anti-Ziege</td><td>&nbsp; Molekulare Sonden , Thermo Fisher Scientific ; &nbsp; US</td><td>A11058</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Esel Anti-Schaf</td><td>&nbsp; Molekulare Sonden , Thermo Fisher Scientific ; &nbsp; US</td><td>A11015</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Huhn Anti Kaninchen</td><td>&nbsp; Molekulare Sonden , Thermo Fisher Scientific ; &nbsp; US</td><td>A21442</td><td></td></tr><tr><td>Ziege Anti-Kaninchen IgG HRP</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific; USA&nbsp;</td><td>65-6120</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ki67-Antikörper</td><td>abcam, UK</td><td>ab15580</td><td></td></tr><tr><td>Antigen-Demaskierungslösung,</td><td>Zitronensäure-Base-Vektorlaboratorien, US</td><td>H-3300</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Diamond Antifading-Eindeckmittel</td><td>Lebenstechnologien, Thermo Fisher wissenschaftlich; US</td><td>P36966</td><td></td></tr><tr><td>SGOT (ASAT) KIT</td><td>Klinisches Korallensystem, Indien</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SGPT (ALAT) KIT</td><td>Koralle Klinisches System, Indien</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alkalisches Phosphatase Kit (DEA)</td><td>Klinisches Korallensystem, Indien</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hämatoxylinlösung, Mayer's</td><td>Sigma ; US</td><td>MHS16</td><td></td></tr><tr><td>Eosin Y-Lösung, alkoholisches</td><td>Sigma ; US</td><td>HT110132</td><td></td></tr><tr><td>DPX Montierung&nbsp;</td><td>Sigma; US</td><td>6522</td><td></td></tr><tr><td>Melonex (Schmerzmittel)</td><td>Intas Pharmaceuticals Ltd; Indien</td><td></td><td>Meloxicam Injektion&nbsp;</td></tr><tr><td>DAB-verstärktes flüssiges Substratsystem Tetrahydrochlorid</td><td>Sigma ; US</td><td>D3939</td><td></td></tr></tbody></table>

intrasplenic transplantation von leberzellen nach teilweiser hepatektomie in nod. scid-mäuse

Intrasplenic Transplantation of Hepatocytes After Partial Hepatectomy in NOD.SCID Mice

Teilweise Hepatektomie ist eine vielseitige und reproduzierbare Methode zur Leberregeneration und die Wirkung von zellbasierten Therapie in verschiedenen pathologischen Bedingungen zu studieren. Partielle Hepatektomie erleichtert auch die erhöhte Engraftment und Proliferation von transplantierten Zellen durch beschleunigte Neovaskularisation und Zellwanderung auf der Leber. Hier beschreiben wir ein einfaches Protokoll für immungeschwächte NOD 30 % Hepatektomie und Transplantation von Zellen in der Milz ein nicht adipösen Diabetiker/schwere Ausführung kombiniert werden. SCID (NICKEN. CB17-Prkdcscidj) Maus.
Bei diesem Verfahren werden zwei kleine Hautschnitte vorgenommen. Der erste Schnitt ist zu entlarven und den linken Leberlappen resezieren, und ein weiterer kleiner Schnitt erfolgt, die Milz für die intrasplenic Transplantation von Zellen verfügbar zu machen. Dieses Verfahren erfordert keine speziellen chirurgische Fähigkeiten nicht, und es kann in ca. 5-7 Minuten mit weniger Stress und Schmerzen, schnellere Genesung und bessere Überlebensrate abgeschlossen werden. Wir haben die Transplantation von Leberzellen isoliert von einem grün fluoreszierendes Protein (GFP) mit dem Ausdruck ihrer Maus (transgene C57BL/6-Tg (UBC-GFP) 30Scha/J) sowie Hepatozyten wie Zellen menschlichen Ursprungs (NeoHep) in teilweise Hepatectomized NOD bewiesen. SCID-Mäuse.

Hepatozyten Verbreitung nach 30 % teilweise Hepatektomie: Die Verbreitung von Hepatozyten in den verbleibenden nach 30 % Hepatektomie Leber wurde durch immunhistochemische (IHC) Färbung für eine Verbreitung Zellmarkierung, Ki-67 geprüft. Tages-Post Hepatektomie, die Mäuse wurden eingeschläfert, die verbleibenden Leber Lappen wurden herausgeschnitten und Paraffin Abschnitte wurden erhalten. Die Abschnitte wurden mit Ki-67-Antikörper, gefolgt von Etikettierung mit Meerrettich-Peroxidase (HRP) konjugierten ...

Wir haben ein Protokoll für die Durchführung von teilweise Hepatektomie (PHx) und Zelltransplantation über Milz in NOD beschrieben. SCID (NICKEN. CB17-Prkdcscidj) Mäuse. In diesem Protokoll wird ein Einschnitt gemacht, zu entlarven und den linken Leberlappen folgte ein weiterer Einschnitt für die intrasplenic Transplantation von Zellen zu resezieren.

Intrasplenic Transplantation von Leberzellen nach teilweiser Hepatektomie in NOD. SCID-Mäuse

Partial hepatectomy is a versatile and reproducible method to study liver regeneration and the effect of cell based therapeutics in various pathological ...

Für die Behandlung von Patienten mit akutem Leberversagen ist die Hepatozytentransplantation eine Alternative zur Transplantation eines gesamten Organs. Die partielle Hepatektomie wird als Technik zur Erzeugung eines akuten Leberversagens verwendet. Außerdem dient sie auch der Untersuchung der Einlagerung und Proliferation von Zellen während der zellbasierten Therapie.Maus ist eines der am intensivsten erforschten Modelle, um eine Hepatektomie für derartige Zielsetzungen durchzuführen. In diesem Video zeigen wir ein Verfahren zur partiellen Hepatektomie, gefolgt von der Transplantation von Hepatozyten in die Milz einer NOD.SCID-Maus.Bevor Sie beginnen, stellen Sie sicher, dass Sie die erforderliche Genehmigung des zuständigen Tierversuchsausschusses zur Durchführung des Experiments erhalten haben. Bei diesem Verfahren führen wir zwei kleine Einschnitte durch. Der erste Einschnitt dient einer partiellen Leberhepatektomie und wird etwa einen Zentimeter lang sein; er wird direkt unterhalb des Xiphoids gesetzt, um die Leber freizulegen.Für die Transplantation von Zellen wird ein weiterer, kleinerer Einschnitt im linken Seitenbereich vorgenommen, um die Milz des Tieres freizulegen. Die Vorteile bestehen darin, dass weniger Trauma und Schmerz für das Tier entstehen, eine schnellere Genesung erfolgt und die Überlebensrate nahezu hundertprozentig beträgt. Darüber hinaus erfordert dieses Verfahren keine speziellen chirurgischen Fähigkeiten und kann innerhalb von fünf bis sieben Minuten schnell abgeschlossen werden.In diesem Video demonstrieren wir die Transplantation von hepatocytenähnlichen Zellen, sogenannten NeoHep-Zellen, sowie von Hepatozyten, die aus einer transgenen GFP-Maus isoliert wurden, in eine partiell hepatektomierte NOD.SCID-Maus. Das Verfahren beschränkt den Zelltyp für die Transplantation nicht.Alle chirurgischen Instrumente und PBS wurden ordnungsgemäß im Autoklaven sterilisiert und vor der Operation bereitgehalten. Wiegen Sie die Maus. NOD. SCID-Mäuse im Alter von sechs bis acht Wochen mit einem Gewicht zwischen vierzehn und achtzehn Gramm werden in dieses Verfahren einbezogen.Rasieren Sie den mittleren, oberen und linken Bereich des Bauchs der Maus. Um abgeschnittenes Haar zu entfernen, tragen Sie Enthaarungscreme auf dem rasierten Bereich auf. Warten Sie vier bis fünf Minuten und entfernen Sie das Haar vorsichtig.Öffnen Sie das Ventil der Sauerstoffflasche. Legen Sie die Maus in die Isofluran-Kammer. Stellen Sie den Sauerstofffluss auf vier Liter pro Minute ein.Stellen Sie die Isofluranverdampfung zur Einleitung der Anästhesie auf vier Prozent ein. Stellen Sie durch vorsichtiges Zupinnen der Zehen sicher, dass die Maus ausreichend anästhesiert ist. Platzieren Sie ein Operationsbrett in einem Sicherheitswerkbank. Platzieren Sie das Tier auf dem Operationsbrett, sodass der ventrale Teil der Maus nach oben zeigt und der vordere Teil der Maus in der Nasenkonnekte befindet, die mit der Isofluran- und Sauerstoffzufuhr verbunden ist. Verringern Sie die Isofluran-Vaporisierung auf zwei Prozent, um die Anästhesie aufrechtzuerhalten. Desinfizieren Sie die Haut, indem Sie sie mit steriler Baumwolle, die in siebzigprozentigem Ethanol getränkt ist, abwischen.Führen Sie einen quer verlaufenden Schnitt von etwa einem Zentimeter Länge in die Haut direkt unterhalb des Brustbeins senkrecht zum Xiphoid und parallel zum Rippenkorb ein. Lösen Sie vorsichtig die Haut und das Peritoneum in der Nähe des Schnitts. Führen Sie einen quer verlaufenden Schnitt durch die Peritonealschicht direkt unterhalb des Xiphoids durch, um den linken Leberlappen freizulegen.Es werden zwei angefeuchtete Wattestäbchen verwendet. Legen Sie eines der Wattestäbchen auf die Bauchseite des Schnitts und ein weiteres auf die Zwerchfellseite. Drücken Sie nun vorsichtig das Stäbchen, das zur Zwerchfellseite hin platziert ist, und führen Sie mit dem anderen Stäbchen eine gleitende Bewegung aus, um den linken Leberlappen anzuheben.Platzieren Sie eine Schleife aus Seidenfaden mit der mikrochirurgischen Pinzette an der Basis des linken Seitenlappens nahe dem Leberhilus. Nachdem der Knoten leicht geschlossen wurde, schieben Sie den Seidenfaden so weit wie möglich zur Basis des Leberlappens. Ziehen Sie den Knoten fest und legen Sie zwei zusätzliche Knoten auf der anderen Seite an.Schneiden Sie das abgebundene Läppchen mit einer Mikrochirurgieschere durch. Diese Abbildung zeigt den verbleibenden Teil des linken Läppchens nach der Resektion. Nähen Sie das Peritoneum durchgehend mit einer resorbierbaren Catgut-Naht der Stärke vier Null.Schließen Sie die Haut durch diskontinuierliche oder unterbrochene Naht mit der gleichen vier-null-Catgut-resorbierbaren Naht. Tragen Sie Betadine in der Umgebung der Nähte auf. Halten Sie die Hepatozyten oder NeoHep in fünfzig Mikroliter IMDM suspendiert, die in einer ein-Milliliter-Insulinspritze mit 29-Gauge-Nadel bereitstehen.Platzieren Sie die Maus so, dass der linke Seitenabschnitt nach oben zeigt. Identifizieren Sie den Milzbereich und dissezieren Sie die Haut quer. Führen Sie einen zwei bis drei Millimeter langen Schnitt in der Bauchfellschicht durch, um die Milz freizulegen.Platzieren Sie die Milz zwischen zwei feuchten Wattestäbchen und heben Sie sie vorsichtig an. Stechen Sie vorsichtig mit der Nadel in die Milzkapsel und geben Sie die Zellsuspension in die Milz ab. Verschließen Sie das Peritoneum durch kontinuierliche Naht mit einer 4-0-Naht und verschließen Sie die Haut durch diskontinuierliche Naht.Tragen Sie Betadine auf die Nähte auf. Injizieren Sie hundert Mikroliter Kochsalzlösung intraperitoneal, die zwölf Milligramm des Antibiotikums Cefotaxim enthalten. Injizieren Sie hundert Mikroliter Kochsalzlösung intraperitoneal, die zwölf Mikrogramm des Analgetikums Meloxicam enthalten.Dies ist täglich für drei Tage nach der Operation zu verabreichen. Schließen Sie den Isofluran-Vaporisator und stellen Sie die Maus in den Käfig. Das Tier wird innerhalb von Sekunden das Bewusstsein zurückerlangen.Die Proliferation von Hepatozyten in der Leber 24 Stunden nach einer 30 %igen Hepatektomie wurde mittels immunhistochemischer Färbung von Leber­schnitten mit Ki-67, einem Marker für Zellproliferation, untersucht. Nach der Färbung dieser Schnitte wurde ein mit HRP konjugiertes sekundäres Antikörper­gegen-Ki-67 verwendet, um die Detektion durchzuführen, und Di-Amino-Benzidin diente als Substrat zur Entstehung einer braunen Färbung. Der Kern wurde mit Hämositin gegengefärbt.In diesem Bild sind die braun gefärbten Zellen Ki-67-positive proliferierende Hepatozyten. Zehn Tage nach der Transplantation wurde die Maus getötet und die Leber untersucht. Ein repräsentatives Bild ist hier dargestellt.Aus der regenerierten Leber wurden der rechte laterale Lappen, der rechte mediale Lappen und die linken medialen Lappen entfernt, und fünf Mikrometer dicke Schnitte wurden angefertigt. Diese Schnitte wurden mit primären kaninch-polyklonalen anti-GFP-Antikörpern und sekundären anti-Kaninchen-Alexa-Fluor-594-Antikörpern gefärbt. Der Kern wurde mit DAPI kontragefärbt.Dieses Bild zeigt das Homing von Hepatozyten, die das grün fluoreszierende Protein exprimieren, das als rot sichtbar ist. Nach der Transplantation von menschlichen, hepatozytenähnlichen Zellen, sogenannten NeoHep, beobachteten wir die Expression von menschlichem Albumin und menschlichem Connexin 32 in Leberschnitten des empfängenden hepatektomierten Mäusen. Zehn Tage nach der Operation bestätigte die biochemische Analyse von in das Serum abgegebenen Leberenzymen, dass die Spiegel von Aspartat-Aminotransferase, Alanin-Aminotransferase und alkalischer Phosphatase wieder normal waren.Ebenso zeigte die histologische Untersuchung von Leberabschnitten mittels Hämatoxylin- und Eosinfärbung zehn Tage nach der Operation keine Auffälligkeiten, was auf eine ordnungsgemäße Regeneration der Leber hinweist. Es ist wichtig, einige Vorsichtsmaßnahmen zu beachten. Versuchen Sie, den Knoten des Nylonfadens an der Basis des Leberlappens anzubringen.Vergessen Sie nicht, zwei zusätzliche feste Knoten auf der gegenüberliegenden Seite anzulegen, und versuchen Sie nicht, direkt am Faden abzuschneiden. Zum Transplantieren von Zellen in die Milz sollte die Nadel exakt senkrecht eingestochen werden und nicht tiefer als zwei Millimeter eindringen. Zum Verschließen der Haut sollten keine Wundclips verwendet werden.Schließen Sie die Wunde stattdessen mit einer 4-0-Naht. Wundklammern beeinträchtigen die natürliche Bewegung der Maus, und häufig lösen sich die Klammern schnell und fallen heraus. Nachdem Sie das Tier in den Käfig zurückgelegt haben, können Sie einige Stücke sterile Cornflakes in den Käfig geben und steriles Wasser mit fünfprozentiger Glukose bereitstellen.Wenn Sie keinerlei frühere Erfahrung mit Tierchirurgie haben, üben Sie zunächst die partielle Leberhepatektomie und Transplantation an normalen immunkompetenten Mäusen separat und führen Sie anschließend beide Verfahren an einem einzigen Tier durch. Führen Sie die Eingriffe an immundefizienten NOD.SCID-Mäusen erst durch, nachdem Sie eine Überlebensrate von hundert Prozent bei immunkompetenten Mäusen erreicht haben.

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Research

Forschung

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Medicine

Medizin

Die Transplantation von Maus neurale Stammzellen (NSCs) in das Rückenmark von Mäusen mit etablierten Demyelinisierung ist detailliert. Die Vorbereitung der NSCs, die Laminektomie der Brustwirbel 9 (T9), und die Transplantation von NSCs zusammen mit dem Pre-und post-operative Betreuung der Mäuse dargestellt.

Chirurgische Transplantation von Maus Neural Stem Cells in den Rückenmark von Mäusen mit neurotropen Maus Hepatitis Virus infiziert

Dieses Video demonstriert eine Methode zur Generierung eines dualen humanisierten Mausmodells mit einem menschlichen Immunsystem und Leberzellen. Dabei werden menschliche Leberzellen und hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen durch intrasplenische Injektion in eine transgene immundefiziente Maus transplantiert, was zur Transplantation von Leberzellen und zur Entwicklung menschlicher Immunzellen führt.

Entwicklung eines humanisierten Mausmodells mit menschlichen Leberzellen und Immunzellen

Menschen Tumorxenotransplantaten in immundefizienten Mäusen sind wertvolle Werkzeuge, um Krebsbiologie zu studieren. Spezifische Protokolle subkutane und intra-Heterotransplantate aus menschlichen Leberzellkarzinom-Zellen oder Tumorfragmente zu erzeugen, werden beschrieben. Leberregeneration nach partieller Hepatektomie in Empfängermäuse induziert wird, als eine Strategie, um intra-Transplantation zu erleichtern präsentiert.

Generierung von subkutanen und Intrahepatische Menschenleberzellkarzinom Xenografts in immundefizienten Mäusen

Hier präsentieren wir ein neuartiges humanisiertes Mauslebermodell, das in Alb-Toxin-Rezeptor-vermittelten Zell-Knockout-Mäusen (TRECK)/SCID-Mäusen nach der Transplantation von unreifen und expandierbaren humanen Leberstammzellen erzeugt wurde.

Erzeugung eines humanisierten Maus-Leber unter Einsatz von menschlichem Leberstammzellen

Hier präsentieren wir eine neue Methode zur teilweisen Resektion des linken hepatischen Lappens bei Neugeborenen (Tag 0) Mäusen. Dieses neue Protokoll eignet sich für akute Leberschädigung und Verletzungen Reaktion in der neonatalen Einstellung zu studieren.

Partielle Lobuläres Hepatektomie: Chirurgische Modell für morphologische Leberregeneration

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um eine menschliche Leber chimärer Maus-Modell der Familiäre Hypercholesterinämie mit menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen gewonnenen Hepatozyten zu generieren. Dies ist ein wertvolles Modell zum Testen neuer Therapien für Hypercholesterinämie.

Eine familiäre Hypercholesterinämie menschlichen Leber chimärer Maus-Modell mit induzierten pluripotenten Stammzellen gewonnenen Hepatozyten

Dieses Protokoll bietet eine zuverlässige Methode, um humanisierte Mäuse mit menschlichem Immunsystem und Leberzellen zu etablieren. Dual rekonstituierte immundefizienten Mäuse, die durch intrasplenische Injektion von humanen Hepatozyten und CD34+ hämatopoetischen Stammzellen erreicht werden, sind anfällig für eine Infektion mit dem Humanimmundefizienzvirus-1 und rekapitulieren Leberschäden, wie in HIV-infizierte Patienten.

Etablierung des dualen humanisierten TK-NOG-Mausmodells für HIV-assoziierte Leberpathogenese

Hier beschreiben wir die Entwicklung eines klinisch relevanten murinen Modells von Leberkrebs, das die typischen Immunmerkmale von hepatozellulärem Krebs (HCC) rekapituliert.

Ein onkogenes Hepatozyten-induziertes orthotopisches Mausmodell von hepatozellulärem Krebs, der bei der Einstellung von Leberentzündungen und Fibrose entsteht

Lipidbeladene Hepatozyten sind der Leberregeneration inhärent, gehen aber normalerweise bei der Zentrifugation mit Dichtegradienten verloren. Hier stellen wir ein optimiertes Zellisolationsprotokoll vor, das steatotische Hepatozyten beibehält, was repräsentative Populationen von regenerierenden Hepatozyten nach partieller Hepatektomie bei Mäusen ergibt.

Isolierung regenerierender Hepatozyten nach partieller Hepatektomie bei Mäusen

In diesem Protokoll diskutieren wir die Implementierung eines Modells für eine erfolgreiche orthotope Lebertransplantation (OLT) bei Mäusen. Darüber hinaus werden auch Adjuvantien zur weiteren Analyse der Durchgängigkeit von Transplantaten nach erfolgreicher OLT in einer Maus diskutiert, insbesondere unter Verwendung von Mikrocomputertomographie (microCT)-Scans.

Erfolgreiche orthotope Lebertransplantation bei Mäusen mittels Mikrocomputertomographie-Angiographie

Das Mausmodell der partiellen 2/3 (66%) Hepatektomie ist in der Literatur gut beschrieben, aber ausgedehntere Hepatektomien, die das Small-for-Size-Syndrom nach Lebertransplantation nachahmen, wurden selten verwendet. Wir beschreiben eine erweiterte 78%ige Hepatektomie in einem Mausmodell, die bei gesunden Mäusen zu einer postoperativen Letalität von etwa 50% führt.

Erweiterte 78%-Hepatektomie in einem chirurgischen Mausmodell

Erfahren Sie die intrasplenische Transplantation von Hepatozyten nach partieller Hepatektomie bei NOD.SCID-Mäusen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Zelleinwanderung und Proliferation bei zellbasierten Lebertherapien.

Intrasplenic Transplantation von Leberzellen nach teilweiser Hepatektomie in NOD. SCID-Mäuse

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