Keim Urzelle Transplantation für CRISPR/Cas9-basierte in Xenopus überspringen

Das übergeordnete Ziel des Leapfrogging besteht darin, die Erzeugung von Mutantenlinien für Gene zu erleichtern, die für die Embryogenese essentiell sind. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in der Entwicklungsbiologie und anderen Fachgebieten zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass man Mutanten in essentiellen Genen bereits in der F1-Generation erhalten kann.

Um dieses Verfahren zu beginnen, mikroinjizieren Sie Xenopus-Embryonen im Ein-Zell-Stadium mit Cas9-sgRNA-Komplexen, wie im Textprotokoll beschrieben. Wenn die Embryonen 4,5 Stunden nach der Befruchtung das frühe Blastula-Stadium neun erreicht haben, nehmen Sie sie aus dem Inkubator bei 25 °C heraus, damit sie sich bei Raumtemperatur weiterentwickeln können. Um die Transplantation fünf Stunden nach der Befruchtung zu beginnen, übertragen Sie mit einer Pasteurpipette einen nicht injizierten Embryo in eine 60 mm Agarose-Schale mit Vertiefungen, die als Empfänger für die Transplantation dient.

Übertragen Sie außerdem ein PGC-Donorembryo in die Schale. Entfernen Sie mit einer Pinzette manuell die Vitellinhüllen von jedem Embryo. Drehen Sie beide Embryonen so, dass ihre vegetativen Pole sichtbar und für die Operation zugänglich sind.

Danach, während man das Empfängerembryo mit der Haarschleife stabilisiert, die scharfe Spitze eines Augenbrauenhaarmessers in den vegetativen Pol einführen, direkt unterhalb der Oberfläche. Und mit schnellen, aufwärts gerichteten Schnittbewegungen vier flache Einschnitte in Form eines Quadrats innerhalb der Zone vornehmen, in der sich zukünftig die Flaschenzellen bilden werden, die den Blastoporus markieren. Sobald die vier Seiten des Quadrats abgegrenzt sind, das Augenbrauenhaarmesser verwenden, um jeden Einschnitt mit ähnlichen Schneidbewegungen auf eine Tiefe von etwa einem Drittel bis zur Hälfte der Distanz zum Boden des Blastocoels zu vertiefen.

Lösen Sie das vegetative Gewebestück vom Empfängerembryo, indem Sie einen oder mehrere horizontale Schnitte im tieferen vegetativen Bereich durchführen. Wiederholen Sie diesen Vorgang anschließend zügig am PGC-Donorembr yo, um ein ähnlich großes vegetatives Gewebestück zur Transplantation zu gewinnen. Sobald das Gewebe mit den PGCs aus dem Donorembr yo entfernt wurde, positionieren Sie das Gewebestück mithilfe des Augenbrauenhärchenmessers und der Haarschleife in der Öffnung des Empfängerembryos.

Verwenden Sie den Schaft des Augenbrauenhaarmessers, der parallel zur Oberfläche des Transplantats gehalten wird, um das Transplantat vorsichtig in die Öffnung an der vegetativen Oberfläche des Empfängerembryos zu drücken. Benutzen Sie die Haarschleife, um den Kadaver des Spenderembryos sanft über die Agaroseoberfläche und in eine Vertiefung zu schieben. Stellen Sie sicher, dass die offene Wunde des Kadavers in Richtung der flüssigen Phase zeigt.

Schieben Sie das Empfänger-Embryo in eine benachbarte Mulde, und stellen Sie ebenfalls sicher, dass das transplantierte vegetative Pol-Gewebe der Hauptflüssigkeitsmenge zugewandt ist. Wiederholen Sie die Transplantation von PGCs mit zusätzlichen Embryonen, um weitere Transplantat-Kadaver-Paare zu erzeugen, bis die Embryonen etwa das frühe Gastrula-Stadium 10 erreicht haben, wobei die Embryonen bei jeder Transplantation in leere Mulden überführt werden. Sobald die Transplantate sich normalerweise 30 bis 45 Minuten nach der Transplantation an ihrer Position verheilt haben, überführen Sie die Embryonen mit einer Pasteur-Pipette sehr vorsichtig aus den Mulden in einzelne Vertiefungen einer mit Agarose beschichteten 24-Loch-Platte.

Drehen Sie die Embryonen so, dass sie mit dem vegetativen Pol nach oben liegen und der Massenlösung zugewandt sind. Stellen Sie die Spender-Kadaver und die Empfänger für die Transplantation in benachbarte Vertiefungen, um die Zuordnung der Embryopaare zu erleichtern, und dokumentieren Sie diese Information. Danach überführen Sie die 24-Loch-Platte mit den Embryonen über Nacht in einen 25 °C warmen Inkubator.

Am nächsten Tag wird jeder Transplantationsempfänger, der sich nun im Stadium der frühen Schwanzanlage befindet, in eine einzelne Vertiefung einer frischen, mit Agarose beschichteten 6-Loch-Platte umgesetzt. Die übersprungenen Embryonen werden weiterkultiviert, und die Analyse der vom Spender stammenden DNA aus den Körperresten erfolgt gemäß dem schriftlichen Protokoll. Da das Überspringen von Generationen (Leapfrogging) Tiere hervorbringt, deren Keimbahn effizient durch mutierte Allele ersetzt wurde, können mutierte Phänotypen bereits in der F1-Generation erhalten werden.

Wie in dieser Tabelle dargestellt, berichteten Blitz et al., dass die Mehrheit der F0-Tiere, die am Tyrosinase-Lokus gezielt wurden, der für die Melanozyten- und Netzhautpigmentierung erforderlich ist, eine 100 %ige Keimbahnübertragung von spendenderseits stammenden mutierten Genomen aufweist, gemessen durch Kreuzungen mit tyr-defizienten albino-Tieren. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man urzeitliche Keimzellen von Xenopus transplantiert.