Name: Quantitative Immunhistochemie der zellulären Mikroumgebung bei Patienten-Glioblastom-Resektionen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 45 s
Description: Lernen Sie die quantitative Immunhistochemie zur Analyse der zellulären Mikroumgebung in Glioblastom-Patientenproben mit ImageJ. Diese Methode ermöglicht die Bestimmung physiologisch relevanter Zellverhältnisse.

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Die Autoren danken Drs. Fahad Bafakih und Jim Mandell für die Erfassung und Identifizierung von Patientenproben, Garrett F. Beeghly für die Unterstützung der Immunhistochemie sowie die Biorepository und Tissue Research Facility, das Herz-Kreislauf-Forschungszentrum Histology Core und die Biomolekulare Analyse-Fazilität an der University of Virginia für die Unterstützung mit Probenerfassung, Immunhistochemie und Bildgebung.

Dieses Protokoll identifiziert zelluläre Komponenten in Formalin-fixierten Paraffin-eingebetteten (FFPE) Proben, wie es für klinische Patientenproben typisch ist. Paraffin Einbettung ermöglicht die beste Aufrechterhaltung der Zell-und Gewebe-Morphologie sowie eine bessere Langlebigkeit der Abschnitte. Die Proben für diese Analyse wurden durch die University of Virginia Biorepository und Tissue Research Facility zugegriffen. Patientenproben wurden von einem Neuropathologen ausgewählt, der auf einer endgültigen Diagnose des Glioblastoms (Astrozytom, WHO-Grad IV) basierte, der zwischen 2010 und 2013 an der Universität von Virginia Tumorresektionen abgeschlossen hatte und vor dieser Analyse entdeckt wurde 11 . 1. FFPE-Probenentparaffinierung und Rehydratation HINWEIS: Dieser Teil des Protokolls ist spezifisch für FFPE-Proben. Während Paraffin-eingebettete Proben für diese Analyse aufgrund der Konservierung von zellulären und t nützlicher sein könnenIssue Morphologie, diese Analyse kann auch mit eingefrorenen Abschnitten durchgeführt werden. Bei Verwendung von gefrorenen Abschnitten kann dieser Teil weggelassen werden und gehen direkt zur chromogenen Immunhistochemie über. <ol><li> Führen Sie die folgenden Waschungen für jeweils 5 min aus: Xylol, Xylol, 100% Ethanol, 100% Ethanol, 95% Ethanol, 95% Ethanol, 70% Ethanol, entionisiertes Wasser, entionisiertes Wasser </li></ol> 2. Antigen Retrieval HINWEIS: Dieser Teil des Protokolls ist notwendig, um die bei der Formalin-Fixierung von FFPE-Proben gebildeten Methylenbrücken zu brechen und Antigen-Stellen für Antikörper zu binden. <ol><li> Verdünnen Sie die Tris-basierte Hoch-pH-Antigen-Entmaskungslösung bei der Herstellerempfehlung in destilliertem Wasser. </li><li> Führen Sie eine wärmevermittelte Antigen-Retrieval mit einer Mikrowelle durch. Andere Formen der wärmevermittelten Retrieval (wie Dampfkochtopf, Gemüsedampfer oder kochendes Wasser) würden ebenfalls ausreichen. <ol><li> Die verdünnte Entlüftungslösung in eine nicht versiegelte mikrowellengeeignete gebenSchiff. Legen Sie die Schienen in das Gefäß. Legen Sie Dias in Mikrowelle. </li><li> Kochen für 20 min bei hoher Leistung. Überwachen Sie die Flüssigkeitsspiegel für die Verdunstung und füllen Sie mit destilliertem Wasser nach Bedarf. </li></ol></li><li> Proben in 1 Stunde bei Raumtemperatur abkühlen lassen. </li></ol> 3. Chromogene Immunhistochemie <ol><li> Umrisse Gewebeprobe mit einem hydrophoben Stift, um das Volumen der Reagenzien zu minimieren, die notwendig sind, um die Probe zu bedecken. HINWEIS: Seien Sie sicher, dass die Gewebeproben hydratisiert werden und lassen Sie sie nicht austrocknen, da dies die Verfärbungswirkung beeinträchtigen wird. </li><li> Pipet genug Permeabilisierungslösung (Tris-gepufferte Kochsalzlösung (TBS) + 0,01% Triton-X) zur Deckung der Gewebeprobe (typischerweise etwa 100 - 200 μl). </li><li> Entfernen und verwerfen Sie die Lösung und wiederholen Sie Schritt 3.2. </li><li> Inkubieren von Proben bei Raumtemperatur mit Blockierungslösung (2,5% Pferdeserum + Permeabilisierungslösung). </li><li> Inkubieren Sie Proben über Nacht in 4 ºC mit primären Antikörpern verdünntIn Blockierlösung HINWEIS: Alle hier verwendeten Primärantikörper werden bei 1: 200 verdünnt, aber optimale Verdünnungen können mit seriellen Verdünnungen beginnend mit Herstellerempfehlung bestimmt werden. Detaillierte Informationen zu den in diesem Protokoll verwendeten Antikörpern wurden zuvor veröffentlicht 11 . </li><li> Detektion von primären Antikörpern unter Verwendung eines Meerrettich-Peroxidase-Polymerreagenzes, das dem primären Antikörper-Wirtstier entspricht, nach dem Herstellerprotokoll. </li><li> Pipet genug Permeabilisierungslösung zur Deckung der Gewebeprobe und inkubieren für 5 min. </li><li> Entfernen und entwerfen Lösung und wiederholen Sie Schritt 3.7. </li><li> Inkubieren von Objektträgern in 0,3% H 2 O 2 in 1x TBS für 15 min. </li><li> Entwickeln Sie Proben mit einem Peroxidase-Diaminobenzidin (DAB) -Substrat für 2 - 10 min, bis die gewünschte Fleckenintensität erreicht ist. </li><li> Gegenstichproben zur Identifizierung von Zellkernen, wie z. B. mit Hämatoxylin, nach Herstellerprotokoll. </li><li> Proben mit 100%Ethanol und Xylol. </li><li> Befestigen Sie die Proben dauerhaft mit dem Montagemedium. </li></ol> 4. Zinsanweisungen <ol><li> Bild-Dias unter Hellfeld-Mikroskopie in der Lage, hochauflösende Bilder. HINWEIS: Verwenden Sie bildgebende zellulare Komponenten mit einer Auflösung von mindestens 20x. </li><li> Bewegen Sie die Kamera zu bestimmten Regionen von Interesse in Gewebeproben. </li><li> Bilder als TIFF-Dateien zur Quantifizierung speichern </li></ol> 5. Bildanalyse <ol><li> Öffnen Sie Bilder in ImageJ für die Quantifizierung der prozentualen Abdeckung. </li><li> Verwenden Sie das Threshold Color Plugin, um die lila Farbe von Hämatoxylin-gefärbten Kernen zu entfernen. </li><li> Bild in 8-Bit umwandeln. </li><li> Schwellenwert ohne dunklen Hintergrund hinzufügen. </li><li> Prozessbild unter Verwendung eines der 17 vorgespannten ImageJ-Schwellenfilter ( dh MaxEntropy), so dass nur DAB-gefärbte Teile in der Schwelle enthalten sind. HINWEIS: Wählen Sie den optimierten vorgespannten Schwellenfilter, der minimiertEs Einbeziehung der Hintergrundfärbung. Dies kann von der Qualität der Färbung und Spezifität des Antikörpers abhängen. Verwenden Sie die gleiche Schwelle für alle technischen Replikate innerhalb jeder Patientenprobe. </li><li> Schwellenwert anwenden </li><li> Messen Sie den prozentualen Bereich des Schwellenwertes. </li><li> Durchschnittliche prozentuale Flächendeckung für mehrere Regionen innerhalb jeder Probe. </li></ol>

<ol><li>Claes, A., Idema, A. J., Wesseling, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffuse+glioma+growth%3A+a+guerilla+war%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Diffuse glioma growth: a guerilla war.</a> Acta Neuropathol. 114 (5), 443-458 (2007).</li>
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<li>Rath, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+Enhance+the+Invasion+Potential+of+Glioblastoma+Stem-Like+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Astrocytes Enhance the Invasion Potential of Glioblastoma Stem-Like Cells.</a> PLoS One. 8 (1), e54752(2013).</li>
</ol>

Unsere hier vorgeschlagene Methode ist ein quantitativer Ansatz zur Analyse von histologischen Proben, die mit der traditionellen chromogenen Immunhistochemie gefärbt wurden. Die aktuelle Methodik für diese Art von Analyse umfasst ähnliche Färbeprotokolle, gefolgt von der Einstufung durch unabhängige Pathologen. Diese Methode ist zuverlässig, aber für eine Reihe von Anwendungen ist ein präziseres Verständnis der zellulären Make-up erforderlich, wie ein besseres Verständnis der Heterogenität im Zusammenhang mit Tumoren u...

Glioblastom (GBM), der häufigste und bösartige Hirntumor, zeichnet sich durch eine stark diffuse Invasion aus der primären Tumormasse in das umgebende gesunde Gehirnparenchym 1 , 2 aus . Diese diffuse Invasion macht den Tumor besonders schwierig, vollständig zu resezieren, und die eindringenden Krebszellen, die nach der Therapie bleiben, ist der häufigste Grund für unvermeidliches Rezidiv 2 , 3 , 4 . Bisher fanden wir die diffuse Gliom Zellinvasion Hemmung therapeutisch vorteilhaft 5, wird jedoch wenig über die komplexen Mechanismen bekannt ist GBM Invasion beitragen. Die Tumor-Mikroumgebung oder das Gewebe, das den Krebs umgibt, wurde in die Progression von Tumoren in mehreren Krebsarten 6 , 7 verwickelt. Die Glioblastom-Tumor-Mikroumgebung, in pArtikulär, ist relativ unter- charakterisiert und ist eindeutig komplex und komponiert mehrere Gliazellen wie Astrozyten, Mikroglia und Oligodendrozyten sowie extrazelluläre Matrix, lösliche Faktoren und biophysikalische Faktoren. Experimentell wurde gezeigt, dass Astrozyten und Mikroglia die Gliomprogression und Invasion 8 , 9 , 10 erhöhen, aber die Zusammensetzung aller Gliazellen in der nativen menschlichen Gehirnmikroumgebung ist unbekannt. Wir haben zuvor gezeigt, dass mikroumweltliche Komponenten das Überleben des Patienten durch quantitative Analyse der zellulären Komponenten der Glioblastom-Mikroumgebung vorhersagen und unsere Analysen in ein proportionales Gefahrenmodell 11 einbinden können. Hier beschreiben wir die quantitative Analyse Methode zur Identifizierung der Populationen von Gliazellen innerhalb der Tumor-Masse und angrenzenden Regionen der Tumor-Resektionen von Glioblastom-PatientenS. Wir verwendeten die chromogene Immunhistochemie, um die Gliazellpopulationen und ImageJ zu identifizieren, um die prozentuale Abdeckung der Färbung für jede Gliapopulation zu analysieren. Die Beurteilung der prozentualen Abdeckung schafft eine einfache Messung zur Bestimmung der morphologischen Unterschiede der Zellen, insbesondere derjenigen, die durch Wechselwirkungen mit Krebszellen betroffen sind. Frühere Studien zur Quantifizierung der histopathologischen Färbung verwenden Standardfärbung wie Hämatoxylin und Eosin 12 oder Masson&#39;s Trichrom 13 , die nicht die Spezifität der Antikörper-basierten Immunhistochemie-Färbung nutzen. Unsere Methode wurde entwickelt, um die Gliapopulationen innerhalb der Glioblastom-Patienten-Tumor-Resektionen direkt zu quantifizieren, die wir zur Aufklärung der komplexen Glioblastom-Mikroumgebung anstreben.

<table><tbody><tr><td>Xylol</td><td>Fisher Chemical</td><td>X3P</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antigen-Demaskierungslösung mit hohem pH-Wert</td><td>Vector Labs</td><td>H-3301</td><td></td></tr><tr><td>TBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>Amresco</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Pferdeserum</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-ALDH1L1&nbsp;</td><td>abcam&nbsp;</td><td>ab56777</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Iba1&nbsp;</td><td>abcam&nbsp;</td><td>ab5076</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Oligodendrozyten-spezifisches Protein1&nbsp;</td><td>abcam&nbsp;</td><td>ab53041</td><td></td></tr><tr><td>ImmPRESS Anti-Ziege</td><td>Vector Labs</td><td>MP-7405</td><td></td></tr><tr><td>ImmPRESS Universal (Anti-Maus/Kaninchen)</td><td>Vector Labs</td><td>MP-7500</td><td></td></tr><tr><td>Wasserstoffperoxid</td><td>Sigma Aldrich</td> 216763 ImmPACT <td>DAB-Substrat</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Vector Labs</td><td>SK-4105</td><td></td></tr><tr><td>Hämatoxylin-Gegenfärbung</td><td>ThermoScientific</td><td>72404</td><td></td></tr><tr><td>Histochoice Eindeckmedien</td><td>Amresco</td><td>H157-475</td><td></td></tr><tr><td>Aperio Scanscope</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image Scanscope</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Super HT PAP Pen</td><td>Research Products International</td><td>195506</td><td></td></tr></tbody></table>

quantitative immunhistochemie der zellulären mikroumgebung bei patienten-glioblastom-resektionen

Quantitative Immunohistochemistry of the Cellular Microenvironment in Patient Glioblastoma Resections

Mit dem wachsenden Interesse an der Tumor-Mikroumgebung haben wir uns bemüht, eine Methode zur spezifischen Bestimmung der Mikroumgebungskomponenten innerhalb von Patientenproben von Glioblastom, dem tödlichsten und am meisten invasiven Hirntumor, zu entwickeln. Es sind nicht nur quantitative Methoden, die für die genaue Beschreibung von erkrankten Geweben von Vorteil sind, sondern auch potenziell zu einer genaueren Prognose, Diagnose und Entwicklung von gewebetechnischen Systemen und Ersetzungen beitragen. Im Glioblastom wurden Gliazellen, wie Mikroglia und Astrozyten, unabhängig mit einer schlechten Prognose auf der Grundlage der Pathologieabstufung korreliert. Der Zustand dieser Zellen und anderer Gliazellenkomponenten ist jedoch nicht quantitativ gut beschrieben worden. Dies kann aufgrund der großen Prozesse, die diese Gliazellen markieren, schwierig sein. Darüber hinaus konzentrieren sich die meisten histologischen Analysen auf die gesamte Gewebeprobe oder nur innerhalb der Masse des Tumors, im Gegensatz zu der Abgrenzung von Quantifizierungen, die auf Regionen basierenHin das sehr heterogene Gewebe. Hier beschreiben wir eine Methode zur Identifizierung und quantitativen Analyse der Populationen von Gliazellen innerhalb der Tumormasse und angrenzenden Regionen der Tumorresektionen von Glioblastompatienten. Wir verwendeten die chromogene Immunhistochemie, um die Gliazellpopulationen bei Patienten-Tumor-Resektionen und ImageJ zu identifizieren, um die prozentuale Abdeckung der Färbung für jede Glia-Population zu analysieren. Mit diesen Techniken sind wir in der Lage, die Gliazellen in allen Regionen der Gliom-Tumor-Mikroumgebung besser zu beschreiben.

Für diese Analyse wurden zwei Interessenbereiche innerhalb unserer Tumorresektionen - die primäre Tumormasse und die angrenzenden Regionen, die in erster Linie aus gesundem Gewebe mit diffus eindringenden Krebszellen zusammengesetzt waren ( Abbildung 1A , 1B ) - durch die Zusammenarbeit von Neuropathologen an Hämatoxylin- und Eosin-gefärbten Patienten identifiziert Proben. Innerhalb jeder Patientenprobe wurde eine positive Färbung für Astroz...

Dieses Protokoll wurde entwickelt, um Tumor-Mikroumgebungs-Komponenten in Glioblastom-Patienten-Resektionen mit chromogener Immunhistochemie und ImageJ quantitativ zu identifizieren.

Quantitative Immunhistochemie der zellulären Mikroumgebung bei Patienten-Glioblastom-Resektionen

With the growing interest in the tumor microenvironment, we set out to develop a method to specifically determine the microenvironment components within ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, die Komponenten der Tumormikroumgebung in Resektionsproben von Glioblastom-Patienten mithilfe chromogener Immunhistochemie und ImageJ quantitativ zu identifizieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Tumormikroumgebung zu beantworten, beispielsweise wie diese Komponenten in Patientenproben aussehen und wie wir physiologisch relevante Zellverhältnisse bestimmen können. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie eine einfache Analyse an Patientenproben ermöglicht. Die Anwendung dieser Technik trägt dazu bei, die bisher wenig charakterisierte, komplexe Mikroumgebung des Glioblastoms besser zu verstehen.Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten, da die Inkubationszeit für die chromogene Entwicklung genau überwacht werden muss, um eine Überentwicklung und Sättigung des Gewebes zu vermeiden. Beginnen Sie das Protokoll, indem Sie die in der begleitenden Textanleitung angegebenen Waschschritte durchführen. Verdünnen Sie die auf Tris basierende Antigen-Aufschlusslösung mit hohem pH-Wert und destilliertem Wasser gemäß den Empfehlungen des Herstellers.Fahren Sie mit der hittevermittelten Antigenfreisetzung fort, indem Sie die verdünnte Enthüllungslösung einem nicht versiegelbaren, mikrowellengeeigneten Behälter hinzufügen. Legen Sie die Objektträger in den Behälter. Stellen Sie anschließend den Behälter mit den Objektträgern in die Mikrowelle.Anschließend das Gefäß 20 Minuten bei hoher Leistung zum Kochen bringen. Den Flüssigkeitsstand auf Verdunstung überwachen und das Gefäß bei Bedarf mit destilliertem Wasser auffüllen. Die Proben eine Stunde lang bei Raumtemperatur in der Lösung abkühlen lassen.Umreißen Sie die Gewebeprobe mit einem hydrophoben Stift, um das Volumen an Reagenzien, das zum Bedecken der Probe erforderlich ist, zu minimieren. Geben Sie anschließend 100 bis 200 Mikroliter Permeabilisierungslösung hinzu, um die Gewebeprobe zu bedecken. Entfernen und entsorgen Sie die Lösung, und bedecken Sie die Gewebeprobe erneut mit Permeabilisierungslösung.Die Proben eine Stunde bei Raumtemperatur mit der Blockierungslösung inkubieren. Anschließend die Proben über Nacht bei vier Grad Celsius mit in der Blockierungslösung verdünnten primären Antikörpern inkubieren. Am nächsten Tag die primären Antikörper mithilfe eines den primären Antikörpern entsprechenden Horseradish-Peroxidase-Polymer-Reagenzes entsprechend dem Wirtstier des primären Antikörpers nachweisen.Geben Sie so viel Permeabilisierungslösung hinzu, dass die Gewebeprobe bedeckt ist, und inkubieren Sie die Probe fünf Minuten lang. Entfernen und entsorgen Sie die Lösung und bedecken Sie die Gewebeprobe erneut mit Permeabilisierungslösung für fünf Minuten. Inkubieren Sie die Objektträger 15 Minuten lang in 0,3 % Wasserstoffperoxid und IX TBS.Entwickeln Sie die Proben mit einem Peroxidase-Diaminobenzidin- oder DAB-Substrat für zwei bis 10 Minuten, bis die gewünschte Färbungsintensität erreicht ist. Gegengefärbte Färbung der Proben, um die Zellkerne sichtbar zu machen, beispielsweise mit Hämatoxylin gemäß Herstellervorschrift. Dehydrieren Sie die Proben mit 100 % Ethanol und Xylol.Schließlich die Proben mit Einbettungsmedium dauerhaft eindecken. Zwei interessierende Bereiche innerhalb unserer Tumorresektionen, der primäre Tumor-Bulk und die angrenzenden Regionen, die hauptsächlich aus gesundem Gewebe mit diffus eindringenden Krebszellen bestehen, wurden von einem kooperierenden Neuropathologen anhand von hämatoxylin- und eosin-gefärbten Patientenproben identifiziert. Die chromogene Immunhistochemie zeigte eine positive Färbung für Astrozyten, Mikroglia und Oligodendrozyten in jeder Patientenprobe nach.Wir führten eine Färbung ohne primären Antikörper als Negativkontrolle durch. Der Hersteller empfahl weitere Verdünnungen, bevor man sich für die 1:200-Verdünnung entschied, da diese eine optimale positive Färbung des Zellkörpers und der Fortsätze bei gleichzeitiger Minimierung der Hintergrundfärbung für den Anti-ALDH1L1-Antikörper ergab. Mithilfe von ImageJ wurde der prozentuale Bedeckungsgrad der OSP-1-positiven Oligodendrozytenfärbung quantifiziert, um letztendlich Unterschiede in unseren interessierenden Regionen vergleichen zu können.Nachdem der geeignete Schwellenwert auf das Bild angewendet wurde, kann die prozentuale Bedeckung anhand des Schwellenwerts gemessen und für mehrere Patienten verglichen werden. Fünf benachbarte und umfassende Bereiche von Glioblastom- oder GBM-Patientenproben sowie gesundes Hirngewebe wurden hinsichtlich der prozentualen Bedeckung durch das oligodendrozytenspezifische Protein eins oder OSP1 verglichen. Wenn die Färbetechnik beherrscht ist, kann sie am ersten Tag innerhalb von vier Stunden und am zweiten Tag innerhalb von zwei Stunden durchgeführt werden, sofern sie ordnungsgemäß ausgeführt wird.Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die Färbungsintensität und Hydratation des Gewebes sorgfältig zu überwachen.

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Quelle: Núñez, F. J., et al. Bewertung von Biomarkern bei Gliomen durch Immunhistochemie an paraffineingebetteten 3D-Gliom-Neurosphärenkulturen. J. Vis. exp. (2019). Dieses Video demonstriert eine immunhistochemische Technik zur Markierung von Tumor-Biomarkern in paraffineingebetteten Hirntumor-Neurosphären. Die Neurosphärenabschnitte werden einer Paraffinentfernung und Rehydrierung unterzogen, gefolgt von einer Behandlung, um Biomarkerstellen freizulegen. Primär- und Sekundärantikörper werden...

Immunhistochemische Färbung von Biomarkern in Hirntumor-Neurosphärenschnitten

Protokoll zur Verbreitung von dissoziierten hochgradigen chirurgischen Gliomproben im serumfreien Neurosphärenmedium zur Auswahl für Zellen mit Krebsstammzellphänotyp. Für Proben, die nicht als Neurosphären wachsen, wird ein alternatives Protokoll vorgeschlagen. Eine Paraffin-Einbettungstechnik zur Aufrechterhaltung der 3D-Neurosphärenarchitektur für die Immunzytochemie wird beschrieben.

Optimierung der hochwertigen Gliom-Zellkultur von chirurgischen Proben für den Einsatz in klinisch relevanten Tiermodellen und 3D-Immunchemie

Dargestellt ist hier die einfache Methode zur Isolierung und Durchflusszytometrieanalyse Gliom-infiltrierenden mononukleären peripheren Blutzellen, die zeitabhängige quantitative Daten über die Anzahl und Aktivierungsstatus von Immunzellen in das Gehirn frühen Tumorumgebung ergibt.

Isolierung und Analyse über Durchflusszytometrie von Gliom-Infiltration peripheren mononukleären Blutzellen

Hier beschreiben wir eine Methode zum Trennen und Bestandteil der Tumor immun und nicht-immunen Mikroumgebung in etablierte subkutane Tumoren zu bereichern. Diese Technik ermöglicht die separate Analyse der Tumor immun infiltrieren und nicht-immunen Tumor Fraktionen die umfassende Charakterisierung der Tumor immun Mikroumgebung ermöglichen können.

Bereicherung und Charakterisierung von dem Tumor immun und nicht-immunen Mikroumgebungen in etablierte subkutane murinen Tumoren

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Vorbereitung und der stereotaktischen Verwaltung der allogenen menschlichen Lymphozyten in immungeschwächte Mäuse tragen orthotopen menschlichen primären Hirntumoren. Diese Studie liefert eine Machbarkeitsstudie für die Machbarkeit und die Antitumor-Wirksamkeit von zellulären Immuntherapien Intrabrain geliefert.

Stereotaktische Adoptiv Übertragung von zytotoxischen Immunzellen in murinen Modellen der Orthotopen Human Glioblastoma Multiforme Xenotransplantate

Neurosphären als 3D Kulturen angebaut sind ein mächtiges Werkzeug um Gliom Biologie zu studieren. Hier präsentieren wir ein Protokoll zum Immunohistochemistry durchführen unter Beibehaltung der 3D-Struktur von Gliom Neurospheres durch Paraffin einbetten. Diese Methode ermöglicht die Charakterisierung von Gliom Neurosphäre Eigenschaften wie Stemness und neuronale Differenzierung.

Bewertung von Biomarkern in Gliom von Immunohistochemistry auf Paraffin-eingebetteten 3D Gliom Neurosphäre Kulturen

Lasermikrodissektion (LMD) ist eine empfindliche und hochreproduzierbare Technik, die verwendet werden kann, um Wege aufzudecken, die Gliomheterogenität und Invasion vermitteln. Hier beschreiben wir ein optimiertes Protokoll zur Isolierung diskreter Bereiche aus Gliomgewebe mittels Laser LMD, gefolgt von transkriptomischer Analyse.

Lasercapture Mikrodissektion von Glioma Subregionen für räumliche und molekulare Charakterisierung der intratumoralen Heterogenität, Oncostreams und Invasion

Proteomische Dysregulation spielt eine wichtige Rolle bei der Ausbreitung diffus infiltrierender Gliome, aber mehrere relevante Proteine bleiben unidentifiziert. Digital Spatial Processing (DSP) bietet einen effizienten Hochdurchsatzansatz zur Charakterisierung der differentiellen Expression von Kandidatenproteinen, die zur Invasion und Migration infiltrativer Gliome beitragen können.

Digitales räumliches Profiling zur Charakterisierung der Mikroumgebung bei diffus infiltrierenden Gliomen im Erwachsenentyp

Wir stellen eine Methode zur Replikation der Mikroumgebung des Gliomtumors an der invasiven Front vor, die den interstitiellen Flüssigkeitsfluss einbezieht. Bei diesem Modell handelt es sich um ein Hyaluronan-Kollagen-I-Hydrogel in einem Gewebekultureinsatz, auf den ein Flüssigkeitsdruckkopf aufgebracht werden kann. Die Invasion kann quantifiziert werden, und Zellen können isoliert oder lysiert werden.

Ein photopolymerisierbares Hyaluronsäure-Kollagen-Modell der invasiven Gliom-Mikroumgebung mit interstitieller Strömung

Dieses Protokoll bereitete erfolgreich ausreichend hochwertiges neovaskuläres Gewebe aus Gliomproben mittels Laser-Capture-Mikrodissektion für eine quantitative proteomische Analyse der Tumorangiogenese vor, überwand die Einschränkungen von Studien, die traditionell hauptsächlich auf angiogene Faktoren fokussiert sind, und lieferte ein großflächiges proteomisches Profil der Gliomangiogenese.

Präparation von neovaskulären Geweben aus humanen Gliomgeweben für quantitative proteomische Analyse der Tumorangiogenese

Lernen Sie die quantitative Immunhistochemie zur Analyse der zellulären Mikroumgebung in Glioblastom-Patientenproben mit ImageJ. Diese Methode ermöglicht die Bestimmung physiologisch relevanter Zellverhältnisse.

Quantitative Immunhistochemie der zellulären Mikroumgebung bei Patienten-Glioblastom-Resektionen

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