Name: Horizontale Gel-Elektrophorese zur verbesserten Nachweis von Protein-RNA-Komplexen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 36 s
Description: Erfahren Sie die horizontale native Gel-Elektrophorese zur Analyse von RNA-Protein-Interaktionen in der RNA-Biochemie. Diese Methode ermöglicht die Echtzeitüberwachung von Komplexbildung während der Elektrophorese.

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Wir danken Laura Vanderploeg für die Vorbereitung von Figuren. Die Arbeit im Sheets Labor wird von NSF Grant 1050395 und NIH Grant (R21HD076828) unterstützt. Die Arbeit im Ryder Labor wird von NIH Stipendien R01GM117237 und R01GM117008 unterstützt. Megan Dowdle wird von einem SciMed GRS Advanced Opportunity Fellowship durch University of Wisconsin-Madison Graduate School und Biotechnology Trainingsprogramm durch das National Institute of General Medical Sciences der National Institutes of Health (T32GM008349) unterstützt.

1. Herstellung des horizontalen nativen Polyacrylamidgels 4 . <ol><li> Vorbereitung der benötigten Materialien. <ol><li> Für die horizontale Gel-Apparatur verwenden Sie eine Gel-Box (37 cm x 24 cm) mit einem 27 cm x 21 cm Tablett und eine Kapazität für zwei 24-Well-Kämme. Dieses Setup bietet insgesamt 48 Samples, die gleichzeitig analysiert werden können. </li><li> Bereiten Sie die folgenden Reagenzien vor: 40% Acrylamid-Bis 19: 1, 5x TBE (Tris-Borat-EDTA pH 8,0), TEMED und 10% APS (Ammoniumpersulfat). </li></ol></li><li> Erzeugung eines 10% nativen Acrylamidgels <ol><li> In einem 500 ml-Kolben werden 80 ml 5x TBE, 100 ml 40% Acrylamid und Wasser auf ein Endvolumen von 400 ml gegeben. </li><li> Fügen Sie 4 ml 10% APS und 400 μl TEMED hinzu. Gut mischen. </li><li> Gießen Sie die Mischung in die horizontale Gießschale und lassen Sie das Gel für 30 min zu polymerisieren. Das Gel wird etwa 2 cm dick. HINWEIS: Gele können in eine Dunstabzugshaube werfenUp-Polymerisation. Nach der Polymerisation bleibt eine dünne Flüssigkeitsschicht auf dem Gel. </li><li> Gießen Sie die Flüssigkeit aus und spülen Sie mit Laufpuffer. Entfernen Sie den Kamm (s) sorgfältig und spülen Sie die Brunnen mit Laufpuffer mit einer Spritze. </li></ol></li><li> Vorbereitung des laufenden Puffers <ol><li> Vorbereitung 2 L von 1x TBE Laufpuffer für die Gelbox. 400 ml 5XTBE mit 1600 ml verdünnen und mischen. Legen Sie 1x TBE Puffer in kalten Raum zu kühlen. </li></ol></li><li> Vorlauf des Gels <ol><li> Füge 2 L des kalten Laufpuffers zum Gelkasten hinzu und lege das Gel ein. </li><li> Vorbereiten des Gels bei 120 V für 1 h bei 4 ° C in einem kalten Raum. Während dieser Zeit die Bindungsreaktion vorbereiten. </li></ol></li></ol> 2. Bindungsreaktion 8 <ol><li> 2.1.Prepare die folgenden Reaktionskomponenten. 20 mM DTT 10 mM BSA 10 mM Hefe-tRNAs 5X Bindungspuffer (50 mM HEPES pH 8,0, 5 mM EDTA, 250 mM KCl, 0,2% Tween-20) 100 nM Fluorescein-markierte RNA, die kommerziell gekauft wurde Konzentriertes Bicaudal-C-Protein 50% Glycerin in DEPC-behandeltem H 2 O DEPC-behandeltes H 2 O </li><li> Montieren Sie die Bindungsreaktionskomponenten in einem RNase-freien Mikrozentrifugenröhrchen. <ol><li> Zu dem Röhrchen werden 5 &amp; mgr; l 10 mM BSA, 5 &amp; mgr; l 20 mM DTT, 5 &amp; mgr; l 10 mM Hefe-tRNAs, 10 &amp; mgr; l 5x Bindungspuffer gegeben. </li></ol></li><li> Füge Protein zu einer Endkonzentration von 250 nM in 50 μl hinzu. Füge Wasser zu einem Endvolumen von 45 μl hinzu. </li><li> Füge 5 μl fluoreszenzmarkiertes RNA-Substrat hinzu. Verwenden Sie ein handelsübliches 3&#39;-Fluorescein-markiertes 32-Nukleotidsubstrat. </li><li> Mischen und inkubieren im Dunkeln für 30 min bei Raumtemperatur. </li></ol> 3. Analyse der Proben auf dem nativen horizontalen Polyacrylamidgel <ol><li> Zu jeder Reaktion werden 15 μl 50% Glycerin gegeben und vorsichtig vermischt. </li><li> PflegeLly addieren 30 &amp; mgr; l jeder Reaktion auf das Gel. Die Menge der Probe, die in eine einzige Vertiefung geladen werden kann, variiert in Abhängigkeit von der Dicke des Gels und der Größe der Vertiefungen. Wir haben Volumina bis zu 15 μl und bis zu 45 μl in eine einzige Bohrung mit einem 24-Well-Kamm geladen und auf eine Dicke von 2 cm gegossen. </li><li> Nach dem Anschließen der Stromversorgung an die Gel-Gerät schalten Sie die Stromversorgung und stellen Sie die Spannung. Führen Sie das Gel in 4 ° C bei 120 V. HINWEIS: Für die horizontale Gel-Apparatur liegt damit etwa 5 V / cm. Für die vertikale Gelapparatur beträgt das 16 V / cm. <ol><li> Um eine Beschädigung oder Bleichung der fluoreszenzmarkierten RNA zu verhindern, führen Sie die Elektrophorese im Dunkeln durch. </li><li> Phary-Elektrophorese-Zeiten in Abhängigkeit von den Besonderheiten des zu analysierenden RNA-Protein-Komplexes. HINWEIS: Ein großer Vorteil der horizontalen EMSA-Analyse ist, dass die Elektrophorese gestoppt werden kann, das Gel abgebildet und dann die geL kann in den Apparat zurückgestellt werden und die Elektrophorese kann für längere Zeit fortgesetzt werden. </li></ol></li></ol> 4. Imaging der Gel <ol><li> Führen Sie die Analyse mit jedem Instrument für die Erkennung und Bildgebung fluoreszierende Substrate. </li><li> Lege das Gel auf den Imager. </li><li> Anpassungseinstellungen einstellen Für Fluorescein-markierte RNA-Liganden verwenden Sie folgende Einstellungen: FAM (Wellenlänge 473 nm), 750 Photovervielfacherspannung (PMT), 100 μm Pixelgröße. </li><li> Scannen Sie das Gel, um das Bild zu erfassen. </li></ol>

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<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bicaudal-C+spatially+controls+translation+of+vertebrate+maternal+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Bicaudal-C spatially controls translation of vertebrate maternal mRNAs.</a> RNA. 19 (11), 1575-1582 (2013).</li>
<li>Maisonneuve, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bicaudal+C%2C+a+novel+regulator+of+Dvl+signaling+abutting+RNA-processing+bodies%2C+controls+cilia+orientation+and+leftward+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Bicaudal C, a novel regulator of Dvl signaling abutting RNA-processing bodies, controls cilia orientation and leftward flow.</a> Development. 136 (17), 3019-3030 (2009).</li>
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<li>Foley, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platform+to+Enable+the+Pharmacological+Profiling+of+Small+Molecules+in+Gel-Based+Electrophoretic+Mobility+Shift+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">Platform to Enable the Pharmacological Profiling of Small Molecules in Gel-Based Electrophoretic Mobility Shift Assays.</a> J Biomol Screen. 21 (10), 1125-1131 (2016).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Native Polyacrylamidgele sind ein unschätzbares Hilfsmittel zur Untersuchung von Protein-RNA-Wechselwirkungen und traditionell werden diese Gele vertikal 2 , 3 elektrophoresiert. Wir haben eine Modifikation des Protokolls verwendet, das native Polyacrylamidgele ersetzt, die horizontal hergestellt und elektrophoresiert werden 1 , 4 , 6 , 7</s...

Elektrophoretische Mobilitätsverschiebungsassays (EMSAs) haben sich als ein unschätzbares biochemisches Instrument erwiesen, um spezifische Protein-Nukleinsäure-Wechselwirkungen 1 , 2 , 3 zu analysieren. Diese Assays können wichtige Informationen in Bezug auf die Bindungsaffinität von Proteinen an RNA oder DNA 3, die Komponente Stöchiometrie von Nukleinsäure-Protein - Komplexe 1 und liefern wichtige neue Erkenntnisse über die Bindungsspezifität der RNA - Bindeproteine via Substrat Kompetitionsexperimente 1. Der traditionelle experimentelle Aufbau für diese Assays besteht darin, gereinigtes Protein mit einem radioaktiv markierten RNA-Substrat zu mischen. Die resultierenden Komplexe werden dann mit nicht denaturierenden (nativen) Polyacrylamidgelen analysiert, die zwischen zwei Glasplatten gefolgt von einer Probenelektrophorese in einer vertikalen Vorrichtung 3 gegossen werden. Während dieser Ansatz erschöpfend genutzt wurde, um wichtige Einblicke in die biochemischen Mechanismen zu liefern, die der Bindung von Proteinen an Nukleinsäuren zugrunde liegen, hat sie auch mehrere Einschränkungen. Zum Beispiel hat diese Grundstrategie einen relativ geringen Durchsatz und ist für Anwendungen, die viele analoge Bindungsreaktionen parallel analysieren, nicht leicht anpassbar. Darüber hinaus ist es bei der traditionellen vertikalen Apparatur schwierig, die Komplexe während der Elektrophorese 3 , 4 mehrfach zu überwachen. Hier stellen wir eine Adaption des EMSA-Assays vor, der native Polyacrylamidgele verwendet, die in eine Flachbettapparatur, horizontale Elektrophorese und fluoreszenzmarkierte RNA-Substrate 4 , 5 , 6 , 7 gegossen werden. Die Einarbeitung dieser relativ einfachen Modifikationen an die Basis-StrTegy bietet einige mächtige Vorteile. Insbesondere das horizontale Flachbettformat eignet sich leicht zur gleichzeitigen Analyse von Dutzenden von Proben 4 . Auch für einige RNA-Proteinkomplexe, wie jene, die zwischen dem Bicaudal-C-Protein und seiner RNA-Substrat-Elektrophorese in einem horizontalen Gel gebildet werden, ergibt sich eine erhöhte Fähigkeit, unterschiedliche RNA-Protein-Komplexe aufzulösen und diese aus dem ungebundenen RNA-Substrat zu unterscheiden.

<table><tbody><tr><td>Horizontale Gelbox</td><td>OWL</td><td>N/A</td><td>Produkt wird nicht mehr hergestellt. Ähnliche Gelboxen finden Sie bei Thermo Scientific, Gelboxen der A-Serie. Katalognummer: A2-BP</td></tr><tr><td>24-Well große große große horizontale Gelelektrophoresekämme</td><td>OWL</td><td>N/A</td><td>Produkt wird nicht mehr hergestellt. Ähnliche Gelboxen finden Sie bei Thermo Scientific, Gelboxkämme der A-Serie. Katalognummer: A2-24C</td></tr><tr><td>Powerpac 300</td><td>Bio-Rad</td><td>1655050</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Protean II Elektrophoresezelle</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2940</td><td></td></tr><tr><td>InstaPAGE-19 40% 19:1 Acrylamid/Bis</td><td>IBI</td><td>IB70015</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>IBI</td><td>IB70120</td><td></td></tr><tr><td>APS</td><td>IBI</td><td>IB70080</td><td></td></tr><tr><td>Hefe-tRNAs</td><td>Ambion</td><td>AM7119</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescein markiert RNA</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td>Bestellung kann individuell auf Länge und gewünschte Sequenz zugeschnitten werden</td></tr><tr><td>EDTA Tetranatriumsalzhydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5391-1KG</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034-500G</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base Ultrapure</td><td>US Biological</td><td>T8600</td><td></td></tr><tr><td>Borsäure</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP168-500</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP366-1</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>DEPC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1609-47-8</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3483 12 3</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9048-46-8</td><td></td></tr></tbody></table>

horizontale gel-elektrophorese zur verbesserten nachweis von protein-rna-komplexen

Horizontal Gel Electrophoresis for Enhanced Detection of Protein-RNA Complexes

Die native Polyacrylamid-Gelelektrophorese ist ein grundlegendes Werkzeug der Molekularbiologie, das ausgiebig für die biochemische Analyse von RNA-Protein-Wechselwirkungen verwendet wurde. Diese Wechselwirkungen wurden traditionell mit Polyacrylamidgelen analysiert, die zwischen zwei Glasplatten und Proben hergestellt wurden, die vertikal elektrophoretisch wurden. Allerdings bieten Polyacrylamidgele, die in Tabletts gegossen und horizontal elektrophoresiert werden, mehrere Vorteile. Zum Beispiel können horizontale Gele, die verwendet werden, um Komplexe zwischen fluoreszierenden RNA-Substraten und spezifischen Proteinen zu analysieren, mehrfach abgebildet werden, wenn die Elektrophorese fortschreitet. Dies bietet die einzigartige Möglichkeit, RNA-Protein-Komplexe an mehreren Punkten während des Experiments zu überwachen. Darüber hinaus ermöglicht die horizontale Gelelektrophorese, mehrere Proben parallel zu analysieren. Dies erleichtert die zeitlichen Verlaufsexperimente und analysiert gleichzeitig mehrere Reaktionen, um verschiedene Komponenten und Bedingungen miteinander zu vergleichen. Hier sind wir prOvide ein detailliertes Protokoll zur Erzeugung und Verwendung von horizontalen nativen Gelelektrophorese zur Analyse von RNA-Protein-Wechselwirkungen.

Um die Leistungsfähigkeit und Vielseitigkeit der horizontalen nativen Gelelektrophorese zu demonstrieren, analysierten wir die Bindung des Xenopus Bicaudal-C (Bicc1) Proteins an eine fluoreszenzmarkierte RNA, die eine Bicc1-Bindungsstelle enthielt. Bicc1-Proteine ​​fungieren als mRNA-spezifische Translationsrepressoren zur Kontrolle der Zellschicksalentscheidungen während der mütterlichen Stadien der Tierentwicklung 9 , 10</su...

Native Polyacrylamid-Gelelektrophorese ist ein grundlegendes Instrument zur Analyse von RNA-Protein-Wechselwirkungen. Traditionell haben die meisten Experimente vertikale Gele verwendet. Jedoch bieten horizontale Gele mehrere Vorteile, wie die Möglichkeit, Komplexe während der Elektrophorese zu überwachen. Wir stellen ein detailliertes Protokoll für die Erzeugung und Verwendung von horizontalen nativen Gelelektrophorese zur Verfügung.

Horizontale Gel-Elektrophorese zur verbesserten Nachweis von Protein-RNA-Komplexen

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool of molecular biology that has been used extensively for the biochemical analysis of ...

Das Ziel dieses Protokolls besteht darin, RNA-Protein-Interaktionen mittels horizontaler nativer Gelelektrophorese zu analysieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen der RNA-Biochemie zu beantworten, beispielsweise die Charakterisierung spezifischer RNA-Protein-Wechselwirkungen zu klären. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass die Bildung von Komplexen mehrfach während der Elektrophorese verfolgt werden kann.Verwenden Sie für die horizontale Gelelektrophorese eine Gelelektrophoresekammer mit einem Gießbrett von 27 cm × 21 cm und einer Kapazität für zwei 24-Nuten-Kämme. Diese Anordnung ermöglicht die gleichzeitige Analyse von insgesamt 48 Proben. Bereiten Sie zwei Liter 1x TBE-Laufpuffer durch Verdünnen von 400 Milliliter 5x TBE mit 1.600 Milliliter Wasser und anschließendes Mischen vor.Stellen Sie den TBE-Puffer in den Kühlraum, um ihn abzukühlen. Bereiten Sie die folgenden Reagenzien gemäß Standardverfahren vor: 40 % Acrylamid am besten im Verhältnis 19:1, 5x TBE, TEMED und 10 % Ammoniumpersulfat. Um ein 10 % natives Acrylamidgel herzustellen, geben Sie die folgenden Bestandteile in einen 500-Milliliter-Kolben: 80 Milliliter 5x TBE, 100 Milliliter 40 % Acrylamid und Wasser bis zu einem Endvolumen von 400 Millilitern.Geben Sie vier Milliliter 10 %igen Ammoniumpersulfat und 400 Mikroliter TEMED hinzu und mischen Sie gründlich. Gießen Sie die Mischung in die horizontale Gießschale und lassen Sie das Gel 30 Minuten lang im Abzug polymerisieren. Das polymerisierte Gel wird etwa zwei Zentimeter dick sein, und eine dünne Flüssigkeitsschicht bleibt auf der Oberseite des Gels zurück.Legen Sie das Gel in die Gelform und bringen Sie es in den Kühlraum. Gießen Sie anschließend die Flüssigkeit ab und spülen Sie mit Laufpuffer. Entfernen Sie die Kämme vorsichtig, geben Sie zwei Liter kalten Laufpuffer in die Gelform und spülen Sie die Mulden anschließend mit einem Spritzenkolben mit Laufpuffer aus.Laufen Sie das Gel eine Stunde lang bei 120 Volt und vier Grad Celsius in einem Kühlschrank vor. Während das Gel vorgelaufen wird, bereiten Sie die Bindungsreaktionen vor. Geben Sie die folgenden Komponenten der Bindungsreaktion in der angegebenen Reihenfolge jeweils in ein RNA-freies Mikrozentrifugenröhrchen: fünf µL 10 mM BSA, fünf µL 20 mM DTT, fünf µL 10 mM Hefe-tRNAs, 10 µL 5x Bindungspuffer, Bicaudal-C-Protein auf eine Endkonzentration von 250 nM in 50 µL, DEPC-behandeltes Wasser auf ein Endvolumen von 45 µL und fünf µL fluoreszenzmarkierten RNA-Substrat.Schließen Sie die Röhrchen und mischen Sie vorsichtig durch leichtes Anflicken, zentrifugieren Sie die Röhrchen kurz und inkubieren Sie sie 30 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln. Wenn die Bindungsreaktionen abgeschlossen sind, geben Sie 15 Mikroliter 50 % Glycerin zu jeder Reaktion hinzu und mischen Sie vorsichtig. Laden Sie vorsichtig 30 Mikroliter jeder Reaktion in die Vertiefungen des Gels auf; die Menge an Probe, die in eine einzelne Vertiefung aufgetragen werden kann, variiert je nach Dicke des Gels und Größe der Vertiefungen.Die Stromversorgung des Gelelektrophoresegeräts einschalten, den Strom einschalten, die Spannung auf 120 Volt einstellen und das Gel bei vier Grad Celsius laufen lassen. Um eine Beschädigung oder Entfärbung der fluoreszenzmarkierten RNA zu vermeiden, muss die Elektrophorese im Dunkeln durchgeführt werden. Die Elektrophoresezeiten variieren je nach den spezifischen Eigenschaften des zu analysierenden RNA-Protein-Komplexes.Ein wesentlicher Vorteil der horizontalen Elektrophorese-Mobilitätsverschiebeanalyse besteht darin, dass die Elektrophorese im Gelbild vor Abschluss des Laufs angehalten werden kann. Führen Sie die Analyse mit jedem Gerät durch, das zur Detektion fluoreszierender Substrate geeignet ist. Passen Sie die Einstellungen des Bildanalysesystems an; für fluoreszenzmarkierte Liganden verwenden Sie die folgenden Einstellungen.Fluorescein-Wellenlänge von 473 Nanometern, Photomultiplier-Spannung von 750 Volt und Pixelgröße von 100 Mikrometern. Scannen Sie das Gel, um das Bild aufzunehmen. Nach der Aufnahme kann das Gel erneut in die Apparatur eingesetzt und die Elektrophorese über längere Zeiträume fortgesetzt werden.Die Bindung des Xenopus Bicaudal-C- oder Bicc1-Proteins an eine fluoreszenzmarkierte Cripto1-mRNA, die eine Bicc1-Bindungsstelle enthält, wurde mittels vertikaler und horizontaler nativer Gelelektrophorese analysiert. Als negativer Kontrollversuch wurde Bicc1 mit einer fluoreszenzmarkierten RNA aus CyclinB1-mRNA gemischt. Mit beiden Methoden war deutlich erkennbar, dass Bicc1 an die Cripto1-RNA bindet und einen spezifischen Komplex bildet. Die Bicc1-Cripto1-Komplexe waren jedoch deutlich klarer ausgeprägt, wenn sie mittels horizontalen Gels analysiert wurden, was ihre Detektion erleichterte und eine Unterscheidung von Protein-RNA-Komplexen gegenüber ungebundener RNA ermöglichte.Nach der Bildgebung wurde das Gel in die Gelelektrophoresevorrichtung zurückgebracht, weitere dreieinhalb Stunden lang elektrophoretisch aufgetrennt und erneut abgebildet. Wie hier gezeigt, hatten sich die Komplexe weiterbewegt und waren weiterhin leicht nachweisbar, was auf ihre Stabilität hinweist. Sobald die Technik beherrscht ist, kann sie in vier bis fünf Stunden durchgeführt werden, sofern sie ordnungsgemäß ausgeführt wird.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man RNA-Protein-Interaktionen mithilfe der horizontalen nativen Gelelektrophorese analysiert.

horizontal-gel-electrophoresis-for-enhanced-detection-protein-rna

Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Quelle: Stenum, T. S. et al. Quantifizierung der Häufigkeit und Ladungsniveaus von Transfer-RNAs in Escherichia coli. J. Vis. Exp. (2017)Dieses Video demonstriert den Einsatz von Gelelektrophorese und Northern Blotting, um die Ladeniveaus von Transfer-RNAs in E. coli zu erkennen und zu vergleichen, indem aminoacylierte und deacylierte Formen getrennt werden.

Gelelektrophorese und Northern Blotting zur Erkennung von tRNA-Ladewerten in E. coli

Dieses Video zeigt eine denaturierende Polyacrylamid-basierte Trenntechnik für Proteine. Diese Technik hilft bei der vorläufigen Identifizierung von Proteinen anhand ihres Molekulargewichts.

Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese für die Proteinanalyse: Eine Technik zur Trennung und Visualisierung von Proteinen auf der Grundlage des Molekulargewichts

In diesem Video demonstrieren wir eine zweidimensionale Gelelektrophorese-Methode, die einzelne Proteine aus einer komplexen Proteinmischung trennt, die aus Tumorgeweben des humanen nichtfunktionellen Hypophysenadenoms (NFPA) gewonnen wurde. Die Proteine werden in der ersten Dimension anhand ihrer elektrischen Ladung und in der zweiten Dimension anhand von Molekulargewichten weiter getrennt.

Zweidimensionale Polyacrylamid-Gelelektrophorese: eine Trenntechnik zur Analyse von Proteinen in komplexen Proteingemischen basierend auf Ladung und Molekulargewicht

In diesem Video demonstrieren wir den elektrophoretischen Mobilitätsverschiebungsassay zum Nachweis von Protein-DNA-Wechselwirkungen mit Infrarot-Fluoreszenz-markierten DNA-Sonden. Wenn das Protein an die DNA-Sonde bindet, bildet es einen großen Komplex, der langsam weiterwandert und als verschobene Bande auf dem Gel erscheint.

Elektrophoretischer Mobilitäts-Shift-Assay zum Nachweis von Transkriptionsfaktor-DNA-Komplexen

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur RNA / Protein-Interaktionen zu untersuchen. Elektrophoretische Mobilitäts-Shift-Assay (EMSA) auf der differentielle Migration RNA / Protein-Komplexe und freie RNA während nativer Gelelektrophorese. Durch Verwendung eines radioaktiv markierten RNA-Sonde kann RNA / Protein-Komplexe durch Autoradiographie visualisiert werden.

Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) für das Studium von RNA-Protein-Wechselwirkungen: Die IRE / IRP Beispiel

Wir beschreiben hier ein optimiertes Protokoll von fluoreszierenden elektrophoretische Mobilitäts-Shift-Assays (FEMSA) gereinigtes SOX-2-Proteine ​​zusammen mit Infrarot-Fluoreszenzfarbstoff-markierten DNA-Sonden als Fallstudie eine wichtige biologische Frage zu bekämpfen.

Ein optimiertes Protokoll für die elektrophoretische Mobilitäts-Shift-Assay unter Verwendung von Infrarot-Fluoreszenzfarbstoff-markierten Oligonukleotide

Wir berichten über die Protokolle für die Synthese und Reinigung von Peptid-Nukleinsäure (PNA) Oligomere Einbeziehung geändert Rückstände. Die biochemischen und biophysikalischen Methoden zur Charakterisierung der Anerkennung von RNA Maisonetten durch die modifizierte PNAs werden beschrieben.

Sequenz-spezifische und gezielte Anerkennung der Doppelstrang-RNA über Single-Stranded RNA durch chemisch modifiziert Peptid-Nukleinsäuren

Ein Protokoll zur metabolischen Profils von biologischen Proben mittels Kapillarelektrophorese-Massenspektrometrie eine sheathless poröse Spitze Interface-Design unter Verwendung vorgestellt.

Sheathless Kapillarelektrophorese-Massenspektrometrie zur metabolischen Profils von biologischen Proben

Dieser Artikel beschreibt ein einfaches und schnelles Protokoll zur Bewertung des oligomeren Zustands des Dynamin-ähnlichen GTPase MxA-Proteins aus Lysaten menschlicher Zellen unter Verwendung einer Kombination aus nicht-denaturierender PAGE und Western-Blot-Analyse.

Charakterisierung von Multi-Untereinheit Proteinkomplexe der Menschen MxA Verwendung von nicht-denaturierendes Polyacrylamidgel-Elektrophorese

Hier wird gezeigt, wie der in situ Proximity Ligation Assay (PLA) verwendet werden kann, um die direkten Protein-Protein-Wechselwirkungen zwischen ATM und p53 in Suspensionszellkulturen, die genotoxischen Stress ausgesetzt sind, zu detektieren und zu visualisieren.

Nachweis und Visualisierung von DNA-schadeninduzierten Proteinkomplexen in Suspensionszellkulturen unter Verwendung des Proximity Ligation Assays

Erfahren Sie die horizontale native Gel-Elektrophorese zur Analyse von RNA-Protein-Interaktionen in der RNA-Biochemie. Diese Methode ermöglicht die Echtzeitüberwachung von Komplexbildung während der Elektrophorese.

Horizontale Gel-Elektrophorese zur verbesserten Nachweis von Protein-RNA-Komplexen

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