Phasenverhalten von geladenen Vesikeln unter symmetrischen und asymmetrischen Lösungsbedingungen überwacht mit Fluoreszenz-Mikroskopie

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, den Einfluss der unter physiologischen Bedingungen gefundenen Umgebungen mit hohem Salzgehalt und der Asymmetrie der Transmembranlösung auf die Phasenzustände der Membran quantitativ zu bewerten. Lösungen innerhalb und außerhalb von Zellen sind sehr unterschiedlich. Unsere Methoden helfen dabei, den Einfluss der Lösungsasymmetrie auf die Membraneigenschaften und das Phasenverhalten zu verstehen.

Der Hauptvorteil unseres Ansatzes besteht darin, dass Vesikel unter physiologischen Pufferbedingungen präpariert werden können und das mikrofluidische Gerät zur Erzeugung asymmetrischer Pufferbedingungen verwendet werden kann. Um den Vorgang zu beginnen, rauen Sie eine Seite einer PTFE-Platte mit feinem Schleifpapier auf. Waschen Sie die Platte, ein 15-Milliliter-Glasfläschchen und einen verschließbaren Glasbehälter mit handelsüblichem Geschirrspülmittel, Ethanol und Chloroform.

Verwenden Sie eine 25-Mikroliter-Glasspritze, um 10 bis 15 Mikroliter Lipidmaterial in Chloroform auf die raue Seite der sauberen, trockenen PTFE-Platte abzugeben. Verteilen Sie das Lipidmaterial mit der Spritzennadel, um einen gleichmäßigen Lipidfilm zu erzeugen. Übertragen Sie die Platte mit einer Pinzette in das 15-Milliliter-Fläschchen.

Erhitzen Sie die Platte auf 60 Grad Celsius und trocknen Sie sie zwei Stunden lang, um das Lösungsmittel zu verdampfen. Geben Sie dann entionisiertes Wasser in einen Glasbehälter mit einer Höhe von etwa einem Zentimeter. Stellen Sie das Fläschchen mit der Platte in den Behälter, achten Sie darauf, dass es stabil und aufrecht bleibt, und verschließen Sie den Behälter.

Lassen Sie die Lipiddoppelschicht vier Stunden lang bei 60 Grad Celsius vorquellen. Nehmen Sie dann die Durchstechflasche aus dem Behälter. Ziehen Sie fünf Milliliter Quelllösung in eine Plastikspritze und befestigen Sie einen 0,45-Mikrometer-Filter an der Spritzenspitze.

Geben Sie die gefilterte Quelllösung in das Fläschchen, um den Lipidfilm mit Feuchtigkeit zu versorgen. Verschließen Sie das Fläschchen und verschließen Sie es mit einer Paraffinfolie aus Kunststoff. Lagern Sie das Fläschchen über Nacht bei 60 Grad Celsius, um das GUV-Aggregat zu erhalten.

Kühlen Sie die Vesikel innerhalb einer Stunde nach der Entnahme vom Herd auf Raumtemperatur ab. Schneiden Sie das Ende einer 200-Mikroliter-Mikropipettenspitze aus Kunststoff ab, damit das GUV-Aggregat in die Spitze gezogen werden kann. Verwenden Sie die getrimmte Pipettenspitze, um das Aggregat und 50 Mikroliter Quelllösung in ein sauberes, trockenes Zwei-Milliliter-Fläschchen zu geben.

Geben Sie 950 Mikroliter frische Quelllösung oder eine isotonische Lösung in die Durchstechflasche, um symmetrische bzw. asymmetrische Lösungsbedingungen zu erreichen. Pipettieren Sie die Mischung auf und ab und drehen Sie das Fläschchen dann mehrmals vorsichtig um, um die GUVs wieder zu suspendieren. Um mit der Beurteilung zu beginnen, legen Sie ein Aliquot der GUV-Suspension in einen Silikonisolator in einem Objektträger.

Verschließen Sie die Kammer mit einem Deckglas. Lassen Sie die Probe fünf Minuten lang wieder ins Gleichgewicht kommen. Legen Sie dann den Objektträger auf den Probentisch eines Fluoreszenzmikroskops und nehmen Sie Bilder von mindestens 30 GUVs pro Charge auf.

Untersuchen Sie die Bilder, um die Phasenzustände der Bild-GUVs zu bestimmen. GUVs in einem einzigen flüssigen Phasenzustand sind kugelförmig und glatt mit einer fluoreszierenden Markierung, die homogen in der Membran verteilt ist. GUVs in einem flüssig geordneten und ungeordneten zweiphasigen Zustand sind kugelförmig mit einer fluoreszierenden Markierung, die in Domänen mit glatten Grenzen innerhalb der Membran unterteilt ist.

Stellen Sie sicher, dass die Domänen frei auf den Vesikeloberflächen diffundieren können und verschmelzen können. GUVs in einem zweiphasigen oder dreiphasigen festen Flüssigphasenzustand werden mit einigen Winkelgrenzen abgerundet. Flüssige Domänen auf einem festen Hintergrund sollten keine Diffusion aufweisen, aber feste Domänen sollten auf einem flüssigen Hintergrund frei diffundieren.

Nachdem der Phasenzustand jedes Bild-GUV identifiziert wurde, bestimmen Sie den dominanten Phasenzustand für den Stapel. Wiederholen Sie den Vorgang mit unabhängigen Stichproben, wenn der dominante Phasenzustand eine knappe Mehrheit ist. Bereiten Sie vor der Verwendung des mikrofluidischen Geräts jeweils mindestens fünf Milliliter Saccharose- und Salzquelllösungen vor.

Filtrieren Sie jede Lösung durch einen 0,45-Mikrometer-Filter. Schneiden Sie als Nächstes die Enden der 200-Mikroliter-Pipettenspitzen aus Kunststoff ab und platzieren Sie eine Pipettenspitze in jedem Kanal des Geräts. Geben Sie in das Gerätereservoir 100 Mikroliter frische gefilterte Quelllösung des gleichen Typs, der zur Herstellung der GUVs verwendet wird.

Geben Sie fünf Mikroliter der Quelllösung in jede Pipettenspitze. Zentrifugieren Sie das Gerät 10 Minuten lang bei 900 mal G, um die Gerätekanäle zu füllen. Füllen Sie dann eine Ein-Milliliter-Glasspritze mit der gleichen gefilterten Quelllösung.

Verbinden Sie ein Stück Schlauch mit der Spritze. Schieben Sie die Quelllösung durch den Schlauch, bis der Kolben vollständig gedrückt und der Schlauch mit Lösung gefüllt ist. Verbinden Sie dann den Schlauch mit dem Auslasskanal und montieren Sie die Spritze auf eine Spritzenpumpe.

Verbinden Sie anschließend das Drucksteuergerät mit den mikrofluidischen Kanaleinlässen. Stellen Sie sicher, dass die Ventile geschlossen sind, und stellen Sie dann den Druck auf drei bar ein. Platzieren Sie das mikrofluidische Gerät auf dem Probentisch eines inversen konfokalen Mikroskops.

Entfernen Sie mit einer Pipette die Quelllösung aus dem Gerätereservoir, bis nur noch 25 bis 50 Mikroliter Lösung übrig sind. Geben Sie 150 Mikroliter der GUV-Suspension in das Reservoir und mischen Sie die Suspension durch sanftes Pipettieren. Lassen Sie die Spritzenpumpe 20 Minuten lang im Entnahmemodus mit 10 Mikrolitern pro Minute laufen oder bis mehr als 90 % der Gerätefallen belegt sind.

Öffnen Sie dann die Ventile der Druckregeleinheit, um die Ringventile im mikrofluidischen Gerät zu schließen. Stoppen Sie die Spritzenpumpe und lassen Sie das Gerät eine Stunde lang ruhen, bevor Sie konfokale Bilder der GUVs im Gerät aufnehmen. Verwenden Sie anschließend eine Pipette, um die GUV-Suspension aus dem Reservoir zu entfernen, sodass nur 25 bis 50 Mikroliter übrig bleiben.

Geben Sie 150 Mikroliter der anderen Art von filtrierter Quelllösung in das Reservoir und pipettieren Sie die Mischung vorsichtig auf und ab. Wiederholen Sie diesen Vorgang mindestens fünfmal, um die Lösung vollständig in das Reservoir zu versetzen. Lassen Sie die Spritzenpumpe 10 Minuten lang im Entnahmemodus mit 10 Mikrolitern pro Minute laufen, um die Lösung in den Mikrokanälen zu ersetzen.

Verringern Sie dann die Durchflussrate auf einen Mikroliter pro Minute. Schließen Sie die Ventile der Druckregeleinheit für zwei Sekunden, öffnen Sie dann die Ventile und stoppen Sie die Spritzenpumpe. Lassen Sie das Gerät eine Stunde lang ruhen, bevor Sie konfokale Bilder aufnehmen.

Um mit der Vorbereitung der Temperierkammer zu beginnen, befestigen Sie zunächst Stachelrohrverschraubungen an einer Aluminium-Wärmeflussbaugruppe mit zwei Millimeter dicken Deckglasfenstern. Befestigen Sie einen Gummiabstandshalter an einem der Deckgläser, um die Beobachtungskammer zu bilden. Laden Sie 100 Mikroliter der GUV-Suspension in die Beobachtungskammer und verschließen Sie die Kammer mit einem Deckglas.

Drehen Sie die Baugruppe langsam um. Verbinden Sie die Aluminiumkammer mit einem externen Wasserbad. Montieren Sie die Baugruppe auf einem Mikroskop-Probentisch.

Stellen Sie das externe Wasserbad auf die niedrigste gewünschte Temperatur ein und lassen Sie das System 10 bis 15 Minuten lang ausgleichen. Erfassen Sie Bilder der GUVs und bestimmen Sie die Phasenzustände bei verschiedenen Temperaturen. GUVs wurden aus unterschiedlichen Verhältnissen von DOPG und Ei, Sphingomyelin und Cholesterin in symmetrischen Saccharose- oder Salzlösungen hergestellt.

Ihre dominanten Phasenzustände wurden durch Fluoreszenzmikroskopie bestimmt. Ausgewählte Zusammensetzungen wurden dann durch Verdünnung in asymmetrische Bedingungen überführt, um die effektiven Lösungsbedingungen auf das Phasenverhalten zu bewerten. Um das GUV-Phasenverhalten in asymmetrischen Lösungen weiter zu untersuchen, wurden GUVs in einer mikrofluidischen Vorrichtung gefangen, um einen vollständigen Austausch der externen Lösung zu ermöglichen.

Die gefangenen GUVs wurden vor und nach dem fluidischen Austausch konfokalmikroskopisch untersucht. Der Anteil von homogenen bis phasengetrennten GUVs wurde über einen Temperaturbereich überwacht, um die effektive Temperatur auf das Verhalten der GUV-Phase zu bewerten. In den Daten wurde ein sigmoidales Muster beobachtet, die dann an ein Boltzmann-Modell angepasst wurden.

Die Temperatur, bei der der Anteil der phasengetrennten GUVs 0,5 betrug, wurde aus der angepassten Kurve bestimmt. Obwohl diese Methoden Einblicke in das Verhalten der Membranphase geben können, können die Anwendungen auch für andere Experimente verwendet werden, z. B. um die Wechselwirkungen zwischen Membranen in Biomolekülen unter physiologischen Bedingungen zu untersuchen.