Keim Urzelle Transplantation für CRISPR/Cas9-basierte in Xenopus überspringen

Das übergeordnete Ziel des Leapfrogging ist es, die Schaffung von Mutantenlinien für Gene zu erleichtern, die für die Embryogenese essentiell sind. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen in der Entwicklungsgenetik und anderen Bereichen zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass man Mutanten in essentiellen Genen in der F1-Generation erhalten kann.

Um dieses Verfahren zu beginnen, injizieren Sie Xenopus-Embryonen in einem Zellstadium mit Cas9-sgRNA-Komplexen, wie im Textprotokoll beschrieben. Wenn die Embryonen 4,5 Stunden nach der Befruchtung erreicht sind, im frühen Blastulastadium neun, nehmen Sie sie aus dem 25 Grad Celsius heißen Inkubator, damit sie ihre Entwicklung bei Raumtemperatur fortsetzen können. Um die Transplantation fünf Stunden nach der Befruchtung zu beginnen, verwenden Sie eine Pasteurpipette, um einen nicht injizierten Embryo in eine 60-Millimeter-Agaroseschale mit Vertiefungen zu übertragen, die als Empfängerin des Transplantats dient.

Übertragen Sie auch einen PGC-Spenderembryo in die Schale. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Vitellinhüllen manuell von jedem Embryo zu entfernen. Und drehen Sie beide Embryonen so, dass ihre pflanzlichen Pole sichtbar und für die Operation zugänglich sind.

Während Sie den Empfängerembryo mit der Haarschlaufe stabilisieren, führen Sie dann die scharfe Spitze eines Augenbrauenhaarmessers in den Pflanzenstab ein, direkt unter der Oberfläche. Und mit schnellen, aufwärts gerichteten Schnittbewegungen machen Sie vier flache Schnitte in Form eines Quadrats innerhalb der Zone, in der sich zukünftige Flaschenzellen bilden werden, die die Blastopore markieren. Sobald die vier Seiten des Quadrats abgegrenzt sind, verwenden Sie das Augenbrauenhaarmesser, um jeden Schnitt mit ähnlichen Schnittbewegungen bis zu einer Tiefe von etwa 1/3 bis 1/2 des Abstands zum Blastocoel-Boden zu vertiefen.

Befreien Sie das Explantat aus pflanzlichem Gewebe vom Empfängerembryo, indem Sie einen oder mehrere horizontale Schnitte in der tiefen vegetativen Region vornehmen. Wiederholen Sie dann diesen Vorgang schnell am PGC-Spenderembryo, um ein ähnlich großes pflanzliches Gewebefragment für die Transplantation zu erzeugen. Sobald das PGC-haltige Gewebe aus dem Spenderembryo entfernt wurde, verwenden Sie das Augenbrauenhaarmesser und die Haarschlaufe, um das Explantat in der Öffnung zu positionieren, die im Empfängerembryo entstanden ist.

Drücken Sie das Transplantat mit dem Schaft des Augenbrauenmessers, der parallel zur Oberfläche des Transplantats gehalten wird, vorsichtig in die Öffnung in der pflanzlichen Oberfläche des Empfängerembryos. Schieben Sie den Kadaver des Spenderembryos vorsichtig mit der Haarschlaufe über die Agaroseoberfläche in eine Vertiefung. Es ist darauf zu achten, dass die offene Wunde des Schlachtkörpers der Flüssigkeit zugewandt ist.

Schieben Sie den Empfängerembryo in eine benachbarte Vertiefung und stellen Sie ebenfalls sicher, dass das transplantierte Pflanzenpolgewebe der Massenflüssigkeit zugewandt ist. Wiederholen Sie die Transplantation von PGCs mit zusätzlichen Embryonen, um weitere Transplantatkadaverpaare zu erzeugen, bis die Embryonen ungefähr das frühe Gastrula-Stadium 10 erreichen, und übertragen Sie die Embryonen in leere Vertiefungen, während die Transplantationen durchgeführt werden. Sobald die Transplantate an Ort und Stelle verheilt sind, in der Regel 30 bis 45 Minuten nach der Transplantation, verwenden Sie eine Pasteurpipette, um die Embryonen sehr vorsichtig aus den Vertiefungen in einzelne Vertiefungen in einer mit Agarose beschichteten 24-Well-Platte zu übertragen.

Drehen Sie die Embryonen so, dass sie mit der Pflanzenstange nach oben und der Bulk-Lösung zugewandt sind. Platzieren Sie die Spenderkadaver und Transplantatempfänger in benachbarten Vertiefungen, um den Überblick über die Embryopaare zu behalten und diese Informationen aufzuzeichnen. Übertragen Sie dann die 24-Well-Platte mit den Embryonen über Nacht in einen 25 Grad Celsius heißen Inkubator.

Am nächsten Tag bringen Sie jeden Transplantatempfänger, der sich jetzt im frühen Schwanzknospenstadium befindet, in eine einzelne Vertiefung einer frischen, mit Agarose beschichteten Platte mit sechs Vertiefungen. Aufziehen der übersprungenen Embryonen und Analyse der aus den Schlachtkörpern gewonnenen Spender-DNA gemäß dem Textprotokoll. Da Leapfrogging Tiere hervorbringt, die ihre Keimbahn effizient durch mutierte Allele ersetzen können, können mutierte Phänotypen in der F1-Generation erhalten werden.

Wie in dieser Tabelle dargestellt, berichteten Blitz et al., dass eine Mehrheit der F0-Tiere, die auf den Tyrosinase-Locus abzielen, der für die Melanozyten- und Netzhaut-Piementation erforderlich ist, eine 100%ige Keimbahnübertragung von von Spendern abgeleiteten mutierten Genomen aufweisen, gemessen durch Auskreuzung mit Tyr minus Albino-Tieren. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Xenopus-Urkeimzellen transplantiert.