Quantitative Immunhistochemie der zellulären Mikroumgebung bei Patienten-Glioblastom-Resektionen

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist die quantitative Identifizierung von Komponenten der Tumormikroumgebung in Glioblastom-Patientenresektionen mit Hilfe der chromogenen Immunhistochemie und der Bildaufnahme J. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Tumormikroumgebung zu beantworten, z. B. wie diese Komponenten in Patientenproben aussehen und wie wir physiologisch relevante Verhältnisse von Zellen bestimmen können. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie für die Analyse in Patientenproben einfach ist. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Aufklärung der untercharakterisierten, komplexen Mikroumgebung von Glioblastom-Tumoren.

Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da der Zeitpunkt der chromogenen Entwicklung genau überwacht werden muss, um eine Überentwicklung und Sättigung des Gewebes zu verhindern. Beginnen Sie das Protokoll, indem Sie die im begleitenden Textprotokoll angegebenen Waschvorgänge durchführen. Verdünnen Sie Tris-basierte Antigen-Demaskierungslösung mit hohem pH-Wert und destilliertes Wasser gemäß den Empfehlungen des Herstellers.

Fahren Sie mit der wärmevermittelten Antigengewinnung fort, indem Sie die verdünnte Demaskierungslösung in ein nicht verschlossenes mikrowellengeeignetes Gefäß geben. Schieben Sie die Objektträger in das Gefäß. Stellen Sie dann die Objektträger in die Mikrowelle.

Kochen Sie das Gefäß anschließend 20 Minuten lang bei hoher Leistung. Überwachen Sie den Flüssigkeitsstand auf Verdunstung und füllen Sie das Gefäß bei Bedarf mit destilliertem Wasser auf. Die Proben eine Stunde lang bei Raumtemperatur in Lösung abkühlen lassen.

Umranden Sie die Gewebeprobe mit einem hydrophoben, um das Volumen der Reagenzien zu minimieren, die zum Abdecken der Probe erforderlich sind. Gießen Sie dann genügend Permeabilisierungslösung von 100 bis 200 Mikrolitern ein, um die Gewebeprobe zu bedecken. Entfernen und verwerfen Sie die Lösung und bedecken Sie die Gewebeprobe erneut mit Permeabilisierungslösung.

Die Proben werden eine Stunde lang bei Raumtemperatur mit Blockierlösung inkubiert. Inkubieren Sie die Proben dann über Nacht bei vier Grad Celsius mit Primärantikörpern, die in Blockierungslösung verdünnt sind. Am nächsten Tag weisen Sie Primärantikörper mit einem Meerrettichperoxidase-Polymerreagenz nach, das dem primären Antikörper des Wirtstieres entspricht.

Gießen Sie so viel Permeabilisierungslösung ein, dass die Gewebeprobe bedeckt ist, und inkubieren Sie die Probe fünf Minuten lang. Die Lösung entfernen, verwerfen und die Gewebeprobe noch einmal fünf Minuten lang mit Permeabilisierungslösung bedecken. Inkubieren Sie die Objektträger 15 Minuten lang in 0,3 % Wasserstoffperoxid und IX TBS.

Entwickeln Sie die Proben mit einem Peroxidase-, Diaminobenzidin- oder Tupfsubstrat für zwei bis 10 Minuten, bis die gewünschte Färbeintensität erreicht ist. Färben Sie die Proben gegen, um Zellkerne zu identifizieren, z. B. mit Hämatoxylin gemäß dem Herstellerprotokoll. Proben mit 100%Ethanol und Xylol dehydrieren.

Abschließend montieren Sie die Proben dauerhaft mit Eindeckmedien. Zwei interessante Regionen innerhalb unserer Tumorresektionen, der Primärtumor Bulk und die angrenzenden Regionen, die hauptsächlich aus gesundem Gewebe mit diffusen eindringenden Krebszellen bestehen, wurden von einem zusammenarbeitenden Neuropathologen an Hämatoxylin- und Eosin-gefärbten Patientenproben identifiziert. Die chromogene Immunhistochemie identifizierte eine positive Färbung von Astrozyten, Mikroglia und Oligodendrozyten in jeder Patientenprobe.

Wir führten eine Färbung ohne primären Antikörper für eine Negativkontrolle durch. Der Hersteller empfahl und weitere Verdünnungen, bevor er sich für die Verdünnung von 1 bis 200 entschied, aufgrund einer optimalen positiven Färbung des Zellkörpers und des Prozesses mit minimierendem Hintergrund für den Anti-ALDH 1l1-Antikörper. Unter Verwendung von Bild J wurde die prozentuale Abdeckung der OSP-1-positiven Oligodendrozytenfärbung quantifiziert, um schließlich die Unterschiede in unseren interessierenden Regionen zu vergleichen.

Sobald der entsprechende Schwellenwert auf das Bild angewendet wurde, kann die prozentuale Abdeckung des Schwellenwerts für mehrere Patienten gemessen und verglichen werden. Fünf benachbarte und große Regionen von Glioblastom- oder GBM-Patientenproben wurden zusammen mit gesundem Hirngewebe verglichen, um eine Oligodendrozyten-spezifische Proteinabdeckung von einem oder OSP1-Prozent zu erreichen. Einmal gemeistert, kann die Färbetechnik am ersten Tag in vier Stunden und am zweiten Tag in zwei Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird.

Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, die Intensität der Gewebefärbung und die Hydratation genau zu überwachen.