Name: Tumor Engraftment in einem Xenograft-Maus-Modell der menschlichen Mantel-Zell-Lymphom (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-30T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: Erfahren Sie die Xenotransplantation von Mantelzell-Lymphomzellen in immunodefiziente Mäuse zur Entwicklung neuer Therapiestrategien. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Behandlungseffekten an patientenstammigen Zellen in vivo.

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Diese Arbeit wurde unterstützt durch die Ligue Genevoise Contre le Cancer, Fondation Dr. Dubois Ferriere Dinu-Lipatti, Oncosuisse KPS-OCS, OCS-02260-08-2008 und 2914-02-2012, und Swiss National Science Foundation Grant 31003A_156760 und 310030-153456.

Die menschlichen Blutproben wurden nach Genehmigung durch die lokale Ethik und menschliche Experimente Ausschüsse des Universitätsspitals Genf Verfahren verwendet.
Tierische Verfahren wurden im Einklang mit den institutionellen ethischen Ausschuss von Animal Care in Genf, der Schweiz und beim kantonalen Veterinäramt durchgeführt (Zulassungsnummer: GE/26/15).
1. Vorbereitung primäre peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) durch Dichtetrennung Gradient
Hinweis: 3-5 mL des peripheren Blutes wurden Patienten mit MCL in einer leukämischen Phase entnommen. Die Diagnose wurde gemäß standard diagnostischen Kriterien für die Durchflusszytometrie (CD5 +, CD23−, CD200 +, monoklonalen B-Zell-Population) und anschließend durch Vorhandensein von chromosomalen Translokation t(11;14) und Überexpression von cyclin D1 bestätigt. In allen Fällen stellte monoklonale B-Zellen zu > 90 % der gesamten B-Zell-Population. Die verbleibenden Zellen waren vor allem Monozyten und T-Zellen.
<ol><li>Verdünnen Sie (1:1) 5 mL MCL Blutprobe mit 5 mL Medium Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI) (Abbildung 1A).</li>
	<li>Invertieren Sie die Dichte Gradienten Medien (Table of Materials) mehrmals vor der Verwendung um gute Durchmischung zu gewährleisten.</li>
	<li>Hinzugeben Sie 5 mL Dichte-Gradienten-Medien in eine 15 mL Zentrifugenröhrchen mit Hilfe einer Pipette Absauganlage.</li>
	<li>Sanft Schicht verdünnten Blutprobe über die Dichte Gradienten Medien in der 15 mL Zentrifugenröhrchen mit einer Absauganlage (das Blut Dichte-Gradienten Medien-Verhältnis sollte 2:1, z.B., 10 mL Blut bis 5 mL der Dichte-Gradienten-Medien). Keine Mischung sollten der beiden Schichten (Abbildung 1 b, C) achten.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Probe bei 400 X g 40 min bei Raumtemperatur mit der Zentrifuge Bremsen ausgeschaltet.</li>
	<li>Mit einer sterilen Pasteurpipette vorsichtig Aspirieren die mittlere Schicht (weißliche, dünner Ring mit einem Pfeil (Abbildung 1, E) markiert), enthält die mononukleären Zellen und in ein sauberes Röhrchen überführen.</li>
	<li>Waschen von mononukleären Zellen<ol>
<li>Schätzen Sie das Volumen der übertragenen Zellsuspension und hinzufügen 3 Bände von sterilen 1 x Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit 1 % Rinderserumalbumin (BSA).</li>
		<li>Mischen Sie die Suspension durch Pipettieren nach oben und unten mehrmals.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die Federung bei 400-500 X g für 10-15 min bei Raumtemperatur.</li>
		<li>Den Überstand der Zelle Pellet und wiederholen der Waschschritt zu verwerfen.</li>
		<li>Entfernen des Überstands und die Zellen in der gewünschten Lautstärke, z.B., 1 oder 2 mL PBS Aufschwemmen.</li>
		<li>Die Anzahl der Zellen durch eine automatisierte Zelle Zähler oder manuell über eine Hemocytometer (Neubauer Kammer).</li>
	</ol>
</li>
</ol>(2) Anreicherung von B-Zellen durch B-Zellen Negative Selektion
<ol><li>Die Zellen in PBS, eine Endkonzentration von 50 x 106 Zellen/mL zu verdünnen.</li>
	<li>Übertragen Sie die Zellen auf 5 mL Runde Polystyrol Unterrohr. 2 mL Zellsuspension 100 µL Antikörper cocktail aus dem B-Zell-Anreicherung-Kit hinzu, und mischen Sie leicht durch Pipettieren nach oben und unten (Abbildung 2-1).</li>
	<li>Inkubieren Sie die Zellen bei Raumtemperatur für 10 min.</li>
	<li>Kurz Wirbel die Magnetpartikel mitgelieferten B Zelle Bereicherung für 30 s (Abbildung 2-2). 2 mL der Probe 150 µL der magnetischen Partikel hinzufügen.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Probe für weitere 5 Minuten bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Bringen Sie das Probenvolumen bis 2,5 mL mit 1 X PBS mit 2 % fetalen Kälberserum (FCS) und 1 mM Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA). Legen Sie das Rohr in den Magneten und inkubieren Sie das Rohr für weitere 3-5 Minuten (Abbildung 2-3).</li>
	<li>Abholen des Magnet mit dem Rohr im Ort und in einer kontinuierlichen Bewegung, das Rohr zu dekantieren, damit die angereicherten Zellsuspension in einem frischen Rohr (Abbildung 2-4) gesammelt werden. Zählen der Zellen durch eine automatisierte Zelle Zähler oder manuell über eine Hemocytometer, um die Gesamtausbeute der B-Zellen zu erhalten. Hinweis: In der Regel ergibt sich eine ~ 105 B Zellen/mL für normale B-Zellen und 5-50 x 106 Zellen/mL für MCL.</li>
	<li>Bestätigt die Reinheit der B-Zell-Bereicherung<ol>
<li>Nehmen ~ 50.000 Zellen und inkubieren Sie die Zellen mit Anti-CD19/CD20-Antikörper (01:20 Verdünnung) und Anti-CD45 Antikörper gekoppelt mit verschiedenen Fluorochromes (01:10 Verdünnung) bei Raumtemperatur für 15-30 min.</li>
		<li>Waschen mit 1 mL 1 x PBS + 1 % BSA, die Zellen bei 400-500 X g für 5 min Zentrifugieren und Zellen in ~ 200 µL PBS aufzuwirbeln.</li>
		<li>Erwerben Sie die Zellproben durch Durchflusszytometrie und für die Reinheit der B-Zellen zu analysieren. Reinheit ist meist > 90 % von dieser Methode (Abbildung 3).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Entwicklung der Xenograft-Maus-Modell
<ol><li>Aussetzen Sie ~ 40-60 x 106 Zellen in 150-200 µL 1 X PBS (Volumen benötigt, um per Mausklick zu injizieren).</li>
	<li>150 µL Zellsuspension intravenös zu injizieren (i.v.) in jede Rute Vene von 6-7 Wochen alten immungeschwächte NOD scid Gamma (NSG) Mäusen unabhängig vom Geschlecht (Abb. 4A).</li>
	<li>Lassen Sie die Mäuse, menschlichen Lymphom für ~ 10 Wochen zu entwickeln. Hinweis: Primäre menschlichen Lymphom-Zellen dauert wesentlich länger, im Vergleich zu menschlichen Lymphom Zelllinien (~ 3 Wochen) Tumor zu entwickeln.</li>
	<li>Wenn die Tiere beginnen, zeigen Symptome einer tödlichen Krankheit wie Gewichtsverlust, Opfern zerzauste Haare, verminderte Aktivität, Lähmung der hinteren Extremitäten, etc., die Mäuse Erstickungstod CO2 gefolgt von kardialen Herz durchbohren, Blut zu erhalten.</li>
	<li>Sammeln verschiedener Organe wie Knochenmark, Milz und Leber durch sezieren die Mäuse und peripheren Blut zu sammeln, indem man Blut vom Herzen zum Zeitpunkt des Opfers für Tumor Engraftment Analyse (Abbildung 4 b -F).</li>
</ol>4. Chimerism Analyse der Tumorzelle pfropfte in verschiedenen Organen
<ol><li>Nach dem Sammeln der verschiedenen Organe, verarbeiten sie durch mechanische Störung, einzelne Zellsuspensionen nach lyse der Erythrozyten (RBC) mit 200 µL 1 x Ammoniumchlorid Kalium Puffer für Blut und Knochenmark, 500 µL für Milz und 2 mL für Leber zu generieren .</li>
	<li>Zählen und die Zellen mit menschlichen B-Zell-spezifische Antikörper, d.h.Anti-CD19, Anti-CD20 und Anti-CD45 Flecken. Hinweis: NSG Mäusen fehlt B-Zellen und damit für Analyse, Zellen sind mit menschlichen bestimmten B-Zell-Markern gefärbt.</li>
	<li>Analysieren Sie die Zellen, die von jedem Organ durch Durchflusszytometrie Anspritzung auf B-Zellen (CD19 +, CD20 +, CD45 +) abgeleitet.</li>
	<li>Quantifizieren Sie die eingepflanzt Tumorzellen in verschiedenen Organen abgeleitet von MCL injiziert Mäuse basierend auf den geschlossenen Zellen, wie in Schritt 4.3 (Abbildung 4). Hinweis: Siehe Tabelle der Materialien für Details.</li>
</ol>

<ol><li>Baggiolini, M., Dewald, B., Moser, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+chemokines%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Human chemokines: an update.</a> Annu Rev Immunol. 15, 675-705 (1997).</li>
<li>Baggiolini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokines+and+leukocyte+traffic%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chemokines and leukocyte traffic.</a> Nature. 392, 565-568 (1998).</li>
<li>Janeway, C. A., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJaneway%2C+CA+%22Immunobiology%3A+The+Immune+System+in+Health+and+Disease%22">Immunobiology: The Immune System in Health and Disease</a>. , 5th edition, (2001).</li>
<li>De Silva, N. S., Klein, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+B+cells+in+germinal+centres%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dynamics of B cells in germinal centres.</a> Nat Rev Immunol. 15 (3), 137-148 (2015).</li>
<li>Cohen, P. L., Kurtin, P. J., Donovan, K. A., Hanson, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow+and+peripheral+blood+involvement+in+mantle+cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Haematol%22%5BJournal%5D)">Bone marrow and peripheral blood involvement in mantle cell lymphoma.</a> Br. J. Haematol. 101, 302-310 (1998).</li>
<li>Meusers, P., Hense, J., Brittinger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mantle+cell+lymphoma%3A+diagnostic+criteria%2C+clinical+aspects+and+therapeutic+problems%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia+%28Baltimore%29%22%5BJournal%5D)">Mantle cell lymphoma: diagnostic criteria, clinical aspects and therapeutic problems.</a> Leukemia (Baltimore). 11 (Suppl 2), S60-S64 (1997).</li>
<li>Herrmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+overall+survival+in+advanced+stage+mantle+cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Improvement of overall survival in advanced stage mantle cell lymphoma.</a> J Clin Oncol. 27 (4), 511-518 (2008).</li>
<li>Martin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intensive+treatment+strategies+may+not+provide+superior+outcomes+in+mantle+cell+lymphoma%3A+overall+survival+exceeding+7+years+with+standard+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Oncol%22%5BJournal%5D)">Intensive treatment strategies may not provide superior outcomes in mantle cell lymphoma: overall survival exceeding 7 years with standard therapies.</a> Ann Oncol. 19 (7), 1327-1330 (2008).</li>
<li>Iyengar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+human+primary+mantle+cell+lymphoma+engraftment+in+NSG+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Haematol%22%5BJournal%5D)">Characteristics of human primary mantle cell lymphoma engraftment in NSG mice.</a> Br J Haematol. 173 (1), 165-169 (2016).</li>
<li>Klco, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+heterogeneity+of+genetically+defined+subclones+in+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+cell%22%5BJournal%5D)">Functional heterogeneity of genetically defined subclones in acute myeloid leukemia.</a> Cancer cell. 25 (3), 379-392 (2014).</li>
<li>Kerbel, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+tumor+xenografts+as+predictive+preclinical+models+for+anticancer+drug+activity+in+humans%3A+better+than+commonly+perceived-but+they+can+be+improved%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biol+Ther%22%5BJournal%5D)">Human tumor xenografts as predictive preclinical models for anticancer drug activity in humans: better than commonly perceived-but they can be improved.</a> Cancer Biol Ther. 2 (4 Suppl 1), S134-S139 (2003).</li>
<li>Johnson, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationships+between+drug+activity+in+NCI+preclinical+in+vitro+and+in+vivo+models+and+early+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Relationships between drug activity in NCI preclinical in vitro and in vivo models and early clinical trials.</a> Br. J. Cancer. 84, 1424-1431 (2001).</li>
<li>Scholz, C. C., Berger, D. P., Winterhalter, B. R., Henss, H., Fiebig, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+of+drug+response+in+patients+and+in+the+clonogenic+assay+with+solid+human+tumour+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Correlation of drug response in patients and in the clonogenic assay with solid human tumour xenografts.</a> Eur. J. Cancer. 26, 901-905 (1990).</li>
<li>Doñate, C., Vijaya Kumar, A., Imhof, B. A., Matthes, T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27256571">Frontline Science: Anti-JAM-C therapy eliminates tumor engraftment in a xenograft model of mantle cell lymphoma.</a> J Leukoc Biol. 100 (5), 843-853 (2016).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

Klinische Studien sind möglich für Medikamente, die in einem fortgeschrittenen Stadium der Entwicklung sind jedoch nicht für die Wirkstoffforschung verwendet werden. Bemühungen um tierische Empfänger für die menschliche Zelle Xenotransplantation zu entwickeln, um frühe Phase Medikamente zu testen haben lange verfolgt. Hier präsentieren wir ein Tiermodell, das menschliche Transplantat Ablehnung vermeidet und kann ein Modell für menschliche Krankheiten, wie MCL. Dies ist derzeit ein State-Of-The-Art-Xenograft-Modell, die M...

Lymphozyten von der Natur eine wichtige Rolle in Immunüberwachung und Lymphozyten Menschenhandel ist ein entscheidender Schritt bei der Montage von Antigen-spezifischen Immunantwort1,2. Dieser Prozess umfasst Migration von naiven T-Lymphozyten aus dem Thymus in den Blutkreislauf und von dort nach sekundären lymphatischen Organe, einschließlich Lymphknoten, Peyer Patches oder Milz, wo sie cognate Antigene treffen. Die B-Lymphozyten im Knochenmark differenzieren und Wandern als naive Zellen in Follikel der sekundären lymphatischen Organe3. Einige dieser B-Zellen Antigen mit ihrem Rezeptor binden und werden durch spezifische T-Zellen aktiviert. Proliferation und Differenzierung dieser B-Zellen schiebt die nicht aktivierte, naive B-Zellen in der Mantelzone des Follikels. Aktivierte Zellen können dann in den Speicher B Zellen, die Patrouille des Körpers, oder in Immunglobulin sezernierenden Plasmazellen, die Migration auf das Knochenmark4Reifen zu unterscheiden.
MCL tritt auf, wenn ein Tumor naive B-Lymphozyten in der Mantelzone verwandeln. Diese Lymphom-Zellen befinden sich in der Mikroumgebung der lymphatischen Organe und vermehren sich unabhängig von spezifischen T-Lymphozyten-Steuerung. Jedoch in einem bestimmten Stadium der Dichte Flucht aus dieser Nische und Umwälzen in die Blutbahn auf der Suche nach Nischen in anderen Organen. In Anbetracht der Komplexität der Adhäsionsmoleküle und die Promiskuität der Chemokine und ihre Rezeptoren der Mechanismus des zellulären Menschenhandel in Vivo kaum verstanden und daher behindert Therapie. Neuartige Methoden genügen, um dieses Migrationsprozesses um die Lymphomzellen B daran hindern, neue Mikroumgebungen effektiv zu blockieren.
MCL ist einer der am schwierigsten zu B-Zell-Tumoren zu behandeln. Die Entwicklung eines neoplastischen Phänotyps MCL ist das Ergebnis einer mehrstufigen Kaskade, zeichnet sich durch den Erwerb von einzigartigen biologischen Eigenschaften. Zum Zeitpunkt der Diagnose stellen die meisten Patienten (70 %) bereits verbreitet Krankheit, mit der Mehrheit der Fälle ausstellenden extranodal Beteiligung an Milz, dem Knochenmark und/oder Magen-Darm-Trakt5,6. Bei behandelten Patienten ist Rückfall von resistenten Tumoren innerhalb weniger Jahre weit verbreitet, obwohl konventioneller Chemotherapie hohe Remissionsraten bei kurzfristigen7,8 induziert. Hier präsentieren wir ein neues Krankheitsmodell, das helfen kann MCL Verbreitung und seine zugrunde liegende Biologie zu verstehen: wir etabliert ein menschliche MCL Xenograft-Maus-Modell aus der primären Tumorzellen des Patienten. Wir hoffen, dass dieses Modell hilft therapeutische Strategien gegen MCL Verbreitung zu entwickeln, und eventuell neue klinische Perspektiven für optimale Diagnose und Behandlung der refraktären Patienten geben.

<table><tbody><tr><td>Ficoll-Paque-Medien</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-02</td><td>zur Trennung von mononukleären Zellen</td></tr><tr><td>RPMI Medium 1640</td><td>Gibco-Life-Technologien</td><td>61870-010</td><td>zur Verdünnung von Blutproben</td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td>Waschen von Zellen</td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8412</td><td>zur Herstellung von PBS mit 1 % BSA, das in Waschzellen während der Isolierung verwendet wird</td></tr><tr><td>CD19-APC700</td><td>Beckman Coulter</td><td>B49212</td><td>humaner pan-B-Zellmarker</td></tr><tr><td>CD20-APC</td><td>Beckman Coulter</td><td>A21693</td><td>humaner pan-B-Zellmarker</td></tr><tr><td>CD20-ECD</td><td>Beckman Coulter</td><td>IM3607</td><td>humaner pan-B-Zellmarker</td></tr><tr><td>CD5-PC 5.5</td><td>Beckman Coulter</td><td>PN A70203</td><td>humaner T-Zellmarker</td></tr><tr><td>CD23-PE</td><td>Pharmingen</td><td>555711</td><td>Zelloberflächenprotein fehlt typischerweise in MCL</td></tr><tr><td>CD45 KO Beckman</td><td>Coulter</td><td>B36294</td><td>Pan-Leukozytenmarker</td></tr><tr><td>CD200-PE</td><td>Pharmingen</td><td>552475</td><td>Zelloberflächenprotein fehlt typischerweise nicht in MCL</td></tr><tr><td>NOD scid gamma (NSG) Mäusen</td> Charles <td>River Laboratories</td><td>5557</td><td>wurde in dieser Studie</td></tr> <tr><td>zur Entwicklung von MCL-Xenotransplantaten verwendetEasy sep Humanes B-Zell-Anreicherungskit</td><td>Stammzelltechnologien</td><td>19054</td><td>zur Anreicherung von B-Zellen zur Gewinnung reiner Zellen für die Injektion in Mäuse</td></tr><tr><td>FACS</td>, <td>Beckman Coulter</td><td>Navios</td><td>zur Charakterisierung von MCL-Proben und zur Untersuchung der Organe für die MCL-Transplantation</td></tr>: <tr><td>1X Ammoniumchlorid, Kaliumpuffer</td><td></td><td></td>, <td>roter Blutlysepuffer (NH4Cl 8.024 mg/l; KHCO3 1.001 mg/l; EDTA. Na2&middot; 2H2O 3,722 mg/l )</td></tr></tbody></table>

tumor engraftment in einem xenograft-maus-modell der menschlichen mantel-zell-lymphom

Tumor Engraftment in a Xenograft Mouse Model of Human Mantle Cell Lymphoma

B-Lymphozyten sind wichtige Akteure im Immunzelle Zirkulation und sie vor allem zu Hause und in den lymphatischen Organen befinden. Während normalen B-Zellen vermehren sich nur, wenn durch T-Lymphozyten stimuliert, Onkogene B-Zellen überleben und autonom in undefinierter Orgel Nischen zu erweitern. Mantel-Zell-Lymphom (MCL) ist eine solche B-Zell-Störung, wo die mediane Überlebenszeit der Patienten von 4-5 Jahren. Dies erfordert die Notwendigkeit wirksamer Mechanismen, durch die das Homing und Engraftment dieser Zellen blockiert werden, um das Überleben zu erhöhen, und Langlebigkeit des Patienten. Daher ist der Aufwand, ein Xenograft-Maus-Modell um die Wirksamkeit von MCL-Therapeutika zu studieren, durch die Blockierung der homing Mechanismus in Vivo zu entwickeln von größter Bedeutung. Entwicklung der tierischen Empfänger für menschliche Zelle Xenotransplantation, frühen Phase Medikamente zu testen haben seit langem verfolgt worden, wie relevanten präklinischen Mausmodelle für neue Therapeutika Bildschirm entscheidend sind. Dieses Tiermodell ist, menschliche Transplantat Ablehnung zu vermeiden und, ein Modell für menschliche Krankheiten entwickelt und es kann sein, dass ein extrem nützliches Werkzeug, Fortschreiten der Erkrankung von verschiedenen Lymphom-Arten zu studieren und Kandidat Drogen für präklinische Tests durchführen hämatologischen malignen Erkrankungen wie MCL. Wir etabliert ein Xenograft-Maus-Modell, die als eine hervorragende Ressource zu erforschen und entwickeln neue therapeutische Ansätze für MCL dienen wird.

Das Manuskript beschreibt eine optimierte Protokoll für die erfolgreiche Entwicklung von einem Xenograft-Maus-Modell für Engraftment MCL Zellen. Vorbereitung einer reinen Zellpopulation (in diesem Fall MCL-Zellen), ist sehr kritisch, erfolgreiche MCL Xenotransplantate zu entwickeln. Abbildung 1 stellt die präparative Schritte zur Isolierung von mononukleären Zellen aus Blut MCL der Patienten durch Dichtetrennung Farbverlauf. Die mononukleären Zellen werden we...

Mantel-Zell-Lymphom (MCL) ist ein schwer zu B-Zell-Störung zu behandeln, und es ist ebenso schwierig, zur Einrichtung eines Xenograft-Maus-Modell der primären MCL zu studieren und Therapeutika zu entwickeln. Hier beschreiben wir die erfolgreiche Etablierung von MCL Xenotransplantate bei Mäusen zu helfen, die zugrunde liegende Biologie zu verstehen.

Tumor Engraftment in einem Xenograft-Maus-Modell der menschlichen Mantel-Zell-Lymphom

B lymphocytes are key players in immune cell circulation and they mainly home to and reside in lymphoid organs. While normal B cells only proliferate when ...

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist die Erstellung eines Xenotransplantat-Mausmodells für das Mantelzell-Lymphom, um Behandlungsstrategien für diese Erkrankung zu entwickeln. Diese Methode kann dabei helfen, zentrale Fragen im Bereich der Hämatonkologie zu beantworten, beispielsweise bezüglich des therapeutischen Wirkungsgrades unterschiedlicher Behandlungsstrategien. Der entscheidende Vorteil dieser Technik liegt darin, dass sie es uns ermöglicht, die Wirkung von Arzneimitteln auf humane Lymphomzellen in vivo zu untersuchen.Die Implikationen dieser Technik reichen bis hin zur Therapie des Mantelzell-Lymphoms, da mit diesem Modell nicht nur, sondern auch bequem der Einfluss einer Therapie auf patientenabgeleitete Zellen untersucht werden kann. Obwohl diese Methode Einblicke in therapeutische Aspekte des Mantelzell-Lymphoms ermöglichen kann, lässt sie sich ebenfalls zur Untersuchung verschiedener Lymphomtypen anwenden. Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten, da es schwierig ist, patientenabgeleitete Xenotransplantate zu erhalten.Als wir erstmals die Idee zu dieser Methode hatten, als wir die Migration von B-Zellen in vivo sowie die Auswirkungen bestimmter Therapien auf diesen Prozess untersuchen wollten. Verdünnen Sie 12 Milliliter Blutprobe aus Mantelzell-Lymphom mit gleichen Volumina RPMI 1640 Medium. Anschließend das Dichtegradientenmedium mehrmals umgedreht mischen, bevor es verwendet wird.Aspirieren Sie 15 Milliliter Dichtegradientenmedium in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Fügen Sie mithilfe eines Aspirators vorsichtig und sanft die verdünnte Blutprobe auf das Dichtegradientenmedium, ohne die beiden Schichten zu vermischen. Schalten Sie dann die Bremse aus und zentrifugieren Sie die Blutprobe bei Raumtemperatur 40 Minuten lang mit 400g.Verwenden Sie eine sterile Pasteurpipette, um die mononukleären Blutzellen aus der mittleren Schicht zu aspirieren und in ein sauberes Gefäß zu überführen. Zum Waschen der mononukleären Zellen geben Sie das Dreifache des geschätzten Zellsuspensionsvolumens an steriler, einfach konzentrierter Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung mit 1 % fetalem Kälberserum hinzu. Pipettieren Sie die Zellsuspension mehrmals, um eine ordnungsgemäße Vermischung zu gewährleisten.Anschließend die Probe bei Raumtemperatur 10–15 Minuten lang bei 400–500 g zentrifugieren. Nach der Zentrifugation das Überstand entfernen und das Zellpellet mit einfach konzentrierter, phosphatgepufferter Kochsalzlösung mit 1 % Rinderserumalbumin waschen. Die Probe erneut zentrifugieren.Entfernen Sie anschließend den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in ein oder zwei Milliliter Phosphatgepufferter Salzlösung. Bestimmen Sie dann die Zellanzahl mithilfe eines automatischen Zellzählgeräts. Verdünnen Sie die Zellen in Phosphatgepufferter Salzlösung, pipettieren Sie die Zellen in ein fünf Milliliter fassendes Polystyrolröhrchen und geben Sie 100 Mikroliter Antikörpercocktail zur Zellsuspension hinzu.Pipettieren Sie die Zellsuspension mehrmals vorsichtig, um sie gut zu mischen. Inkubieren Sie die Zellen anschließend 10 Minuten lang bei Raumtemperatur im laminaren Flusswerk. In der Zwischenzeit wirbeln Sie die magnetischen Partikel aus dem B-Zell-Anreicherungskit 30 Sekunden lang im Vortex. Dann 150 Mikroliter der magnetischen Partikel zu zwei Millilitern Zellsuspension hinzufügen. Die Mischung aus Zellen und magnetischen Partikeln fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Das Probenvolumen auf 2,5 Milliliter einstellen, anschließend das Röhrchen auf das Magnetgestell stellen und weitere drei bis fünf Minuten inkubieren.Nach der Inkubation die Zellsuspension in einer kontinuierlichen Bewegung aus dem am Magneten befestigten Rohr in ein neues Rohr dekantieren. Anschließend die Gesamtausbeute an B-Zellen in der Suspension mithilfe eines automatischen Zellzählgeräts bestimmen. Um die Reinheit der angereicherten B-Zellen zu überprüfen, etwa 50.000 Zellen mit Anti-CD19-, CD20- und Anti-CD45-Antikörpern, die jeweils mit verschiedenen Fluorochromen gekoppelt sind, bei Raumtemperatur 15–30 Minuten lang inkubieren.Waschen Sie die Zellen anschließend mit einem Milliliter eindosiger Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung und 1 % Rinderserumalbumin. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 400–500 × g für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Nach der Zentrifugation wird der Überstand verworfen und das Pellet in 200 Mikrolitern Phosphat-gepufferter Kochalzlösung resuspendiert.Analysieren Sie die Reinheit der B-Zellen mittels Durchflusszytometrie, die bei dieser Methode üblicherweise über 90 % beträgt. Suspendieren Sie die Zellen in 150 Mikroliter eindosiger Phosphat-gepufferter Salzlösung. Injizieren Sie dann die Zellsuspension intravenös in die Schwanzvene von sechs bis sieben Wochen alten Mäusen unabhängig vom Geschlecht.Das intravenöse Injizieren der aus patientenstammendem Blut isolierten Lymphomzellen in die Schwanzvene der Maus ist ebenfalls entscheidend, um eine erfolgreiche Engraftment zu gewährleisten. Nach der Tötung der Mäuse in einer Kohlendioxidkammer sammeln Sie die verschiedenen Organe. Anschließend unterziehen Sie die Organe einer mechanischen Dissoziation durch ein 70-Mikron-Filter mit Hilfe des Kolbens einer Spritze, um eine Einzelzell-Suspension zu erzeugen.Zentrifugieren Sie alle Proben mit Ausnahme von Blut mit 400 bis 500 × g für fünf Minuten und entfernen Sie den Überstand. Verwenden Sie gepufferte Ammonium-Chlorid-Kalium-Lösung in einfacher Konzentration, um Blut-, Knochenmark-, Milz- und Leberzellen zu lysieren. Das Filtern von Zellen, die aus bei Mäusen isolierten Organen stammen, um eine Einzelzell-Suspension zu erhalten, ist wichtig, um eine Verstopfung des Durchflusszytometers zu verhindern.Verwenden Sie spezifische Antikörper gegen B-Zellen, wie anti-CD19, CD20 und CD45, um die Zellen zu färben. Mithilfe der Durchflusszytometrie wurden die aus jedem Organ stammenden B-Zellen mit den Antikörpern CD19-positiv, CD20-positiv und CD45-positiv identifiziert. Basierend auf den selektierten Zellen quantifizieren Sie die organspezifischen und transplantierten Tumorzellen, die von Mäusen stammen, die mit Mantelzell-Lymphom injiziert wurden.In dieser Studie wird die Durchflusszytometrie durchgeführt, um die Reinheit von B-Zellen vor und nach der Anreicherung bei Mantelzell-Lymphom zu untersuchen. Zur Charakterisierung des mononukleären Mantelzell-Lymphoms werden B-Zell-spezifische Marker wie CD45, CD19, CD5, CD200, CD20 Kappa und Lambda verwendet. Die durchflusszytometrische Analyse zeigt Zellen, die positiv für CD45, CD19, CD20 und CD5 färben.Und diese werden zur Charakterisierung ausgewählt. Zellen, die nicht für CD23 und CD200 angefärbt sind, werden ebenfalls ausgewählt. Der Grad der organspezifischen Einwanderung wird untersucht, indem die Organe weiterverarbeitet und mittels Durchflusszytometrie analysiert werden, um B-Zellen nachzuweisen.Hier ist eine vergleichende Darstellung des Engraftment-Musters aus zwei Patienten mit Organen wie Milz, Knochenmark und Leber gezeigt. Sobald die Technik beherrscht ist, kann sie innerhalb von drei Wochen durchgeführt werden. Bei Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die für Xenotransplantate verwendeten PBMCs anzureichern und zudem regelmäßig die Mäuse auf lebenswichtige Anzeichen von Krankheit wie gesträubtes Fell, krummen Rücken, Lähmung der Hinterbeine und Gewichtsverlust zu überprüfen.Nach dieser Methode könnten Xenotransplantate auf andere Arten von Lymphomen angewendet werden, beispielsweise um eine personalisierte Medizin durchzuführen. Nach ihrer Entwicklung könnte diese Technik anderen Forschern auf dem Gebiet der Hämatonkologie den Weg ebnen, um Möglichkeiten zu erforschen, wie man Mantelzell-Lymphome, die von Patienten stammen, in immundefizienten NOD-SCID-Mäusen etablieren kann. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie eine gute Vorstellung davon haben, wie man aus Patienten gewonnene PBMCs aufreinigt und verwendet, um immundefiziente Mäuse zu xenotransplantieren, um die Strategie von Therapien zu verstehen.Bitte beachten Sie, dass das Arbeiten mit primären menschlichen Blutproben äußerst gefährlich sein kann und dass stets Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen getroffen werden sollten, wenn diese Verfahren durchgeführt werden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

Ein Verfahren zur sicheren Pfropfen Luciferase-markierten menschlichen malignen peripheren Nervenscheide Tumorzellen in den Ischiasnerv von immundefizienten Mäusen beschrieben. Der Einsatz von Biolumineszenz-Bildgebung, um die ordnungsgemäße Errichtung von Tumor Transplantate und Kriterien für die zufällige Trennung der Tiere in Arbeitsgruppen zeigen, werden ebenfalls diskutiert.

Orthotopen Xenografting of Human Luciferase-Tagged malignen peripheren Nervenscheide Tumorzellen für In vivo Prüfung von Kandidaten Therapeutika

Dieses Video zeigt einen Assay zur Generierung eines humanisierten Xenotransplantat-Mausmodells. Einer immungeschwächten Maus wird Cyclophosphamid injiziert, um eine Depletion der Immunzellen zu verursachen. Vom Patienten stammende Tumorzellen, die mit humanen mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) in einem Hydrogel vermischt sind, werden subkutan in die Maus injiziert, wodurch ein Tumor mit infiltrierenden T-Zellen entsteht.

Eine Technik zur Generierung eines humanen PBMC-transplantierten humanisierten Xenotransplantat-Mausmodells

Menschen Tumorxenotransplantaten in immundefizienten Mäusen sind wertvolle Werkzeuge, um Krebsbiologie zu studieren. Spezifische Protokolle subkutane und intra-Heterotransplantate aus menschlichen Leberzellkarzinom-Zellen oder Tumorfragmente zu erzeugen, werden beschrieben. Leberregeneration nach partieller Hepatektomie in Empfängermäuse induziert wird, als eine Strategie, um intra-Transplantation zu erleichtern präsentiert.

Generierung von subkutanen und Intrahepatische Menschenleberzellkarzinom Xenografts in immundefizienten Mäusen

Humanen multiplen Myelom (MM) Zellen erfordern die Mikroumgebung, die von mesenchymalen Zellen und extrazellulären Matrixkomponenten für das Überleben und die Proliferation. Wir gründeten eine in vivo Hühnerembryo-Modell mit eingepflanzten menschlichen Myelom und mesenchymalen Zellen zu Wirkungen von Krebsmedikamenten auf das Tumorwachstum, Invasion und Angiogenese zu untersuchen.

Einrichtung eines Menschen Multiple Myeloma Xenograftmodell im Huhn, das Tumorwachstum, Invasion und Angiogenese Studieren

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Vorbereitung und der stereotaktischen Verwaltung der allogenen menschlichen Lymphozyten in immungeschwächte Mäuse tragen orthotopen menschlichen primären Hirntumoren. Diese Studie liefert eine Machbarkeitsstudie für die Machbarkeit und die Antitumor-Wirksamkeit von zellulären Immuntherapien Intrabrain geliefert.

Stereotaktische Adoptiv Übertragung von zytotoxischen Immunzellen in murinen Modellen der Orthotopen Human Glioblastoma Multiforme Xenotransplantate

Hier verwenden wir Biolumineszenz, Röntgen und Positronen-Emissions-Tomographie/berechnet Tomographie Bildgebung wie hemmende mTOR-Aktivität zu studieren Auswirkungen des Knochenmarks pfropfte Myelom Tumoren in einem Xenograft-Modell. Dies ermöglicht eine physiologisch relevante, nicht-invasive und multimodalen Analysen der Anti-Myelom-Wirkung von Therapien gezielt Knochenmark pfropfte Myelom Tumoren in Vivo.

Multimodale Biolumineszenz und Positronic-Emissions-Tomographie/Computational Tomographie Bildgebung des multiplen Myeloms Knochenmark Xenotransplantate NOG Mäuse

Hier stellen wir ein Protokoll zur Induzieren und Bewertung von Krankheiten bei einem xenogenen Transplantat-versus-Host-Krankheitsmodell (XenoGVHD) vor. xenoGVHD bietet ein In-vivo-Modell zur Untersuchung der Immunsuppression menschlicher T-Zellen. Darüber hinaus beschreiben wir, wie man menschliche T-Zellen in Geweben mit digitaler PCR als Werkzeug zur Quantifizierung der Immunsuppression erkennt.

Induktion und Bewertung der Graft-Versus-Host-Krankheit in einem xenogenen Murine-Modell und Quantifizierung menschlicher T-Zellen in Mausgeweben mit digitaler PCR

Wir beschreiben eine menschliche periphere Mononuklezelle (PBMC) – basierendes humanisiertes Xenograft-Mausmodell für translationale Immunonkologieforschung. Dieses Protokoll könnte als allgemeine Leitlinie für die Erstellung und Charakterisierung ähnlicher Modelle für die Bewertung von I-O-Therapien dienen.

A Human Peripheral Blood Mononuclear Cell (PBMC) Engrafted Humanized Xenograft Model for Translational Immuno-oncology (I-O) Research

Das aktuelle Protokoll beschreibt Methoden zur Etablierung von vom Patienten abgeleiteten Xenograft-Modellen (PDX) und primären Krebszelllinien aus chirurgischen Magenkrebsproben. Die Methoden sind ein nützliches Instrument für die Arzneimittelentwicklung und die Krebsbiologieforschung.

Etablierung von vom Magenkrebs abgeleiteten Xenograft-Modellen und Primärzelllinien

Orthotopische humane Leber metastasierenuvealmelanom xenograft MausModelle wurden mit chirurgischen orthotopischen Implantationstechniken mit Patienten-abgeleiteten Tumorstück und Nadelinjektionstechniken mit kultivierten menschlichen uvealen Melanom-Zelllinien erstellt.

Generierung einer Leber orthotopischen Human Enuveal Melanom Xenograft Plattform bei immundefizienten Mäusen

Das vorliegende Protokoll beschreibt, wie menschliche Haut auf nicht-adipöse diabetische (NOD)-scid-Interleukin-2-Gamma-Kettenrezeptor-Mäuse (NSG) transplantiert werden kann. Eine detaillierte Beschreibung der Vorbereitung der menschlichen Haut für die Transplantation, der Vorbereitung von Mäusen für die Transplantation, der Transplantation der Split-Thickness der menschlichen Haut und des Wiederherstellungsverfahrens nach der Transplantation sind in dem Bericht enthalten.

Xenograft-Hautmodell zur Manipulation menschlicher Immunantworten in vivo

Erfahren Sie die Xenotransplantation von Mantelzell-Lymphomzellen in immunodefiziente Mäuse zur Entwicklung neuer Therapiestrategien. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Behandlungseffekten an patientenstammigen Zellen in vivo.

Tumor Engraftment in einem Xenograft-Maus-Modell der menschlichen Mantel-Zell-Lymphom

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