Name: Isolierung und Kultur der primären Maus Keratinozyten aus neonatalen und erwachsenen Maus Haut (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: Lernen Sie die Isolierung und Kultur primärer Maus-Keratinozyten aus neonataler und erwachsener Haut für Studien zur epidermalen Biologie und UVB-induzierten Immunantworten. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Zelldifferenzierung und Hautbarrierefunktion.

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Diese Arbeit wurde von NATIONAL INSTITUTE OF ARTHRITIS UND MUSKULOSKELETAL UND HAUTKRANKHEITEN gewährt (R01AR069653 bis Zhang LJ) und National Institutes of Health Support (5T32AR062496-03 bis CA).

Alle Tierversuche werden vom UCSD Institutional Animal Care and Use Committee genehmigt. 1. Primäre Maus KC Isolierung und Kultur aus neonatalen Haut <ol><li> Opfer der postnatalen Tag 0-2 Neugeborenen aus dem C57B / 6 Wildtyp-Maus-Stamm durch Enthauptung mit Schere. Schneide die Glieder kurz über dem Handgelenk und den Knöchelgelenken ab, schneide dann den Schwanz ab und läßt ein kleines Loch zu. </li><li> Um die ganze Haut abzuschälen, schlage die scharfe Schere durch das Loch am Schwanz und schneide die Haut entlang der dorsalen Mittellinie des Körpers auf die Öffnung am Hals. Als nächstes verwenden Sie eine Pinzette, um den freiliegenden Körper und die andere Pinzette zu fassen, um die Haut zu fassen, und schütteln Sie sanft die ganze Haut vom Körper und über die Beinstümpfe mit einer kontinuierlichen Bewegung. <ol><li> Schälen Sie die Haut als ein intaktes Stück und achten Sie darauf, die Haut nicht in Stücke zu brechen, da dies zu Zellverlust während des Disposeschrittes führen wird. </li></ol></li> &lt;Li&gt; Spülen Sie die geschälte Haut mit 15 ml sterilem PBS in einer 10 cm Petrischale und legen Sie dann die Haut von jedem Welpen in ein 2-ml-Röhrchen, gefüllt mit Eiskälteablagerungs-Verdauungspuffer, der 4 mg / mL Dispase in KC-Wachstumsmedium enthält (KC-Basalmedium hat 0,06 mM CaCl 2 , dGS und Antibiotika / Antimykotika). HINWEIS: Mehrere Hautisolate können kombiniert und in einem 15-ml-Röhrchen (bis zu 5 Skins pro Röhrchen) mit 12 ml Disposelösung inkubiert werden. Inkubieren Sie das Hautröhrchen über Nacht in einem 4 ° C Kühlschrank auf einem Rotator. <ol><li> Vergewissern Sie sich, dass die Haut nicht in der Röhre gefaltet ist, da dies zu einer unzureichenden Belichtung des gefalteten Bereichs zur Disposelösung führt. </li></ol></li><li> Am nächsten tag (nach 12-18 h in dispase), transportiere die haut zusammen mit der dispase lösung in eine petrischale Übertragen Sie jedes Gewebestück auf eine neue Petrischale mit 15 ml sterilem PBS, um überschüssige Disposition zu waschen. </li><li> Mit zwei Pinzettenpaaren greife die Haut von PBS,Heben Sie die Haut und übertragen Sie eine neue Petrischale mit der epidermalen Seite nach unten und die Dermis nach oben. Die Hautfalten sorgfältig ausdehnen, damit sie auf der Petrischale vollständig ausgezogen ist. </li><li> Platzieren Sie 500 μl einer Trypsin-basierten Aufschlusslösung für jede Haut in einer neuen Petrischale. Mit Pinzette, langsam heben Sie die Dermis auf und weg von der Epidermis, während die Epidermis nach unten halten. Die Dermis als biologisch gefährliches Material entsorgen. Übertragen Sie die getrennte Epidermis und schweben Sie auf jeden Tropfen Trypsin-Lösung mit der Basalschicht nach unten. <ol><li> Wenn die Epidermis auf die Trypsin-Lösung gefaltet ist, entfernen Sie alle Falten mit Pinzette, um eine effiziente Verdauung von basalen KCs aus dem Epithel zu gewährleisten. </li></ol></li><li> Die Haut auf einer Petrischale in Trypsinlösung bei Raumtemperatur (mit Deckel bedeckt) auf einem horizontalen Schüttler mit leichtem Rühren für 20 min inkubieren. </li><li> Füge 2 ml des ergänzten KC-Wachstumsmediums pro Epidermis hinzu (ca. 1 Quadratzoll in der Größe proEpidermis) zur Petrischale. Fassen Sie die Epidermis mit Pinzette, und kräftig reiben die Epidermis hin und her, um einzelne Zellen aus dem epidermalen Blatt freizugeben. <ol><li> Beobachten Sie das Medium drehen zunehmend trübe, wie die Zellen von der Epidermis abgelöst werden. Kippen Sie die Petrischale, um die Zellsuspension zu einem neuen Röhrchen zu sammeln und zu transportieren, wobei das übrige Epidermisblatt auf dem Teller bleibt. </li></ol></li><li> Wiederholen Sie zwei weitere Male das Reiben der epidermalen Folie nach Zugabe von 2 ml KC-Wachstumsmedium und kombinieren Sie die Zellsuspensionen in der gleichen Röhre. </li><li> Pipettieren Sie die Zelllösung vorsichtig ein paar Mal, um alle Zellklumpen mit der entsprechenden serologischen Pipette zu brechen und dann durch einen 100 μm Filter in ein neues 50 mL Zentrifugenröhrchen zu führen. </li><li> Zentrifugieren der filtrierten Zellen für 5 min bei 180 x g. </li><li> Den Überstand abtupfen und das Zellpellet vorsichtig in 1 ml kaltem KC-Wachstumsmedium / Epidermis resuspendieren. </li><li> Zähle die Zellen durch ein Hämocytometer. <br/&gt; HINWEIS: Die KCs können sich spontan in Suspension differenzieren, so dass die Zellen so schnell wie möglich nach der Isolation plattiert werden sollten, um die optimale Leistung der Zellen zu gewährleisten. Wir empfehlen, die Zellen auf Eis zu legen, während das Zählen, da dies die Rate der KC spontane Differenzierung reduzieren wird. </li><li> Pflanzensamen , die Zellen in einer Dichte von 5 x 10 4 / cm 2 in Wachstumsmedium KC in Kulturschalen vorbeschichtet mit einem extrazellulären Matrix (ECM) Produkt , das der Zellanheftung fördert. HINWEIS: Wir verwenden eine handelsübliche (zB Anbindungsfaktor, der ein Gelatine-basiertes Beschichtungsmaterial ist (siehe Tabelle der Materialien für Details). Die Zellen wurden im befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2 bei 37 ° C kultiviert und es wurden frisches Medium Jeden zweiten Tag aufgefüllt <ol><li> Zur Beschichtung die Kulturschalen mit dem Zellbefestigungsbeschichtungsmaterial auf die Raumtemperatur für 10 min bis 2 h vor dem Zellseeding aufwärmen. Entfernen Sie den Befestigungsfaktor kurz vorZugabe der Zellsuspension </li></ol></li><li> Ändern Sie das Medium 24 h nach der anfänglichen Beschichtung, um ungebundene Zellen zu entfernen, und ändern Sie das Medium täglich, bis die Zellen die gewünschte Konfluenz vor dem Experiment erreichen. </li></ol> 2. Primäre Maus KC Isolierung von Erwachsenen Schwanz Haut <ol><li> Opfer einer erwachsenen C57BL / 6-Maus (vorzugsweise zwischen 6-15 Wochen alt, entweder männlich oder weiblich) nach den Tierbestimmungen. Den Schwanz von der Schwanzbasis abschneiden und ~ 2 mm der Schwanzspitze abschneiden, so dass ein sichtbares Loch an der Spitze ist. </li><li> Um die Schwanzhaut abzureißen, verwenden Sie zuerst eine scharfe Klinge, um die Schwanzhaut von der Basis bis zur Schwanzspitze zu schneiden. Als nächstes verwenden Sie eine Pinzette, um den freiliegenden Schwanzknochen und die andere Pinzette zu fassen, um die Haut zu fassen, und schütteln Sie die Schwanzhaut vorsichtig mit einer kontinuierlichen Bewegung vom Knochen ab. Schneide die geschälte Haut von der Mittellinie, so dass jedes Stück weniger als 2-3 cm lang ist. </li><li> Spülen Sie die geschälte Haut WitzH 15 ml steriles PBS in einer 10 cm Petrischale, dann platziere die Haut von jedem Schwanz in ein 2 mL Röhrchen, gefüllt mit Eiskälteablagerung Verdauungspuffer (4 mg / mL Dispase in KC Wachstumsmedium). HINWEIS: Mehrere Hautstücke können auch kombiniert und in einem 15-ml-Röhrchen (bis zu 5 Schwänze pro Röhrchen) mit 12 ml Disposelösung inkubiert werden. <ol><li> Inkubieren Sie das Hautröhrchen über Nacht in einem 4 ° C Kühlschrank auf einem Rotator. </li></ol></li><li> Führen Sie die Schritte 1.4 bis 1.13 aus, um die Einzelzellsuspension von der Schwanz-Epidermis zu isolieren. </li><li> Saatgut , die adulte Zellen in einer Dichte von 10 x 10 4 / cm 2 (von einer Zählkammer gezählt) in Wachstumsmedium KC in Kulturschalen vorbeschichtet mit Kollagen. HINWEIS: Wir verwenden ein handelsübliches kollagenbasiertes Beschichtungskit (siehe die Tabelle der Materialien für Details). Die Zellen wurden in befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2 bei 37 ° C kultiviert, und frisches Medium wurde jeden zweiten Tag aufgefüllt. Im allgemeinen ist die cGeiergerichte sollten mit Kollagen für 30 min bis 1 h vor der Zellsäen beschichtet werden. Wir beobachten, dass es eine signifikante Verbesserung der erwachsenen KC-Anlagerung an die Schale gibt, wenn sie mit Kollagen beschichtet ist, verglichen mit dem Bindungsfaktor, der ein Gelatine-basiertes Beschichtungsmaterial ist. </li><li> Ändern Sie das Medium 24 h nach der anfänglichen Beschichtung, um ungebundene Zellen zu entfernen, und ändern Sie das Medium täglich, bis die Zellen die gewünschte Konfluenz vor dem Experiment erreichen. </li></ol> 3. In vitro Differenzierung von KCs durch High Calcium <ol><li> Um eine terminale Differenzierung zu induzieren, fügen Sie CaCl 2 zu 0,2 mM im Kulturmedium hinzu. </li><li> Alternativ verhungern die kultivierten KCs über Nacht ohne Zusatzwachstumsergänzungen in niedrigem Calcium-KC-Basalmedium vor der Zugabe von hohem Kalzium. HINWEIS: Wachstumsfaktor Hunger wird die Zellverpflichtung zur frühen Differenzierung und die Induktion von frühen Differenzierungsmarkern, wie K10 5, verbessern </Sup&gt;. </li></ol> 4. UVB-Bestrahlung vermittelter Zelltod und TNF &amp; agr; Freisetzung von KCs <ol><li> Kultur die Maus KCs im KC-Wachstumsmedium (im befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2 bei 37 ° C) mit täglichem Medium wechseln, bis die Zellen Konfluenz erreichen. Unmittelbar vor der UVB-Bestrahlung das Wachstumsmedium entfernen und mit 500 μl PBS ersetzen. Dann die Zellen auf 25 mJ / cm 2 UVB oder Mock Control (kein UVB) unterziehen. HINWEIS: Die UVB-Bestrahlung erfolgt mit handgehaltenen UVB-Lampen mit zwei 8 W-Glühlampen (312 nm) wie zuvor beschrieben 10 . Nach UVB-Bestrahlung wird PBS aspiriert und frisches Medium zugegeben. </li><li> Messen und quantifizieren Sie die Zelllebensfähigkeit durch den CCK-8-Zelllebensfähigkeitstest nach 6, 8 und 24 h nach der UVB-Behandlung nach der Anweisung des Herstellers 11 . </li><li> Sammeln Sie das konditionierte Medium aus den mit UVB behandelten KCs zu gewünschten Zeitpunkten und messen Sie das freigesetzte TNFαIm konditionierten Medium mit dem Maus-TNF (Mono / Mono) ELISA-Kit nach der Anleitung des Herstellers 7 , 12 . </li></ol>

<ol><li>Mauro, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+barrier+perturbation+abolishes+the+Ca2%2B+and+K%2B+gradients+in+murine+epidermis%3A+quantitative+measurement+using+PIXE%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Acute barrier perturbation abolishes the Ca2+ and K+ gradients in murine epidermis: quantitative measurement using PIXE.</a> J Invest Dermatol. 111 (6), 1198-1201 (1998).</li>
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</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die Haut-Epidermis fungiert als eine kritische Barriere, um den Körper von der äußeren Umgebung zu trennen und zu schützen und Schäden durch Wasserverlust, Krankheitserreger, Hitze und UV-Bestrahlung. Die KCs sind die vorherrschende Zelllinie der Epidermis, und die Primärkultur der epidermalen KCs ist ein nützliches Werkzeug, um die biologischen Prozesse der Barrierebildung und die Reaktion von KCs auf Umweltbeleidigungen in vitro zu untersuchen und zu verstehen. Hier beschreiben wi...

Die Haut ist das größte Organ im Körper mit der Epidermis als die äußerste Schicht. Die Epidermis spielt eine entscheidende Rolle bei der Bildung einer intakten epidermalen Barriere, um den Körper von der Umwelt zu trennen und verhindert so Wasserverlust und schützt vor Umweltbeleidigungen wie Allergenen, Krankheitserregern und UVB-Exposition. Die Epidermis entwickelt sich aus einer einzigen Schicht von undifferenzierten basalen Keratinozyten (KCs) zu einem mehrschichtigen, geschichteten Epithel, bestehend aus einer Basalschicht, gefolgt von einer Dornschicht, einer körnigen Schicht und einem Stratum corneum. Basale KCs, bestehend aus epidermalen Stammzellen und transitverstärkenden Zellen, sind proliferativ und undifferenziert. Da die Basal-KCs den Zellzyklus verlassen, begehen die Zellen der Differenzierung und wandern allmählich zur Oberfläche der Epidermis, begleitet von der Reifung von Zellzellübergängen und der Bildung einer epidermalen Permeabilitätsbarriere (EPB). Die KCs an der Dornschicht drücken früh differenz ausIonenmarker wie Keratin 10 (K10); Wenn die KCs zur körnigen Schicht wandern, exprimieren die Zellen späte Differenzierungsmarker wie Filaggrin (FLG), Loricrin (LOR) und Involucrin (INV). Bei dem Stratum corneum werden die KCs endlich differenzierte Corneozyten, die schließlich durch Abschuppung abgebaut werden, da neue Zellen sie ersetzen. Calcium gilt als das physiologischste Mittel in der Epidermis und löst die Differenzierung in vitro und in vivo in ähnlicher Weise aus. Bei normaler Hautepidermis bilden Calciumionen einen charakteristischen &quot;Konzentrationsgradienten&quot;, der sich in der Konzentration auf die Hautoberfläche 1 , 2 , 3 erhöht. Die Calciumkonzentration steigt von niedrigen Niveaus in den untersten Teilschichten (Basal- und Dornschichten) bis zu einem Peak in der oberen Granulatschicht und fällt dann in der oberflächlichen Schicht (Stratum corneum) zu vernachlässigbaren Niveaus.<html> Der Kalziumgradient entwickelt sich auch zufällig mit der Entstehung einer Komponentenpermeabilitätsbarriere, die die Calcium-Signalisierung eine kritische Rolle der KC-Differenzierung spielt. In vitro behält das niedrige Kalzium (0,02-0,1 mM) die Proliferation von basalen KCs als Monoschicht bei, während ein hohes Kalzium (&gt; 0,1 mM) eine rasche und irreversible Verpflichtung der Zellen zur terminalen Differenzierung induziert, wie durch eine enge Kreuzung und Induktion gezeigt wird Von LOR und INV bei hoher Kalziumbehandlung zu den basalen KCs 4 , 5 . Neben der Barrierebildung sind auch epidermale KCs ein wichtiger Bestandteil des angeborenen Immunsystems der Haut. Als Reaktion auf Pathogene oder beschädigte assoziierte molekulare Muster (DAMPs), die bei UVB-Bestrahlung oder Verletzung freigesetzt werden, können KCs große Mengen an entzündlichen Zytokinen wie TNF &amp; agr ;, IL 6 und IFN &amp; bgr; erzeugen, was zu einer Aktivierung des Immunsystems führt&gt; 6 , 7 , 8 , 9 Obwohl eine korrekte entzündliche Signalisierung von KCs für die Pathogen-Clearance erforderlich ist, kann eine unkontrollierte Entzündungsreaktion die Entwicklung von entzündungshemmenden Hauterkrankungen wie Psoriasis und Rosacea 6 , 8 auslösen. Insgesamt spielen KCs eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der intakten Hautbarriere und initiieren eine Immunantwort auf Pathogeninvasion oder Umweltbeleidigungen. Daher ist die primäre Kultur der epidermalen KCs eine nützliche Technik, um die Epithelbiologie, KC-Differenzierung sowie KC-stimulierte angeborene Immunantworten zu untersuchen. Die Isolierung und Kultur der primären Maus epidermalen KCs kann ein anspruchsvoller Prozess aufgrund der KC-Anfälligkeit und Empfindlichkeit gegenüber verschiedenen externen Stimulanzien sein. Hier beschreiben wir eine Methode zur Isolierung und Kultur von KCs aus der neonatalen Maushaut oderErwachsene Maus Schwanz Haut. Für die erwachsene KC-Isolation verwenden wir keine Maus-Dorsal-Haut, da die Isolierung von ausreichenden Mengen an lebensfähigen KCs aus diesem Gewebe aus folgenden Gründen schwierig sein kann: Erstens besteht die erwachsene Dorsalhaut in der Ruhephase des Haarzyklus (Telogen) aus a Dünne Epidermis mit nur 1-2 Schichten von Zellen, was zu einer niedrigen Zelle Ausbeute und ineffiziente Trennung der Epidermis aus der Dermis, die der kritische Schritt für eine erfolgreiche KC-Isolation ist. Zweitens trägt die hohe Haarfollikeldichte, die auf der erwachsenen Dorsalhaut vorhanden ist, weiter zur Schwierigkeit bei der Trennung der Epidermis von der Dermis bei. Stattdessen verwenden wir routinemäßig die Schwanzhaut als Quelle für erwachsene Maus-KCs, da dieses Epithel mit 3-5 Schichten epidermalen KCs dicker ist. Es hat auch eine niedrigere Haarfollikel-Dichte, die nicht mit der epidermalen Trennung stört, so dass KC-Isolierung von jeder erwachsenen Maus Schwanz Haut unabhängig von der Alter und Haare Radfahren Stadium der Maus. Die isolierte neonaTal KCs werden zu gelatinebeschichteten Kulturschalen ausgesät, während kollagenbeschichtete Schalen verwendet werden, um isolierte erwachsene KCs zu säen, da die beeinträchtigten Fähigkeiten der erwachsenen Zellen im Vergleich zu ihren neonatalen Gegenstücken haften. Zur Kombination von Maus-KCs wird ein niedriges Calcium-Basalmedium mit dGS ergänzt, das epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), Rindertransferrin, Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktor c1 (IGF1), Prostaglandin E2 (PGE2), Rinderserumalbumin (BSA) und Hydrocortison enthält. Zwischen 2-4 Tagen nach der anfänglichen Beschichtung können die meisten der differenzierten KCs während der täglichen mittleren Veränderungen weggewaschen werden, und die verbleibenden adhärenten Zellen zeigen eine typische Kopfsteinmorphologie 4 , sind proliferierend und exprimieren nicht den frühen Differenzierungsmarker K10.

<table><tbody><tr><td>C57BL/6 Neugeborene oder adulte Wildtyp-Mäuse</td><td>Jackson Laboratory</td><td>000664</td><td>Wildtyp-Mäuse (ursprünglich vom Jackson Laboratory gekauft) werden an der UCSD in tierischen Vivarien gezüchtet und gepflegt.</td></tr><tr><td>KC Basalmedium (EpiLife)</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>MEPICF500</td><td>Basalmedium für Keratinozytenkulturen mit 0,06 mM CaCl2</td></tr><tr><td>Defined Growth Supplement (dGS)</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>S0125</td><td>definierte Wachstumszusätze für Kulturmedium</td></tr><tr><td>Dispase-Pulver</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>17105041</td><td>Enzym zur Dissoziation der Epidermis von der Dermis</td></tr><tr><td>Attachment Factor</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>S006100</td><td>Beschichtungsmaterial auf Gelatinebasis</td></tr><tr><td>Beschichtungsmatrix</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>R011K</td><td>Beschichtungsmaterial auf Kollagenbasis</td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>12604-013</td><td>Ein schonendes Trypsin-ähnliches Enzym zur Dissoziation von Keratinozyten aus der Epidermisschicht</td></tr><tr><td>100 μm m Zellsieb Nylonnetz</td><td>Corning</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>CCK-8 Zellviabilitätskit</td><td>Dojindo Molecular Technologies, Rockville, MD</td><td>CK04-11</td><td></td></tr><tr><td>Maus TNF (Mono/Mono) ELISA Set II</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA</td><td>555268</td><td></td></tr><tr><td>kabelgebundene tragbare UV-Lampen</td><td>Spectronics, Westbury, NY</td><td>EB-280C</td><td></td></tr><tr><td>8-Watt UV-Röhren</td><td>Spectronics, Westbury, NY</td><td>BLE-8T312</td><td></td></tr><tr><td>Inverses Lichtmikroskop für Zellkulturen</td><td>ZEISS, Jena, Deutschland</td><td>Axio Observer</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszenzmikroskop</td><td>Olympus</td><td>BX41</td><td></td></tr></tbody></table>

isolierung und kultur der primären maus keratinozyten aus neonatalen und erwachsenen maus haut

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

Der Keratinozyt (KC) ist der vorherrschende Zelltyp in der Epidermis, der äußersten Schicht der Haut. Epidermale KCs spielen eine entscheidende Rolle bei der Bereitstellung von Hautverteidigung durch die Bildung einer intakten Hautbarriere gegen Umwelt-Beleidigungen, wie UVB-Bestrahlung oder Pathogene, und auch durch die Einleitung einer entzündlichen Reaktion auf diese Beleidigungen. Hier beschreiben wir Methoden, um KCs von der neonatalen Maushaut und von der erwachsenen Mausschwanzhaut zu isolieren. Wir beschreiben auch Kultivierungsbedingungen mit definierten Wachstumsergänzungen (dGS) im Vergleich zu Chelex-fötalem Rinderserum (cFBS). Funktionell zeigen wir, dass sowohl neonatale als auch erwachsene KCs in hohem Maße auf eine hohe Calcium-induzierte terminale Differenzierung, eine enge Kreuzungsbildung und -schichtung ansprechen. Darüber hinaus sind kultivierte erwachsene KCs anfällig für UVB-ausgelösten Zelltod und können große Mengen an TNF bei UVB-Bestrahlung freisetzen. Gemeinsam sind die hier beschriebenen Methoden für Forscher für den Aufbau des In-vitro- Modells von NutzenS, um die epidermale Biologie in der neonatalen Maus und / oder der erwachsenen Maus zu studieren.

Hohe Calcium-induzierte terminale Differenzierung von neonatalen und erwachsenen KCs. Die primäre Maus epidermalen KCs ausplattiert und gehalten bei 0,06 mM CaCl 2 wuchs als Monoschicht, und einzelne Zellen hatten eine polygonale Form mit deutlichen Interzellularraum, zeigt einen Pflasterstein Aussehen , wenn konfluent (1A und 2A). Anheben des CaCl 2 bis 0,2 mM induziert eine rasche Änderun...

Epidermale Keratinozyten bilden eine funktionelle Hautbarriere und sind an der Frontlinie der Wirtsverteidigung gegen äußere Umweltbeleidigungen positioniert. Hier beschreiben wir Methoden zur Isolierung und Primärkultur von epidermalen Keratinozyten aus neonataler und erwachsener Maushaut und Induktion der terminalen Differenzierung und UVB-ausgelösten Entzündungsreaktionen von Keratinozyten.

Isolierung und Kultur der primären Maus Keratinozyten aus neonatalen und erwachsenen Maus Haut

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, primäre Maus-Keratinozyten aus der Haut neugeborener oder erwachsener Mäuse zu isolieren, um ihre in-vitro-Differenzierung zu untersuchen oder ihre angeborenen Immunantworten auf UVb-Bestrahlung zu analysieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Epidermisbiologie zu beantworten, beispielsweise wie die Differenzierung von Keratinozyten reguliert wird oder wie epidermale Keratinozyten auf äußere Reize reagieren. Die wichtigsten Vorteile dieser Technik liegen darin, dass die Keratinozyten konventionell sowohl aus der Haut neugeborener als auch erwachsener Mäuse isoliert werden können und dass sie mit unserem Serum kultiviert werden können.Begleiten Sie mich bei der Demonstration des Verfahrens Fengwu Li, eine wissenschaftliche Mitarbeiterin aus meinem Labor. Entfernen Sie zunächst die Gliedmaßen eines wildtypischen C57 BL6-Mäusen neonatals vom postnatalen Tag null bis zwei knapp oberhalb der Gelenke der Handgelenke und schneiden Sie den Schwanz vollständig ab, wobei ein kleiner Ball übrig bleibt. Führen Sie eine scharfe Schere durch das Schwanzloch und schneiden Sie die Haut entlang der dorsalen Mittellinie

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Eine schnelle und robuste Lösung zur Isolierung von lebensfähigen Erwachsenen epithelialen Stammzellen aus menschlicher Haut beschrieben wird. Das Verfahren nutzt enzymatische Verdauung der Haut Kollagen-Matrix, durch Zupfen der Haarfollikel und Isolierung von einzelnen Zellsuspensionen oder Gewebestücke für die Zellkultur gefolgt.

Isolierung und Kultivierung von Adult epithelialen Stammzellen aus menschlicher Haut

Dieses Video beschreibt die Isolierung von Keratinozyten – den prominentesten Zellen der Epidermisschicht der menschlichen Haut, indem eine Kombination aus enzymatischer Verdauung und mechanischen Aufschlussmethoden angewendet wird. Diese Methode hilft bei der bevorzugten Züchtung von Keratinozyten gegenüber anderen Hautzelltypen unter Verwendung eines selektiven Wachstumsmediums.

Keratinozytenisolierung in der menschlichen Haut: Eine Methode zur Kultivierung primärer Keratinozyten aus Hautproben

Ein ideales Modell für das Studium der adulten Stammzellbiologie ist der Haarfollikel der Maus. Hier stellen wir ein Protokoll zur Isolierung verschiedener Populationen von Haarfollikeln, Stammzellen und epidermalen Keratinozyten vor, wobei die enzymatische Verdauung der Rückenhaut von Mäusen mit anschließender FACS-Analyse zum Einsatz kommt.

Isolieren von Haarfollikelstammzellen und epidermalen Keratinozyten von Dorsal Mäusehaut

Die menschliche Haut wirkt als eine erste Verteidigungslinie gegen die Außenumgebung. Wir präsentieren Ihnen eine Methode zur Isolierung von primären menschlichen Keratinozyten von Erwachsenen. Diese isolierten Keratinozyten eignen sich zahlreiche Versuchsaufbauten und sind ein sehr geeignetes Modell für die Untersuchung der molekularer Mechanismen in kutane Biologie in-vitro-.

Generation und Kultivierung der primären menschlichen Keratinozyten von Erwachsenen

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur primären menschlichen Keratinozyten aus Erwachsenen Hautgewebe effizient zu isolieren. Diese Methode vereinfacht das konventionelle Verfahren mithilfe der ROCK-Inhibitor Y-27632 Mittel-und Impfung spontan Epidermiszellen von dermalen Zellen zu trennen.

Eine vereinfachte und effiziente Methode zur primären menschlichen Keratinozyten aus Erwachsenen Hautgewebe zu isolieren

Ziel dieses Protokolls ist es, epidermale Keratinozyten aus der dorsalen Haut erwachsener Mäuse für eine Vielzahl nachgelagerter Anwendungen wie Molekularbiologie, Biochemie, Fluoreszenzaktivierte Zellsortierung und primäre In-vitro-Anwendungen (z. B. clonogene Keratinozyten).

Isolierung von Maus epidermalen Keratinozyten und ihrer In-Vitro-Clonogenen Kultur

Dieses Protokoll beschreibt, wie Hautkeratinozyten von Mausmodellen isoliert werden, mit metallmarkierten Antikörpern gefärbt werden und wie man gefärbte Zellen durch Massenzytometrie analysiert, um das Expressionsmuster von Proteinen zu profilieren, die in den verschiedenen Zellzyklusphasen von Interesse sind.

Isolierung und Färbung der Maushaut Keratinozyten für Zellzyklus spezifische Analyse der zellulären Proteinexpression durch Massenzytometrie

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur systematischen Kultivierung epidermaler Sphäroide in 3D-Suspensionskultur. Dieses Protokoll hat weitreichende Anwendungen für den Einsatz in einer Vielzahl von epithelialen Gewebetypen und für die Modellierung mehrerer menschlicher Krankheiten und Zustände.

Etablierung eines epidermalen Sphäroidkultursystems mit hohem Durchsatz zur Modellierung der Plastizität von Keratinozyten-Stammzellen

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Isolierung und Kultur von oralen Keratinozyten aus dem erwachsenen Mausgaumen. Eine Bewertungsmethode unter Verwendung von Immunfärbung wird ebenfalls berichtet.

Isolierung und Kultur von primären oralen Keratinozyten aus dem erwachsenen Mausgaumen

Dieses Protokoll beschreibt die Kultivierung von frisch gewonnenen (Passage 0) Keratinozyten für die Verwendung in der Lebendzellbildgebung.

Generierung von Primärkulturen für die Bildgebung lebender Keratinozyten

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Isolierung, Reinigung und Kultur primärer marginaler Zellen aus der Maus-Stria vascularis sowie zur Etablierung von in-vitro-Modellen von oxidativem Stress und zellulärer Seneszenz zur Untersuchung von cochlearen lateralen Wandstörungen.

Isolierung und Kultur primärer Randzellen der Stria vascularis aus neonatalen Mäusen

Lernen Sie die Isolierung und Kultur primärer Maus-Keratinozyten aus neonataler und erwachsener Haut für Studien zur epidermalen Biologie und UVB-induzierten Immunantworten. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Zelldifferenzierung und Hautbarrierefunktion.

Isolierung und Kultur der primären Maus Keratinozyten aus neonatalen und erwachsenen Maus Haut

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