Name: Fettreiche Ernährung Fütterung und Hochdurchsatz Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-13T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: Lernen Sie eine Hochdurchsatz-Triacylglycerid-Assay-Methode zur Induktion von Fettleibigkeit bei Drosophila melanogaster. Dieses Protokoll ermöglicht die schnelle Messung von Fettakkumulation für metabolische Forschung.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wir möchte Erika Taylor für die Bearbeitung dieser Handschrift. Diese Arbeit wurde finanziert durch Zuschüsse aus der National Institutes of Health (P01 HL098053, P01 AG033561 und R01 HL054732), r.b., doctoral Research Ergänzung (R01 HL085481) und ein Stipendium (AAUW), S.B.D. und Zuschüsse aus der American Heart Association, S.B.D. und R.T.B.

1. HFD Fütterung Protokoll <img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/56029/56029table1.jpg" /> Tabelle 1. Fliege Nahrungsmittelrezept. 
Diese Tabelle fasst die verschiedenen Zutaten zur Zubereitung unserer Kontrolle. Sobald gebildet, 10 mL des Essens ist in Fläschchen gegossen, gekühlt und bei 4 ° C für langfristige Lagerung gelagert.
<ol><li>HFD Vorbereitung <ol><li>um 1 kg des hohen Fett essen machen, wiegt 700 g vorgefertigte normale fliegen Nahrung (siehe Tabelle 1) und 300 g Kokosöl in zwei getrennten Behältern mit einer Analysenwaage.</li>
		<li>Erhitzen jeder Behälter einzeln in der Mikrowelle, bis der Inhalt vollständig schmelzen. Gießen Sie das Kokosöl in die Fliege Lunchbox. Rühren mit einem Schneebesen, bis das Öl gut in die Fliege Nahrung vermischt ist. 
		Hinweis: Keine Klumpen von Lebensmitteln oder Öl sollte sichtbar sein. Wenn das fliegende Essen in der Mikrowelle schmelzen, zu stoppen, in Abständen von 1 min auf das Essen zu mischen und zu verhindern, überkochen.</li>
		<li>Re wiegen die hohen Fette essen. Wenn das Gesamtgewicht beträgt weniger als 1 kg (700 g Lebensmittel + 300 g Kokosöl), fügen Sie Wasser (ca. 10 mL) zum Ausgleich von Verdunstung während des Erhitzens und bringen wieder das Gewicht auf 1 kg.</li>
		<li>Pour gut durchmischten ca. 10 mL hohe fettreiche Nahrung pro Vial (rund 25 % des Volumens der Durchstechflasche). Als nächstes decken mit Gaze, fliegen zu verhindern &#39; Kontamination. Für 1 h bei Raumtemperatur abkühlen lassen dann die Fläschchen auf 4 ° C für die Lagerung bis zu 4 Wochen übertragen. 
		Hinweis: Die normale Nahrung (NF) wird als Kontrolle Lebensmittel verwendet. Auch Gießen Sie 10 mL (ca. 25 % des Volumens der Vial) NF pro Fläschchen. Ersetzen Sie für die HFD Lebensmittel 30 % der NF-Lebensmittel mit Kokosnuss-Öl. Zur Steuerung und experimentellen Bedingungen, die fliegen erhielten die gleiche Menge an NF und HFD (10 mL Futter pro Fläschchen).</li>
	</ol></li></ol> <img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56029/56029fig1.jpg" /> Abbildung 1 . HFD Fütterung in Drosophila. 
Das Schema zeigt die verschiedenen Fütterung Schritte für fliegen auf einem Steuerelement Essen (normale Ernährung ohne Zusatz von Kokosöl-NF) oder HFD (mit dem Zusatz von Kokosöl). Der gesamte Prozess dauert 10 Tage nach der ersten Sammlung von Erwachsenen fliegen. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56029/56029fig1large.jpg" target="_blank"> Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<ol start="2"> <li>HFD Fütterung von D. Melanogaster Hinweis: dieses Protokoll beinhaltet Kontrolle Essen und HFD Fütterung Verfahren, die mit einer Fliege Linie kompatibel sind. Kontrolle und experimentelle fliegen werden in Ampullen mit der gleichen Menge Essen (NF oder HFD) gelegt.
	<ol><li>Einsatz CO 2 um die fliegen zu betäuben. 
		: Für Neulinge, bitte lesen Hinweis 21 für einen Überblick über Erziehung und Umgang mit D. Melanogaster.</li>
		<li>Sammeln 0-5 Tag alt fliegen von Vials und Transfer (mit Spiegeln) die fliegen in neue Ampullen mit NF (vorher bei Raumtemperatur erwärmt). Lassen Sie das Fliegen Alter für 5 zusätzliche Tage bei 21 ° c</li>
		<li>Am Ende der 5 Tage, nehmen Sie das Fläschchen mit HFD und NF von 4 ° c 
		Hinweis: wie Kälte Leben fliegen, stress können lassen Sie die Fläschchen für 30 min bei Raumtemperatur zum Aufwärmen vor dem Einsatz sitzen.</li>
		<li>Mit Feuchttücher, reinigen und entfernen Sie überschüssigen Flüssigkeit von den Seiten der Durchstechflaschen.</li>
		<li>Legen Sie ein kleines Stück Filterpapier, über 1 cm x 3 cm, in den hohen Fett essen, überschüssige Flüssigkeit zu absorbieren. 
		Hinweis: Dieser Schritt ist wichtig, zu verhindern, dass die fliegen kleben auf HFD Nahrung.</li>
		<li>Transfer als nächstes die fliegen auf den hohen Fett essen (mit Spiegeln). Legen Sie die Flaschen horizontal auf ihrer Seite (nicht stehend) bei 21-22 ° C für 5 Tage. 
		Hinweis: Vermeiden Sie höhere Temperaturen, da dies teilweise hohe fettreiche Nahrung, wodurch die fliegen zu essen und sterben Stick schmelzen kann.</li>
		<li>Nach 5 Tagen, transfer (mit Spiegeln) die fliegen von NF und HFD in neue Fläschchen ohne Nahrung für ihren Mut, für 30 min leer lassen. Als nächstes gehen Sie zum Wiegen der Flies. 
		Hinweis: Die entscheidenden Schritte in dieser HFD Fütterung Protokoll gehört zu einer gut durchmischten HFD, frei von jeder Brocken fliegen Essen oder kondensierten Öl vorzubereiten. Homogen mischen und Kühlung der HFD auf 45-30 ° C ist ratsam, vor dem Gießen in Fläschchen und Lagerung der Lebensmittel im richtigen Alter von 4 ° c Anpassung der Steuerung und experimentellen fliegen ist ebenso wichtig wie kontrollierte Ernährung und ökologischen Bedingungen vor die HFD Fütterung. Während der Einlaufphase Kontrolle und experimentelle fliegt die gleiche Menge an NF und HFD anzugeben. Sammeln Sie nie fliegen aus überfüllten Fläschchen oder Flaschen (zur Vermeidung von generationenübergreifenden Effekte). Setzen Sie immer maximal 25 fliegen pro Fläschchen während NF und HFD Fütterung um diätetische Einschränkung oder andere crowding Effekte zu vermeiden. Die HFD besteht aus 30 % Kokosöl, somit Temperaturen über 22 ° C könnte teilweise schmelzen HFD, wodurch die fliegen zum Aufkleben auf die fettige Lebensmittel und sterben. Reinigen Sie bevor die fliegen auf der HFD die Fläschchen, entfernen das restliche Öl und legen ein Filterpapier überschüssigen Flüssigkeit in der Nahrung zu absorbieren. Während der Inkubation der fliegen auf HFD, regelt die Fläschchen auf ihren Seiten um eine fettfreie horizontale Oberfläche für die fliegen.</li>
	</ol></li> <li>Wiegen die fliegen <ol><li>für jeden Genotyp und Geschlecht getestet werden, eine hochempfindliches Skala verwenden, um die Gewichte bereits beschriftete, leere 1,7 mL Röhrchen aufnehmen.</li>
		<li>Mit Fliege Betäubung oder CO 2, zu betäuben und 36 fliegen von den gleichen Genotyp, Geschlecht, zu sammeln und Einspeisung Status mit einem Pinsel in einer Pre-1,7 mL-Tube wog.</li>
		<li>Wiegen die Röhrchen mit fliegen mit der gleichen hochempfindliches Skala.</li>
		<li>Bestimmen das Durchschnittsgewicht fliegende nach dieser Formel: 
		<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56029/56029eq1.jpg" /> Hinweis: die Anzahl der fliegen in diesem Protokoll ist 36.</li>
		<li>Blitz Einfrieren der 1,7 mL-Röhrchen mit fliegen durch Eintauchen in flüssigem Stickstoff für 2 min. sammeln und die Rohre in Boxen. Als nächstes übertragen die Boxen bis-80 ° C (bevorzugte Temperatur) für die Lagerung bis zur Verwendung mit dem TAG-Assay. 
		Achtung: Flüssiger Stickstoff ist bei einer sehr niedrigen Temperatur. Bitte geeignete persönliche Schutzausrüstung benutzen.</li>
	</ol></li></ol> 2. TAG-Assay <ol><li>Vorbereitung der TAG standard Konzentrationen <ol><li>500 mL PBT vorbereiten (PBS 1 X 0,05 % Triton).</li>
		<li>Mit 0,5 mL Röhrchen und die TAG-Lösung (Table of Materials), bereiten Sie 100 µL des Rohlings (nur PBT) und 100 µL der sechs standard-TAG-Konzentrationen (2 µg/µL 1 µg/µL 0,5 µg/µL; 0,25 µg/µL; 0,125 µg/µL; 0,0625 µg/µL) mit der PBT.</li>
		<li>Die Rohre auf Eis legen und fahren Sie mit Schleifen fliegen.</li>
	</ol></li> <li>Schleifen die fliegen <ol><li>nehmen Sie die gefrorenen fliegen von-80 ° C (Schritt 1.3). Übertragen Sie die Röhrchen mit der fliegen auf Ice</li>
		<li>Zuerst legen Sie 2 mm Metall Mahlkugeln in eine 96-Well-Kugel-Spender, verwenden Sie einen kleinen Pinsel Extrakugeln entfernen.</li>
		<li>Ort der 96-Well-Schleifen Platte auf dem Kopf stehend auf dem Ball Dispenser und Flip die Metallkugeln direkt in die reibende Platte übertragen. Es sollte ein Ball pro Bohrloch.</li>
		<li>Mit einer Multi-Kanal-Pipette 600 µL PBT in jeder Zeile der Schleifscheibe 96-Well-Platte hinzufügen.</li>
		<li>Mit der Pinzette, fügen Sie 3 fliegt pro Bohrloch. Der Genotyp, Geschlecht und Ernährung Zustand der fliegen in jeder Zeile/gut von den Schleifen 96-Well-Platte.</li>
		<li>Legen Sie fest die Kappen auf die Schleifscheibe 96-Well-Platte. Band darf Sie nach oben, um sicherzustellen, dass es kein Durchsickern.</li>
		<li>Setzen Sie richtig die Schleifen 96-Well-Platten der Schleifmaschine. Die Maschine setzen, um die höchste Geschwindigkeit und Presse &#34; laufen &#34; die fliegen für 3 min. mahlen</li>
		<li>Nach 3 min, stoppen die Schleifen und fahren Sie mit Platte Zentrifugation: bewiesenge für 15 min bei 4.000 x g, 4 ° C. Nach Zentrifugation, verwalten die reibende Platte sorgfältig, um zu vermeiden, Mischen des Überstands mit dem Pellet.</li>
	</ol></li> <li>Probenbeladung und Bestimmung des TAG <ol><li>eine neue Spektralphotometer 96-Well-Platte zu nehmen. Mit einer Multi-Kanal-Pipette 200 µL des Reagenz TAG in jeder Zeile der Platte laden.</li>
		<li>Last 20 µL PBT in den ersten Brunnen der ersten Zeile ein Leerzeichen erstellen. Mischen von Pipettieren rauf und runter. Vermeiden Sie Luftblasen.</li>
		<li>Last 20 µL jeder standard Verdünnung (aus Schritt 2.1.2) in den übrigen Brunnen von der ersten Zeile und der Mix von Pipettieren rauf und runter. Vermeiden Sie Luftblasen.</li>
		<li>Mit einer Multi-Kanal-Pipette 20 µL des Überstandes aus jeder Zeile der reibende Platte auf die entsprechende Zeile in der 96-Well-Photometer-Platte übertragen. Pipette rauf und runter, gut mischen. Vermeiden Sie Luftblasen.</li>
		<li>Setzen Sie eine gasdurchlässige Folie oberhalb des 96-Well-Platte.</li>
		<li>Brüten die Platte bei 37 ° C für 10 min. 
		Hinweis: In den Brunnen gibt es Bläschen, Zentrifugieren der Platte für 2 min bei 2.000 x g um alle Luftblasen zu entfernen. Bläschen beeinträchtigt auch die Extinktion lesen.</li>
		<li>Lesen Sie die Absorption von jedem Bohrloch der Platte bei 550 nm mit einem kompatiblen Mikrotestplatte Reader. Als nächstes verfolgen die Standardkurve und bestimmen die Konzentration [µg/µL] unbekannter Proben.</li>
		<li>Um den Betrag des TAG-Inhalt pro mittlere fliegen Gewicht ermitteln verwenden Sie die folgende Formel: 
		<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56029/56029eq2.jpg" /> Hinweis: In diesem Protokoll wurden 3 fliegen in 600 µL PBT gehackt; in der Folge ist das mittlere Volumen pro Fliege 200 µL.</li>
	</ol></li> <li>Bradford-Test und Normalisierung des TAG-Inhalt mit Protein-Inhalt <ol><li>bereiten sieben 100 µL Rinderserumalbumin (BSA) standard Verdünnungen (75 µg/mL; 100 µg/mL; 150 µg/mL; 200 µg/mL; 250 µg/mL; 500 µg/mL; 1.000 µg/mL) mit der PBT.</li>
		<li>Nehmen eine neue 96-Well-Platte und 200 µL 1 X Bradford-Reagenz in jeder Zeile der Platte laden.</li>
		<li>In die erste Vertiefung der ersten Zeile fügen Sie 10 µL PBT erstelle ich eine leere. Mischen von Pipettieren rauf und runter. Vermeiden Sie Luftblasen.</li>
		<li>Fügen Sie 10 µL jeder standard Verdünnung in den verbleibenden Brunnen von der ersten Zeile und der Mix von Pipettieren rauf und runter. Vermeiden Sie Luftblasen.</li>
		<li>Mit einer Multi-Kanal-Pipette 10 µL Überstand der Fliege aus jeder Zeile der reibende Platte in die entsprechende Zeile in der 96-Well-Platte übertragen. Pipette rauf und runter, gut mischen. Vermeiden Sie Luftblasen.</li>
		<li>Legen Sie eine gasdurchlässige Folie oberhalb des 96-Well-Platte.</li>
		<li>Die Platte bei 5 min bei Raumtemperatur inkubieren. In den Vertiefungen gibt es Bläschen, Zentrifugieren die Platte für 2 min bei 2.000 x g um sie zu entfernen. 
		Hinweis: Bläschen wird das Ablesen der Absorption stören.</li>
		<li>Einsatz einem Spektrophotometer zu lesen die Extinktion des Rohlings, Normen und unbekannte Proben bei 595 nm. Die Standardkurve verwenden, um die Konzentrationen [µg/µL] der Proben in jeder Zeile bestimmen.</li>
		<li>Normalisieren das TAG zufrieden mit Protein-Ebene mit Hilfe der folgenden Formel: 
		<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56029/56029eq3.jpg" /></li></ol></li></ol>

<ol><li>Ng, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global%2C+regional%2C+and+national+prevalence+of+overweight+and+obesity+in+children+and+adults+during+1980-2013%3A+a+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2013%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Global, regional, and national prevalence of overweight and obesity in children and adults during 1980-2013: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2013.</a> Lancet. 384, 766-781 (2014).</li>
<li>Murphy, S. L., et al. Mortality in the United States, 2014. NCHS data brief, no 229. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/nchs/products/databriefs/db229.htm">https://www.cdc.gov/nchs/products/databriefs/db229.htm</a> (2015).</li>
<li>Bodmer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+development+in+Drosophila+and+its+relationship+to+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cardiovasc+Med%22%5BJournal%5D)">Heart development in Drosophila and its relationship to vertebrates.</a> Trends Cardiovasc Med. 5, 21-28 (1995).</li>
<li>Brumby, A. M., Richardson, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+Drosophila+melanogaster+to+map+human+cancer+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Using Drosophila melanogaster to map human cancer pathways.</a> Nat Rev Cancer. 5, 626-639 (2005).</li>
<li>Chan, H. Y., Bonini, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+models+of+human+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Drosophila models of human neurodegenerative disease.</a> Cell Death Differ. 7, 1075-1080 (2000).</li>
<li>Levine, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+DNA+sequences+homologous+to+a+protein+coding+region+conserved+between+homeotic+genes+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Human DNA sequences homologous to a protein coding region conserved between homeotic genes of Drosophila.</a> Cell. 38, 667-673 (1984).</li>
<li>Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila%2C+the+golden+bug%2C+emerges+as+a+tool+for+human+genetics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Drosophila, the golden bug, emerges as a tool for human genetics.</a> Nat Rev Genet. 6, 9-23 (2005).</li>
<li>Bier, E., Bodmer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila%2C+an+emerging+model+for+cardiac+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Drosophila, an emerging model for cardiac disease.</a> Gene. 342, 1-11 (2004).</li>
<li>Noyes, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+expression+of+the+Drosophila+adipokinetic+hormone+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Identification and expression of the Drosophila adipokinetic hormone gene.</a> Mol Cell Endocrinol. 109, 133-141 (1995).</li>
<li>Rajan, A., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Of+flies+and+men%3A+insights+on+organismal+metabolism+from+fruit+flies%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Of flies and men: insights on organismal metabolism from fruit flies.</a> BMC Biol. 11, 38(2013).</li>
<li>Rulifson, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ablation+of+insulin-producing+neurons+in+flies%3A+growth+and+diabetic+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Ablation of insulin-producing neurons in flies: growth and diabetic phenotypes.</a> Science. 296, 1118-1120 (2002).</li>
<li>Birse, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-fat-diet-induced+obesity+and+heart+dysfunction+are+regulated+by+the+TOR+pathway+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">High-fat-diet-induced obesity and heart dysfunction are regulated by the TOR pathway in Drosophila.</a> Cell Metab. 12, 533-544 (2010).</li>
<li>Musselman, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-sugar+diet+produces+obesity+and+insulin+resistance+in+wild-type+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Models+Mech%22%5BJournal%5D)">A high-sugar diet produces obesity and insulin resistance in wild-type Drosophila.</a> Dis Models Mech. 4, 842-849 (2011).</li>
<li>Diop, S. B., Bodmer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gaining+Insights+into+Diabetic+Cardiomyopathy+from+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Gaining Insights into Diabetic Cardiomyopathy from Drosophila.</a> Trends Endocrinol Metab. 26, 618-627 (2015).</li>
<li>Williams, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Obesity-Linked+Gene+Nudt3+Drosophila+Homolog+Aps+Is+Associated+With+Insulin+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">The Obesity-Linked Gene Nudt3 Drosophila Homolog Aps Is Associated With Insulin Signaling.</a> Mol Endocrinol. 29, 1303-1319 (2015).</li>
<li>Morris, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+diet-induced+insulin+resistance+in+adult+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Development of diet-induced insulin resistance in adult Drosophila melanogaster.</a> Biochim Biophys Acta. 1822, 1230-1237 (2012).</li>
<li>Bodmer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gene+tinman+is+required+for+specification+of+the+heart+and+visceral+muscles+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The gene tinman is required for specification of the heart and visceral muscles in Drosophila.</a> Development. 118, 719-729 (1993).</li>
<li>Erkkila, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+fatty+acids+and+cardiovascular+disease%3A+an+epidemiological+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Dietary fatty acids and cardiovascular disease: an epidemiological approach.</a> Prog Lipid Res. 47, 172-187 (2008).</li>
<li>Ganz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+fat+diet+feeding+results+in+gender+specific+steatohepatitis+and+inflammasome+activation%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">High fat diet feeding results in gender specific steatohepatitis and inflammasome activation.</a> World J Gastroenterol. 20, 8525-8534 (2014).</li>
<li>Wang, C. Y., Liao, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+of+diet-induced+obesity+and+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">A mouse model of diet-induced obesity and insulin resistance.</a> Methods Mol Biol. 821, 421-433 (2012).</li>
<li>Stocker, H., Gallant, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+started%3A+an+overview+on+raising+and+handling+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Getting started: an overview on raising and handling Drosophila.</a> Methods Mol Biol. 420, 27-44 (2008).</li>
<li>Mathews, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sexual+Dimorphism+of+Body+Size+Is+Controlled+by+Dosage+of+the+X-Chromosomal+Gene+Myc+and+by+the+Sex-Determining+Gene+tra+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Sexual Dimorphism of Body Size Is Controlled by Dosage of the X-Chromosomal Gene Myc and by the Sex-Determining Gene tra in Drosophila.</a> Genetics. 205, 1215-1228 (2017).</li>
<li>Golay, A., Bobbioni, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+dietary+fat+in+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Obes+Relat+Metab+Disord%22%5BJournal%5D)">The role of dietary fat in obesity.</a> Int J Obes Relat Metab Disord. 21, Suppl 3 2-11 (1997).</li>
<li>Diop, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PGC-1%2FSpargel+Counteracts+High-Fat-Diet-Induced+Obesity+and+Cardiac+Lipotoxicity+Downstream+of+TOR+and+Brummer+ATGL+Lipase%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">PGC-1/Spargel Counteracts High-Fat-Diet-Induced Obesity and Cardiac Lipotoxicity Downstream of TOR and Brummer ATGL Lipase.</a> Cell Rep. 10, 1-13 (2015).</li>
<li>Chatterjee, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+metabolic+adaptation+to+fasting+by+dILP6-induced+insulin+signaling+in+Drosophila+oenocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Control of metabolic adaptation to fasting by dILP6-induced insulin signaling in Drosophila oenocytes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 17959-17964 (2014).</li>
<li>Palanker, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+HNF4+regulates+lipid+mobilization+and+beta-oxidation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Drosophila HNF4 regulates lipid mobilization and beta-oxidation.</a> Cell Metab. 9, 228-239 (2009).</li>
<li>Heinrichsen, E. T., Haddad, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+high-fat+diet+in+stress+response+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Role of high-fat diet in stress response of Drosophila.</a> PLoS One. 7, 42587(2012).</li>
<li>Kitahara, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+between+class+III+obesity+%28BMI+of+40-59+kg%2Fm2%29+and+mortality%3A+a+pooled+analysis+of+20+prospective+studies%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Med%22%5BJournal%5D)">Association between class III obesity (BMI of 40-59 kg/m2) and mortality: a pooled analysis of 20 prospective studies.</a> PLoS Med. 11, 1001673(2014).</li>
<li>Reis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+five+lipid+extraction+solvent+systems+for+lipidomic+studies+of+human+LDL%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">A comparison of five lipid extraction solvent systems for lipidomic studies of human LDL.</a> J Lipid Res. 54, 1812-1824 (2013).</li>
<li>Turne, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supercritical+fluid+extraction+and+chromatography+for+fat-soluble+vitamin+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+A%22%5BJournal%5D)">Supercritical fluid extraction and chromatography for fat-soluble vitamin analysis.</a> J Chromatogr A. 936, 215-237 (2001).</li>
<li>Na, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+model+of+high+sugar+diet-induced+cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Drosophila model of high sugar diet-induced cardiomyopathy.</a> PLoS Genet. 9, 1003175(2013).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Adipositas-Induktion bei Mäusen kann Monate19,20nehmen. In Fliegen ermöglicht dieser HFD Fütterung Protokoll für die Induktion von überschüssigen Fettansammlung in einer Angelegenheit von Tagen oder weniger, verursachen erhöht in Fettansammlung erst nach 18 Uhr (siehe Abbildung 2). HFD füttern mit dem beschriebenen Protokoll Glukose Inhalt 12 erhöht oder verringert Bmm Lipase und PGC-1 Ausdruck<sup cl...

Wir befinden uns in einer Zeit, wo Übergewicht und die damit verbundenen wirtschaftlichen Belastungen ist ein weltweites Problem1. Zwei von drei Amerikanern sind übergewichtig oder fettleibig mit den damit verbundenen Herz Krankheiten, die primäre Ursache des Todes in der erwachsenen Bevölkerung2. Neue effiziente Methoden sind notwendig, um die genetischen und molekularen Komponenten beteiligt an der Regulation des metabolischen Syndroms mit Modellorganismen angemessen zu untersuchen. Aus diesem Grund wählen wir die Fruchtfliege Drosophila -Modell, weil es die grundlegende biologische Prozesse mit Säugetieren, einschließlich Menschen und Mäusen3,4,5,6teilt. Drosophila-Genom ist im Laufe der Evolution hoch konservierte aber insgesamt viel kleiner mit weniger Genduplikation und metabolische Komplexität, wodurch es ideal für das Verständnis der grundlegenden Mechanismen in vielen menschlichen Krankheiten4 verwickelt , 7 , 8. auch charakteristische Prozesse durchgeführt durch Fettgewebe, Darm und Bauchspeicheldrüse sind vertreten in der Fliege und vermitteln Regulierungsaufgaben in Glukose und Lipid-Stoffwechsel, zum Beispiel, die ähnlich wie Menschen9, 10,11. Darüber hinaus sind die grundlegende molekulare Wege der Kontrolle von Übergewicht, Insulinresistenz und Diabetes beim Menschen beteiligt in Drosophila Melanogaster12,13,14 funktionell konserviert. , 15 , 16. wie höhere Organismen, Drosophila hat ein schlagendes Herz, die während der Entwicklung durch ähnliche Prozesse der Säugetier-Herz3,17entsteht. So bieten die Entwicklung einer zuverlässigen HFD Fütterung Protokoll und hohem Durchsatz TAG Assay, angepasst für effiziente Sortierung Zwecke mit Hilfe den genetischen Werkzeugkasten von Drosophila, ein wichtiges Mittel zu untersuchen und verstehen die grundlegenden genetische Grundlagen zugrunde liegenden komplexen Stoffwechselerkrankungen.
Das HFD Essen selbst besteht aus einem Standardlabor fliegen Lebensmittel ergänzt mit Kokosnuss-Öl, besteht hauptsächlich aus gesättigten Fettsäuren bekannt, metabolisches Syndrom18zugeordnet werden soll. Während Fettleibigkeit bei Säugetieren Modelle, wie Nagetiere, Induktion Monate19,20nehmen kann, erhöht unsere optimierte HFD Protokoll in Drosophila füttern, effektiv und reproduzierbar organismal Fettgehalt in wenigen Tage12,14. Dieses Protokoll ermöglicht in Verbindung mit einem hohen Durchsatz TAG-Assay, effiziente mass Screening für die Auswirkungen der genetischen Faktoren, Umwelteinflüssen und Medikamentenkandidaten neue Modulatoren des Fettstoffwechsels zu entdecken. In der Folge dürften diese Protokolle zu verstehen und/oder Übergewicht und Fettleibigkeit verbundenen menschlichen Krankheiten zu bekämpfen.
Die Fütterung Protokoll ist vielseitig und kann angewendet werden, um die Stoffwechsel- und funktionelle Auswirkungen der einzelnen gesättigte oder ungesättigte Fettsäure zu studieren. Der Einsatz von Hochdurchsatz-TAG Assays beschränkt sich nicht auf D. Melanogaster, sondern kann auf eine Vielzahl von kleinen Modellorganismen mit Kutikula oder harte extrazellulären Matrizen(z. B.andere Drosophila -Arten, C. Elegans angepasst werden und anderen Wirbellosen Modellorganismen) Fettgehalt unter verschiedenen ökologischen, genetischen und physiologischen Bedingungen, in jedem Stadium der Entwicklung, Erwachsenenalter oder Phase Stoffwechselerkrankung zu messen. Die TAG-Assay basiert auf eine farbmetrische Messung aus einer Reihe von enzymatischen Reaktionen, die verschlechtern die TAGs in freie Fettsäuren, Glycerin, Glycerol-3-Phosphat und schließlich H2O2 , das mit 4-Aminoantipyrine (4-AAP) und 3,5 - reagiert Dichlor-2-Hydroxybenzene Sulfonate (3,5 DHBS) eine rote farbige Produkt zu produzieren, die mit einer 96-Well-Spektralphotometer gemessen wird.

<table><tbody><tr><td>Talboys Kugeltropfer-/Perlenspender</td><td>Talboys</td><td>#: 930150</td><td></td></tr><tr><td>Talboys Homogenisator mit hohem Durchsatz</td><td>Talboys</td><td>#: 930145</td><td></td></tr><tr><td>Mahlkugeln, Edelstahl&nbsp;</td><td>OPS Diagnostics, LLC</td><td># GBSS 156-5000-01</td><td>5000 Kugeln</td></tr><tr><td>Masterblock 96 Well tiefe Mikroplatten</td><td>Greiner Bio-One</td><td># T-3058-1</td><td>Karton mit 80 Platten</td></tr><tr><td>Greiner&nbsp; 96 Well Mikroplatten mit flachem Boden</td><td>Sigma Aldrich</td><td># M4436 40</td><td>Platten</td></tr><tr><td>Greiner CapMat zum Versiegeln von Multiwell-Platten</td><td>Sigma Aldrich</td><td># C3606</td><td>50 Siegelplatten</td></tr><tr><td>Reagenzreservoire& nbsp;</td><td>Thomas Scientific</td><td># 1192T71</td><td>12/PK</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Finnpipette 4661040</td><td>Thermo Scientific</td><td># 4661040</td><td>1-10 ul Multipipette</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Finnpipette 4661070</td><td>Thermo Scientific</td><td># 4661070</td><td>30-300ul Multipipette</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Finnpipette 4661020</td><td>Thermo Scientific</td><td>#4661020</td><td>10-100ul Multipipette</td></tr><tr><td>Mehrkanal Spitzen</td><td>Denville Scientific Inc</td><td># P3131-S</td><td>für 10 μl Pipette</td></tr><tr><td>Mehrkanal-Spitzen</td><td>Denville Scientific Inc</td><td># P3133-S</td><td>für 200 μl Pipette</td></tr><tr><td>Mehrkanal-Spitzen</td><td>Denville Scientific Inc</td><td>#P1125</td><td>für 100 μl Pipettenzange</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Roboz Schirical</td><td># 5 Dumonts</td><td>Superfeine Pinzette</td></tr><tr><td>Mettler Toledo Excellence XS Analysenwaage Mfr# XS64</td><td>Cole-Parmer wissenschaftliche Experten</td><td># EW-11333-00</td><td></td></tr><tr><td>Metler Toledo Excellence XS Toploading-Waage</td><td>Cole-Parmer wissenschaftliche Experten</td><td># EW-11333-49</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Mikrotiterplatten-Zentrifuge</td><td>Hettich Zentrifugen</td><td># Rotina 420R</td><td></td></tr><tr><td>Mikroplatte Reader</td><td>Molecular devices</td><td># SpectraMax 190</td><td></td></tr><tr><td>Lab-Line Bench Top Orbit Environ Shaker Inkubator</td><td>Biostad</td><td># 3527</td><td></td></tr><tr><td>Infinity Triglyceride Reagenz</td><td>Thermo Scientific</td><td># TR22421</td><td></td></tr><tr><td>Triglyceride Standard</td><td>Stanbio</td><td>#2103 - 030</td><td></td></tr><tr><td>Quick Start Bradford Protein Assay</td><td>Bio-RAD</td><td># 500-0205</td><td>1x Farbstoff Reagenz</td></tr><tr><td>Kokosöl</td><td>Nutiva</td><td># 692752200014</td><td>15 0z Glas</td></tr><tr><td>PBS 10X</td><td>Thermo Scientific</td><td># AM9625</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td># 9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Gasdurchlässige Folie</td><td>Macherey-Nagel</td><td># 740675</td><td>50 Stück</td></tr><tr><td>Filterpapier</td><td>VWR</td><td># 28317-241</td><td>Packung mit 100</td></tr><tr><td>Drosophila-Fläschchen</td><td>Genesee Scientific</td><td>Katze #: 32-116SB</td><td></td></tr><tr><td>Schnellstart Rinderserumalbumin Standard</td><td>Bio-Rad</td><td># 5000206</td><td></td></tr><tr><td>FlyNap Anästhetikum</td><td>Carolina</td><td># 173025</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>Kimwipes Fusselarme</td><td>Uline</td><td># S-8115</td><td>1-lagig, 4,4 x 8,4"</td></tr></tbody></table>

fettreiche ernährung fütterung und hochdurchsatz triacylglyceride assay in drosophila melanogaster

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

Herzkrankheit ist die häufigste Ursache des menschlichen Todes weltweit. Zahlreiche Studien haben starke Verbindungen zwischen Adipositas und kardiale Störungen beim Menschen gezeigt, aber mehr Instrumente und Forschungsanstrengungen sind erforderlich, die Mechanismen besser aufzuklären. Seit mehr als einem Jahrhundert, das genetisch sehr gefügig Modell von Drosophila maßgeblich an der Entdeckung der Schlüsselgene und molekulare Signalwege, die erwies sich als hoch über Artgrenzen konserviert werden. Viele biologische Prozesse und Krankheitsmechanismen sind funktionell in der Fliege, wie Entwicklung (z.B., Körper Plan, Herz), Krebs und Neurodegenerative Erkrankung erhalten. Vor kurzem spielte das Studium der Fettleibigkeit und sekundären Krankheiten wie Herz-Kreislauferkrankungen in Modellorganismen, eine sehr wichtige Rolle bei der Identifizierung der wichtigsten Regulatoren metabolisches Syndrom beim Menschen beteiligt.
Hier schlagen wir vor, diesem Modellorganismus als ein effizientes Werkzeug zu induzieren, Adipositas, d. h., übermäßige Fettansammlung, und entwickeln ein effizientes Protokoll zur Überwachung der Fettgehalt in Form von TAGs Anhäufung verwenden. Neben den hoch konservierte, aber weniger komplexes Genom hat die Fliege auch eine kurze Lebensdauer für schnelle Experimente, kombiniert mit Wirtschaftlichkeit. Dieser Artikel bietet ein detailliertes Protokoll für hohen Fett-Diät (HFD) Fütterung in Drosophila , Übergewicht und ein hoher Durchsatz Triacylglyceride (TAG) Assay für die Messung der damit verbundenen Zunahme der Fettgehalt, mit dem Ziel, sehr reproduzierbar zu induzieren und effizient für große genetische oder chemische Screening. Diese Protokolle bieten neue Möglichkeiten, um effizient Regulationsmechanismen beteiligt Fettleibigkeit zu untersuchen, sowie bieten eine standardisierte Plattform für Droge-Entdeckung-Forschung für die schnelle Prüfung der Wirkung von Medikamenten-Kandidaten auf die Entwicklung oder Vorbeugung von Fettleibigkeit, Diabetes und metabolische Erkrankungen.

In D. Melanogasterwie der Fall mit anderen Arten ist gibt es Geschlechtsdimorphismus zwischen Männchen und Weibchen22. Es ist bekannt, dass die Weibchen größer, mit mehr Fett in ihre Bäuche als Männchen22 sind. Um die Wirksamkeit unserer Protokoll zu testen, haben wir TAG Tests ermitteln die TAG inhaltliche Unterschiede zwischen Männchen und Weibchen Standardlabor Wildtyp (w1118) fliegt. Die Daten zeigen, dass Fr...

Dies ist eine fettreiche Ernährung Fütterung Protokoll zur Fettleibigkeit in Drosophila, ein Modell für Verständnis grundlegende molekulare Mechanismen in Lipotoxicity verwickelt zu induzieren. Es bietet auch einen hohen Durchsatz Triacylglyceride Assay zur Messung der Fettansammlung in Drosophila und möglicherweise andere (Insekt) Modelle unter verschiedenen diätetischen, Umwelt, genetische oder physiologischen Bedingungen.

Fettreiche Ernährung Fütterung und Hochdurchsatz Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

Heart disease is the number one cause of human death worldwide. Numerous studies have shown strong connections between obesity and cardiac malfunction in ...

Das übergeordnete Ziel dieses Fütterungsprotokolls mit fettreicher Nahrung und des Hochdurchsatzverfahrens zur Triacylglycerid-Bestimmung besteht darin, Fettleibigkeit in einem Modellorganismus wie Drosophila melanogaster hervorzurufen und die damit verbundenen Veränderungen des Fettgehalts unter verschiedenen Bedingungen zu überwachen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich des Stoffwechsels zu beantworten, darunter die Organismus-weite Adipositas und organspezifische Lipotoxizität im Zusammenhang mit Diabetes, metabolischem Syndrom, Leber- und Herzmuskelfettinfiltration. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass die übermäßige Fettansammlung bei Drosophila innerhalb weniger Tage induziert werden kann und der Fettgehalt anschließend innerhalb von etwa einer Stunde gleichzeitig bestimmt werden kann.Die Auswirkungen dieser Technik erstrecken sich auf die Diagnose von Stoffwechselerkrankungen und deren Therapie, da das Hochdurchsatzprotokoll beschleunigte Arzneimittelentdeckungsstudien unter Verwendung dieses Modellsystems ermöglicht. Beginnen Sie das Experiment, indem Sie ein Kilogramm fettreiches Futter vorbereiten, 700 Gramm vorgefertigtes Fliegenfutter und 300 Gramm Kokosöl mit einer Analysenwaage in zwei getrennte Behälter abwiegen. Erhitzen Sie jeden Behälter einzeln in der Mikrowelle, bis sich der Inhalt vollständig verflüssigt hat.Geben Sie das geschmolzene Kokosöl in den Fliegenfutterbehälter und rühren Sie die Inhalte mit einem Schneebesen um, bis das Öl vollständig in das Fliegenfutter eingearbeitet ist. Wiegen Sie das fettreiche Futter erneut ab. Falls das Gesamtgewicht weniger als ein Kilogramm beträgt, geben Sie etwa 10 Milliliter Wasser hinzu, um das Gewicht wieder auf ein Kilogramm aufzufüllen.Geben Sie anschließend 10 Milliliter der gut gemischten fettreichen Nahrung in jedes Gefäß. Bedecken Sie die Nahrung mit dem Mulltuch, um Kontaminationen zu verhindern, und lassen Sie die Nahrung eine Stunde lang bei Raumtemperatur abkühlen. Nach dem Abkühlen bringen Sie die Gefäße zur Lagerung bis zu vier Wochen bei vier Grad Celsius. Verwenden Sie CO2, um die Fliegen zu betäuben. Sammeln Sie null bis fünf Tage alte Fliegen aus den Röhrchen und überführen Sie sie in neue Röhrchen mit zuvor erwärmtem normalem Futter (NF). Lassen Sie die Fliegen weitere fünf Tage bei 21 Grad Celsius altern. Am Ende der fünf Tage entnehmen Sie die Röhrchen mit der fettreichen Nahrung (HFD) und dem normalen Futter (NF) aus einer 4-Grad-Celsius-Umgebung.Reinigen Sie die Röhrchen und entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit an den Seiten mit Tüchern, um zu verhindern, dass die Fliegen an dem HFD-Futter kleben bleiben. Legen Sie ein kleines Stück Filterpapier von etwa einem Zentimeter mal drei Zentimetern in das fettreiche Futter, um überschüssige Flüssigkeit aufzusaugen. Danach drehen Sie die Fliegen auf das fettreiche Futter um.Legen Sie die Röhrchen fünf Tage lang horizontal bei 21 bis 22 Grad Celsius. Nach fünf Tagen überführen Sie die Fliegen aus den NF- und HFD-Röhrchen in neue Röhrchen ohne Nahrung, um ihren Darm 30 Minuten lang entleeren zu lassen. Danach wiegen Sie die Fliegen.Für jedes zu testende Genotyp und Geschlecht verwenden Sie eine ultrapräzise Waage, um das Gewicht vorklassifizierter leerer 1,7-Milliliter-Röhrchen zu erfassen. Betäuben und sammeln Sie 36 Fliegen desselben Genotyps, Geschlechts und Fütterungsstatus mit einem Pinsel in einem vorgewogenen 1,7-Milliliter-Röhrchen. Wiegen Sie anschließend das Fliegen enthaltende Röhrchen mit derselben ultrapräzisen Waage.Tiefgefrieren Sie die 1,7-Milliliter-Röhrchen mit Fliegen, indem Sie sie zwei Minuten lang in flüssigen Stickstoff eintauchen. Sammeln Sie die Röhrchen und stellen Sie sie in Boxen. Überführen Sie anschließend die Boxen in einen Gefrierschrank bei minus 80 Grad Celsius, um sie bis zur Verwendung im TAG-Assay aufzubewahren.Entfernen Sie zuerst die gefrorenen Fliegen aus dem Gefrierschrank bei minus 80 Grad Celsius und stellen Sie die Röhrchen auf Eis. Geben Sie zwei Millimeter große Metallkugeln in einen 96-Loch-Kugelverteiler und entfernen Sie mithilfe eines kleinen Pinsels überschüssige Kugeln. Legen Sie anschließend die 96-Loch-Zerkleinerungsplatte verkehrt herum auf den Kugelverteiler und drehen Sie dieses Setup um, um die Metallkugeln direkt in die Zerkleinerungsplatte zu überführen.Stellen Sie sicher, dass sich pro Vertiefung eine Kugel befindet. Fügen Sie dann mit einer Mehrkanalpipette 600 Mikroliter PBT in jede Reihe der 96-Vertiefungs-Zerkleinerungsplatte hinzu. Geben Sie mit einer Pinzette jeweils drei Fliegen pro Vertiefung hinzu.Geben Sie das Genotyp, das Geschlecht und den Futterzustand der Fliegen in jeder Reihe oder jedem Bohrloch der 96-Loch-Zerkleinerungsplatte an. Setzen Sie die Deckel fest auf die 96-Loch-Zerkleinerungsplatte. Bringen Sie oben ein Klebeband an, um sicherzustellen, dass kein Austritt erfolgt.Platzieren Sie die 96-Well-Zerkleinerungsplatten korrekt in der Zerkleinerungsmaschine. Stellen Sie die Maschine auf die höchste Drehzahl ein und drücken Sie „Start“, um die Fliegen drei Minuten lang zu zerkleinern. Stoppen Sie nach drei Minuten die Zerkleinerung und fahren Sie mit der Zentrifugation fort.Nach der Zentrifugation die Mahlplatte vorsichtig handhaben, um eine Vermischung des Überstandes mit dem Pellet zu vermeiden. Mit einer Mehrkanalpipette 200 Mikroliter des TAG-Reagenz in jede Reihe einer neuen 96-Loch-Spektrophotometerplatte geben. 20 Mikroliter PBT in das erste Loch der ersten Reihe geben, um eine Blindprobe herzustellen.Mischen Sie durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren. Geben Sie 20 Mikroliter jeder Standardverdünnung in die verbleibenden Vertiefungen der ersten Reihe und mischen Sie durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren. Übertragen Sie mithilfe einer Mehrkanalpipette 20 Mikroliter Überstand aus jeder Reihe der Mahlplatte in die entsprechende Reihe der 96-Loch-Spektrophotometerplatte.Mehrere Male auf- und abpipettieren, um gut zu mischen. Danach eine gasdurchlässige Folie über die Oberseite der 96-Well-Platte legen. Die Platte 10 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren.Lesen Sie die Extinktion jedes Wells der Platte bei 550 Nanometern mit einem kompatiblen Mikroplattenreader ab. TAG-Assays von standardmäßigen Labor-Wildtyp-Fliegen zeigen, dass Weibchen mehr Körperfett im gesamten Körper besitzen als ihre männlichen Gegenstücke. Die Daten zeigten außerdem, dass der Assay stabil ist, ohne Variationen in der TAG-Quantifizierung über die Zeit und ohne Variationen in Abhängigkeit von der biologischen Probenmenge.Tag-Assays an weiblichen Fliegen, die entweder mit fettreicher Nahrung (HFD) oder Kontrollnahrung gefüttert wurden, zeigten, dass die Aufnahme von HFD bei Drosophila zu einem erhöhten Fettgehalt führt, der sich im Laufe der Zeit progressiv anreichert. Schon nach nur 18 Stunden HFD-Fütterung wurde bei den Fliegen ein signifikanter Anstieg des Fettgehalts ausgelöst. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, gut gereinigte Röhrchen für die Fütterung mit fettreicher Nahrung zu verwenden.Lagern Sie die Fliegen bei 22 Grad oder darunter; vermeiden Sie zudem, während des Pipettierens im Tag-Assay Überstand mit Zelltrümmern zu vermischen. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik Forschern, die den Stoffwechsel und assoziierte Erkrankungen untersuchen, den Weg, um die Auswirkungen von Nährstoffüberschuss sowie die genetische Grundlage der Fettansammlung und assoziierte Organfunktionsstörungen wie lipotoxische Kardiomyopathie bei Drosophila zu erforschen.

high-fat-diet-feeding-high-throughput-triacylglyceride-assay

Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Dieses Video beschreibt einen Fütterungstest für Fruchtfliegen, bei dem farbiges Futter verwendet wird, um die Fütterung und die Wirkung zugesetzter Verbindungen auf die Fressaktivität zu überwachen. Das Beispielprotokoll testet die Wirkung verschiedener endokrin wirksamer Chemikalien (EDC).

Fütterungstest: Erfassung der Fresspräferenzen bei Drosophila melanogaster

Dieses Protokoll beschreibt einen Hochdurchsatz-Assay zum Testen der Eiablagepräferenzen von Drosophila melanogaster bei Einzeltierauflösung.  Dieser Assay bietet eine einfache, effiziente und skalierbare Plattform zur Identifizierung von Genen und Schaltkreiskomponenten, die einen einfachen Entscheidungsprozess steuern.

Assay mit hohem Durchsatz Eiablage Präferenzen der einzelnen zu untersuchen<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Hier präsentieren wir eine Methode organismal Fettwerte im dritten Larvenstadium (L3) Larvenstadium von Drosophila melanogaster zu messen. Dieses Verfahren nutzt die vergleichsweise geringe Dichte von Fettgewebe zwischen Larven mit einer veränderten Fettspeicher zu unterscheiden. Buoyancy-basierte Analyse ist ein wertvolles Werkzeug für die schnelle, reproduzierbare und wirtschaftliche Screening.

Ein Auftriebskörper-basierte Methode zur Bestimmung Fettwerte in<em&gt; Drosophila</em

Wir beschreiben ein Protokoll zur Induktion lohnend und nonrewarding Erfahrungen in Fruchtfliegen (Drosophila melanogaster) mit freiwilligen Ethanolkonsum als Maß für Änderungen in Lohn Staaten.

Ein einfacher Weg zu messen Veränderungen in Reward-seeking Verhalten verwenden<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Der CApillary FEeder (CAFE) Assay ist eine einfache, budgetfreundliche und äußerst zuverlässige Methode zur Untersuchung von Mechanismen, die der Nahrungsaufnahme zugrunde liegen. In Verbindung mit dem vielseitigen genetischen Modellorganismus Drosophila melanogaster bietet es ein leistungsfähiges Mittel, um neue Erkenntnisse über die Regulationsmechanismen der Nahrungsaufnahme zu gewinnen.

Die kapillare feeder Assay misst die Nahrungsaufnahme in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Quantitative Nahrungsaufnahme Assays mit gefärbten Lebensmittel bieten eine robuste und Hochdurchsatz-Mittel zur Fütterung Motivation zu bewerten. Kombination des Lebensmittel Verbrauch Tests mit thermogenetischen und optogenetische Bildschirme ist ein leistungsfähiger Ansatz zu untersuchen, die neuronale Schaltkreise, die zugrunde liegenden Appetit bei Erwachsenen Drosophila Melanogaster.

Kombination von quantitativer Nahrungsaufnahme Assays und zwangsweise Aktivierung von Neuronen um Appetit in Drosophila studieren

Die TreadWheel nutzt Drehbewegung induzieren sanft Übung in Erwachsenen Drosophila Melanogaster durch Ausnutzung fliegen Angeborene, negative Geotaxis. Es ermöglicht für die Analyse der Wechselwirkungen zwischen Bewegung und Faktoren wie Genotyp, Geschlecht und Ernährung und ihre Auswirkungen auf die physiologischen und molekularen Tests, metabolische Gesundheit festzusetzen.

TreadWheel: Intervall Trainingsprotokoll sanft induzierte Bewegung in Drosophila melanogaster

Beschrieben hier ist ein Protokoll, das die kolorimetrische Quantifizierung der Menge der Nahrung ermöglicht, die innerhalb eines definierten Zeitintervalls von Drosophila melanogaster Larven gegessen wird, die Diäten unterschiedlicher Makronährstoffqualität ausgesetzt sind. Diese Assays werden im Rahmen eines neuronalen thermogenetischen Bildschirms durchgeführt.

Quantifizierung der Zufuhr von Makronährstoffen in einem thermogenetischen neuronalen Bildschirm mit Drosophila Larven

Wir präsentieren ein Protokoll für einen Fütterungstest mit zwei Wahlmöglichkeiten für Fliegen. Dieser Fütterungstest ist schnell und einfach zu betreiben und eignet sich nicht nur für kleine Laborforschung, sondern auch für Verhaltensbildschirme mit hohem Durchsatz bei Fliegen.

Ein schneller Food-Preference-Test in Drosophila

Der Microplate-Feeder-Assay bietet eine wirtschaftliche Methode mit hohem Durchsatz zur Quantifizierung des Verbrauchs flüssiger Lebensmittel in Drosophila. Ein 3D-gedrucktes Gerät verbindet eine 96-Well-Mikroplatte, in der Fliegen untergebracht sind, mit einer 1536-Well-Mikroplatte, von der Fliegen eine Fütterungslösung mit einem Tracerfarbstoff verbrauchen. Der Volumenrückgang der Lösung wird spektralphotometrisch gemessen.

Ein Hochdurchsatz-Mikroplatten-Feeder-Assay zur Quantifizierung des Verbrauchs in Drosophila

Dieses Protokoll beschreibt eine effiziente und kostengünstige Methode, bei der flüssige Medien verwendet werden, um die Auswirkungen chemischer Giftstoffe auf die Lebensfähigkeit von adulten Drosophila melanogaster zu bewerten.

Bewertung der chemischen Toxizität bei adulten Drosophila melanogaster

Lernen Sie eine Hochdurchsatz-Triacylglycerid-Assay-Methode zur Induktion von Fettleibigkeit bei Drosophila melanogaster. Dieses Protokoll ermöglicht die schnelle Messung von Fettakkumulation für metabolische Forschung.

Fettreiche Ernährung Fütterung und Hochdurchsatz Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

Weitere Videos entdecken