Laser-Doppler: Ein Instrument zur Messung der Pankreas Islet mikrovaskuläre Vasomotion In Vivo

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, den funktionellen Zustand der mikrovaskulären Vasomotion der Pankreasinseln in vivo zu bestimmen, um deren Einfluss auf verwandte Erkrankungen zu bewerten. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im medizinischen Zirkulationsbereich zu beantworten, beispielsweise, ob die mikrovaskuläre Vasomotion der Pankreasinseln im pathologischen Zustand verändert ist. Die Idee zu dieser Methode entstand erstmals, als wir nachweisen konnten, dass eine funktionelle mikrovaskuläre Durchblutung im Verlauf der Diabetesentwicklung eine Rolle spielt.

Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie den funktionellen Zustand der mikrovaskulären Vasomotion von Geweben und Organen sowohl in klinischen als auch in laborbezogenen Umgebungen bewerten kann. Diese Methode kann Einblicke in Erkrankungen im Zusammenhang mit den Pankreasinseln liefern. Sie kann außerdem auf andere Systeme angewendet werden, wie beispielsweise Nieren- und Netzhauterkrankungen mit mikrovaskulärer Beteiligung.

Die Anwendungen dieser Technik erstrecken sich ebenfalls auf das Verständnis der Trends im funktionellen Zustand der mikrovaskulären Vasomotion. Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten, da während der Experimente große Mengen mikrovaskulärer akademischer Daten aus der Laser-Doppler-Messung gewonnen werden. Die Demonstration dieser Methode ist unbedingt erforderlich, da viele Faktoren die genaue Erfassung von Mikrozirkulationsdaten negativ beeinflussen können.

Dieses Protokoll beginnt mit der täglichen Injektion von STZ über fünf aufeinanderfolgende Tage hinweg. Lösen Sie STZ in Zitratpuffer auf, um eine Arbeitskonzentration von fünf Milligramm pro Milliliter zu erhalten. Anschließend verabreichen Sie intraperitoneale Injektionen mittels einer Ein-Milliliter-Spritze und einer 25-Gauge-Nadel.

Die Mäuse müssen vier Stunden vor der Injektion nüchtern bleiben, jedoch sollte ihnen der Zugang zu Wasser nicht entzogen werden. Injizieren Sie den Kontrollmäusen das gleiche Volumen reinen Zitratpuffers. Nach den Injektionen versorgen Sie die Mäuse mit normalem Futter und 10%iger Saccharoslösung.

Nach dem fünften Tag der Injektion von STZ ersetzen Sie das 10%ige Saccharosewasser durch normales Wasser. Neun Tage später bestimmen Sie den Blutglukosespiegel. Fasten Sie die Mäuse zunächst sechs Stunden lang bei freiem Zugang zu Wasser.

Dann entnehmen Sie Blut aus ihren Schwanzvenen und messen die Blutglukosekonzentration mit einem handelsüblichen Blutzuckermessgerät. Mäuse mit einer Blutglukosekonzentration über 200 Milligramm pro Deziliter gelten als diabetisch. Vor der Verwendung des Laser-Doppler-Geräts reinigen Sie zunächst die optischen Oberflächen der Sondenspitze und des Sondenanschlusses mit einem weichen, nicht abrasiven Tuch und stecken Sie anschließend das Kabel in die Buchse des Geräts.

Bauen Sie als Nächstes den Kalibrierstand auf. Lassen Sie zunächst den aufbewahrten Flussstandard auf Raumtemperatur ansteigen. Dies dauert etwa eine halbe Stunde.

Danach den Fluss-Standard vorsichtig 10 Sekunden lang schütteln und zwei Minuten lang auf der Kalibrationsbasis ruhen lassen. Anschließend die Klammer so weit wie möglich anheben und die Sonde in der Klammer befestigen. Nun die Sonde langsam in den Fluss-Standard eintauchen und mit den Sondenhaltern fixieren.

Dimmen Sie das Raumlicht und drücken Sie die Kalibrierung am Laser-Doppler-Gerät. Wählen Sie nun den Arbeitskanal aus, an den die Sonde angeschlossen ist, und führen Sie das Kalibrierungsprogramm aus. Positionieren Sie eine anästhetisierte Maus in Rückenlage auf einer Arbeitsplattform und sichern Sie sie mit chirurgischem Klebeband.

Als Nächstes sterilisieren Sie die Bauchhaut mit 75 % Ethanol vom Halsbereich bis zum Schwanz und bedecken Sie den Randbereich mit einem trockenen Gazetupfer, das in der Mitte eine drei Zentimeter breite Öffnung aufweist. Heben Sie danach die Bauchhaut mit einer Pinzette an und führen Sie mit einem Skalpell oder einer Hautschere einen ersten vertikalen Schnitt entlang der Bauchmitte durch. Fassen Sie anschließend den darunterliegenden Muskel mit der Pinzette und schneiden Sie, um in die Bauchhöhle einzudringen.

Verletzen Sie keine Organe. Um die Bauchhöhle freizulegen, klappen Sie die Haut und die darunterliegende Muskulatur über die Brust zurück und legen Sie vorsichtig den Pankreaskörper und die Milz mit einer stumpfen Pinzette frei. Erstellen Sie nun in der Steuerungssoftware des Laser-Doppler-Geräts eine neue Messdatei und konfigurieren Sie die angeschlossenen Monitore.

Wählen Sie unter der Registerkarte „Allgemein“ die Überwachungsdauer „Freilauf“ und verwenden Sie die werkseitigen Standardeinstellungen für die Registerkarte LDF-Monitor. Öffnen Sie anschließend das Dialogfeld „Anzeigeeinstellung“ und wählen Sie die entsprechenden Kanäle aus. Schalten Sie dann die folgenden Parameter um: Datenquelle für den Kanal und Beschriftung, Einheiten und Farbe, und klicken Sie danach auf „Weiter“.

Geben Sie anschließend die Identifikationsdaten der Versuchsperson und der Messung im Dateiinformationsdialogfeld ein und fahren Sie fort, indem Sie erneut auf „Weiter“ klicken. Nun ist die Konfiguration abgeschlossen, und ein Messfenster wird angezeigt. Bewegen Sie danach die Elektrode manuell bis auf einen Millimeter an die Bauchspeicheldrüse heran.

Die Messgenauigkeit hängt von dem Abstand zwischen der Sonde und dem Pankreasinselgewebe ab. Die Durchflussmessung des Blutes ist ungenau, es sei denn, ein Abstand von einem Millimeter zwischen dem Gewebe und der Sonde wird sorgfältig eingehalten. Um die Aufzeichnung zu beginnen, klicken Sie auf das Startsymbol, und die Daten zum mikrovaskulären Blut-PU-Wert werden automatisch gespeichert.

Führen Sie dies eine volle Minute lang durch und verwenden Sie die Schaltflächen zum Verkleinern und Vergrößern sowie zum Erhöhen oder Verringern der Höhe der Graphspuren, um den angezeigten Effekt während der Aufnahme anzupassen, und beenden Sie anschließend die Aufnahme. Speichern Sie dann die Datei unter einem geeigneten Namen. Versetzen Sie nun die Sonde manuell an eine neue Position, um additive Effekte und eine lokal begrenzte Erschöpfung der Kontraktions- und Relaxationsfähigkeit zu vermeiden.

Insbesondere sammeln Sie PU-Daten von drei zufälligen Stellen am Pankreas jedes Mäuschen. Messen Sie während des Experiments einmal die PU-Daten von einer nicht reflektierenden Platte, um einen Basiswert als Kontrolle zu erhalten. Nach den drei Messungen schließen Sie die Muskelschichten mit drei-oh-Nähten und anschließend die Hautschicht mit vier-oh-Nähten.

Überwachen Sie nun die Maus in einem Erholungskäfig, bis sie bereit ist, in einen sauberen Heimkäfig umgesetzt zu werden. Im Allgemeinen wird der mikrozirkulatorische Zustand des Pankreasinsels durch periodische Kontraktions- und Relaxationsphasen dargestellt. Das gesamte hämodynamische Phänomen erzeugt ein Muster der Blutströmungsperfusion.

Mithilfe des Laser-Doppler-Geräts wurden PU-Daten erhoben, um das Verteilungsmuster der mikrovaskulären Durchblutung bei nicht-diabetischen und diabetischen Mäusen darzustellen. Die Ergebnisse unterschieden sich vollständig. Der Rhythmus von Kontraktionen und Entspannungen der mikrovaskulären Vasomotion der Pankreasinseln war bei STZ-induzierten diabetischen Mäusen chaotisch und unregelmäßig, während nicht-diabetische Kontrollen rhythmische Oszillationen aufwiesen.

Anschließend wurde die Vasomotion mittels PU-Profilen quantifiziert. Im Vergleich zu Kontrollen war die durchschnittliche Blutperfusion der mikrovaskulären Versorgung der Pankreasinseln bei STZ-induzierten diabetischen Mäusen vermindert. Diese Mäuse zeigten außerdem signifikante Abnahmen in der Amplitude und Frequenz dieser Vasomotion sowie in der relativen Geschwindigkeit der Blutperfusion zu den Pankreasinseln.

Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie bei korrekter Durchführung innerhalb von 30 Minuten durchgeführt werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, darauf zu achten, dass der Abstand zwischen der Sonde und dem Pankreasgewebe innerhalb eines Millimeters liegt. Ein ungeeigneter Abstand führt zu einer künstlich erhöhten oder verminderten Durchblutungsmessung.

Nach Durchführung dieses Verfahrens können andere Methoden wie Laser-Speckle und translokierender Sauerstoff angewendet werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise zur Visualisierung von Ischämie, zur Beurteilung des Blutflusses sowie zur Evaluierung des funktionellen Zustands der mikrovaskulären Vasomotion. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik Forschern und Klinikern auf dem Gebiet der Endokrinologie und des Stoffwechsels den Weg, um die mikrozirkulatorischen Mechanismen hinter Erkrankungen der Pankreasinseln aufzudecken. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Laservorrichtungen aufgrund der Strahlenexposition äußerst gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen, wie beispielsweise einen Sicherheitsabstand von mindestens 200 Millimeter vom Auge zur Umgebung, stets beachtet werden sollten, während dieses Verfahren durchgeführt wird.