Verwenden einen angepasste mikrofluidischen olfaktorische Chip für die Bildgebung neuronaler Aktivität als Reaktion auf Pheromone in männlichen C. Elegans Kopf Neuronen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Kalziumtransienz in männlichen C.Elegans-Kopfneuronen nach Exposition gegenüber Pheromonen effizient einzufangen. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Neurobiologie zu beantworten, wie z.B. das Verständnis der geschlechtsspezifischen Regulation neuronaler Schaltkreise. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass männliche C.Elegans nun effizient in einer mikrofluidischen Falle abgebildet werden können.

Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da das Verladen von Tieren anfangs schwierig sein kann und biogene Pheromone nicht bei jedem Tier eine Kalziumvergänglichkeit auslösen. Um mit der Montage der Behälter zu beginnen, bereiten Sie drei Sätze Schläuche vor, indem Sie eine Nadel in ein Ende und einen Metallschlauch in das andere Ende einführen. Nehmen Sie dann für jedes Reservoir ein Dreiwege-Luer-Ventil und befestigen Sie eine 30-Milliliter-Spritze mit entferntem Kolben, eine Drei-Milliliter-Spritze und den Schlauch.

Füllen Sie jedes Reservoir mit dem entsprechenden Puffer, entweder Stimulus S basal oder S basal mit Fluorescin. Entfernen Sie dann alle Luftblasen sowohl aus dem Reservoir als auch aus dem Schlauch, indem Sie die Spritze schnippen und pumpen. Füllen Sie nun eine neue Drei-Milliliter-Spritze und einen neuen Schlauch mit S basal und führen Sie sie in die Auslassöffnung des mikrofluidischen Geräts ein.

Üben Sie vorsichtig etwas Druck auf die Spritze aus, bis der Puffer an der Oberfläche der Einlassöffnungen erscheint. Verbinden Sie als Nächstes die Rohre für die Durchflussregelung, den Puffer und das Stimulus-Reservoir mit den entsprechenden Einlasslöchern und stellen Sie sicher, dass Flüssigkeitstropfen sowohl auf dem Ladeöffnungsloch als auch auf den anzubringenden Schläuchen vorhanden sind. Üben Sie nun vorsichtig etwas mehr Druck auf die Spritze aus, bis Tröpfchen im Einlass der Wurmladeöffnung erscheinen, und führen Sie dann einen festen Blockierstift in diese Öffnung ein.

Entfernen Sie anschließend die Spritze aus dem Auslassanschluss und schließen Sie eine Auslassleitung an, die mit dem Vakuumgehäuse verbunden ist. Untersuchen Sie nun das Gerät auf Blasen in den Schwimmerkanälen im Video-Feed des Mikroskops. Klicken Sie auf Live, um das Live-Bild zu sehen, und warten Sie, bis sich die Blasen auf natürliche Weise aufgelöst haben, bevor Sie fortfahren.

Schalten Sie als Nächstes die Leuchtstoffröhre ein und verwenden Sie einen GFP-Filter, um die korrekte Strömungsdynamik zu bestätigen. Betätigen Sie das Dreiwellenventil und beobachten Sie, wie der fluoreszierende Steuerstrom im Video-Feed erscheint, wenn das Ventil geöffnet ist. Zu Beginn pflücken Sie einen Wurm auf eine unbesäte NGM-Agarplatte und lassen Sie den Wurm wegkriechen

Lassen Sie dann die Platte mit S basal schweben. Die Lösung, die den Wurm enthält, in die Spritze aufziehen. Schalten Sie nun am Gerät das Vakuum aus, um den Durchfluss mit dem Auslass-Luer-Ventil zu stoppen.

Entfernen Sie dann den massiven Stift, der den Worm-Ladeanschluss blockiert. Führen Sie den Schlauch mit den Würmern in die Ladeöffnung ein. Öffnen Sie das Luer-Ventil und beobachten Sie den Live-Video-Feed.

Üben Sie nun sanften Druck auf die Spritze aus, bis der Wurm erscheint. Ziehe den Wurm zurück, wenn er zuerst in den Schwanz eintritt, er muss mit dem Kopf voran hinein, um dem Reiz ausgesetzt zu sein. Der Benutzer muss die Schnecke zurückziehen, bevor der Schwanz vollständig in den Kanal eintritt, andernfalls ist es extrem schwierig, die Schnecke aus dem Kanal zu bekommen, und erfordert in der Regel, dass die Schnecke vollständig durch den Kanal gespült und eine neue Schnecke geladen wird.

Schieben Sie nun den Wurm mit dem Druck der Spritze durch den Kanal und positionieren Sie den Kopf des Wurms so, dass er dem Pufferstrom ausgesetzt ist, aber nicht so weit in den Kanal hinein, dass er sich frei bewegen kann. Bei nicht gelähmten Tieren ist eine geringe Menge an axialen oder rotierenden Bewegungen zu erwarten. Durch die Zugabe eines Lähmungsmittels zu den Puffern wird dieser Effekt jedoch nahezu eliminiert.

Um die Wahrscheinlichkeit von Bewegungen während des Versuchs zu verringern, verwenden Sie ältere Männchen, die effizienter gefangen sind, verringern Sie die Breite oder Dicke der Wurmladeöffnung oder erhöhen Sie die Zeit, die Sie im Lähmungsmittel verbringen. Verwenden Sie die Software, um Aufnahmen mit Blaulichtanregung zu machen. Stellen Sie die Belichtung auf 100 Millisekunden ein, öffnen Sie das Bildaufnahmefenster, stellen Sie die Zeitpunkte auf 300 mit einem Intervall bei Null ein und starten Sie dann die Bildaufnahme.

Wenden Sie nach fünf Sekunden den Stimulus an, indem Sie das Dreiwegeventil ändern, das die Puffer steuert. Eine 10-sekündige Stimulation ist ein guter Ausgangspunkt und die Länge des Stimulus kann je nach Bedarf angepasst werden. Schalten Sie nach der Stimulation den Flow durch erneutes Drücken der Taste zurück und setzen Sie die Aufnahme fort, bis das 30-Sekunden-Video abgeschlossen ist.

Dadurch kann die g-Camp-Fluoreszenz zur Basislinie zurückkehren. Lassen Sie nun die Zubereitung 30 Sekunden ruhen, bevor Sie den nächsten Versuch beginnen. Würmer, die g camp drei im nicht suszeptiven Neuron ASH exprimieren, reagieren auf ein molares Glycerin mit sichtbaren Veränderungen der Fluoreszenz innerhalb des ASH-Neurons, was auf neuronale Aktivität hinweist.

Das Neuron sollte für das gesamte Video im Analysebereich verbleiben, da es sonst zu einem Bewegungsartefakt kommen kann. Wenn dies der Fall ist, verschieben Sie den Analysebereich für diese Zeitpunkte, und führen Sie die Intensitätswerte zusammen, um eine einzelne Ablaufverfolgung zu erstellen. Bei Männern, die während der Exposition mit dem attraktiven biogenen Pheromon Ascarosid drei stimuliert wurden, wurde die Kalziumtransienz in den vier CEM-Neuronen gemessen.

Von Tier zu Tier und von Neuron zu Neuron variierten die Spuren in Form, Zeichen und Größe. Daher ist es sehr wichtig, bei der Untersuchung von Pheromonreaktionen viele Tiere zu analysieren. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein männliches C elegans in ein mikrofluidisches Gerät lädt und die Kalziumtransienz in Kopfneuronen analysiert.

Das gleiche Verfahren kann bei Hermaphroditen angewendet werden, um sec-spezifische Unterschiede in den neuronalen Reaktionen zu identifizieren. Sobald diese Technik gemeistert ist, kann sie in einer halben Stunde für das erste abgebildete Tier durchgeführt werden. Nach der ersten Aufnahme kann ein neues Tier in ca. 10 Minuten ins Bild geladen werden.

Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie die Optogenetik mit diesem Protokoll kombiniert werden, um besser zu verstehen, wie neuronale Schaltkreise reguliert werden.